CC BY
28
УДК 612. 014. 42:612. 31:591. 413. 2
Король Т.В.1, кандидат бюлопчних наук @ Манько В.В.2, доктор бюлопчних наук, доцент Клевець М.Ю.2, доктор бюлопчних наук, професор
'Льегеський нацюнальний ушеерситет еетеринарног медицины та б1отехнологт ¡мет С.З. Гжицького 2Льегеський нацюнальний ушеерситет гменг 1еана Франка
СА2+ ТРАНСПОРТУВАЛЬН1 системи екзокринних СЕКРЕТОРНИХ КЛ1ТИН СЛИННИХ ЗАЛОЗ ЛИЧИНКИ
сшяокомт рьимоБШ ь
У робот1 проведено дослгдження систем активного I пасиеного транспорту Са2+ е екзокринних секреторних клтинах слинног залози личинки Chironomus рЫшоът Ь. Отримано функщональш тдтеердження наяеност1 потенщалозалежних Ca2+-каналiе у плазматичтй мембран (ПМ) цих клтин та гх ролi у секретортй актиеностi залоз. Вияелено, що хлорпромазин пригтчуеае пасиений транспорт Са2+ у залозистi клтини. Через ПМ до^джуеаних клтин еияелено також Ша+-залежне еиеедення Са2+ у позаклтинне середоеище. Показано роль комплексу кальцт-кальмодулш (Са2+-КМ) у функщонуеанш системи Ка+-Са2+-обмту у фiзiологiчних умоеах. Доеедено наяетсть системи переинно-актиеного транспорту Са2+ у секреторних клтинах до^джуеаних залоз та естаноелено оптимальш концентрацИ' АТФ та Са2+ для Са2+,М^+-АТФазног акmиеносmi. Вияелено функцюнуеання Са2+-унтортера мтохондрш, а також рiанодинчуmлиеих та 1Фз-чутлиеих Ca2+-каналiе у мембранах енутршньоклтинних кальщееих депо.
Ключовi слова: потенщалозалежн Са2+-канали, Ка+-Са2+-обмтник, Са2+,М^+-АТФаза, рiанодинчуmлиеi Са2+-канали, IФз-чуmлиеi Са2+-канали, Са2+-унтортер.
Вступ. Одшею з важливих проблем сучасно! фiзюлоril е дослщження мембранних систем транспортування катюшв Са2+, за участю яких здшснюеться регулящя процеав, у тому чи^ i секреци. Тривалий час систему кальщево! регуляци кл^инних процеав дослщжували у нейронах, гладкомязових клтинах та кардюмюцитах [6, 7, 8], а секреторш клтини, зокрема активащя катюнами Са2+ секреторного процесу загалом та його завершального етапу - екзоцитозу, вивчеш значно менше. Знання складно! та координовано! взаемоди систем пасивного i активного транспорту Са2+ на рiвнi ПМ i ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) секреторних клiтин мае фундаментальне значення для розумiння механiзмiв активаци секрецп та И припинення. На сьогодш грунтовно дослiджено Са2+-транспортувальш системи у секреторних клпинах багатоклiтинних залоз ссавщв, таких як великi слинш [14] та пiдшлункова [15, 16]. Цжавим та зручним об'ектом для дослщження !х
® Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю., 2008
103
функцюнування е малокл^инш залози, зокрема слинш залози двокрилих. Це спонукало нас провести комплексне дослiдження Са2 -транспортувальних систем екзокринних секреторних кл^ин на прикладi слинних залоз личинки комара - дергуна (Chironomus plumosus L.) у зв'язку з ix секреторною дiяльнiстю. Наведеш у статтi вiдомостi та результати дослщжень можуть бути використанi для розробки фармаколопчних методiв корекци секрецп травних залоз людини i тварин, а тому мають значення для медицини та ветеринара. Крiм того, отримаш данi можуть бути використаш для розроблення методiв боротьби iз шкiдливими комахами, у зв'язку з чим вони мають важливе значення i для гiгiени та саштари.
Матер1ал i методи. Дослiдження проводили на iзольованиx малоклiтинниx (32-48 кл^ин) слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. Максимальних розмiрiв слиннi залози досягають перед перетворенням личинки у лялечку i становлять 2 мм в довжину i 0,8 мм в ширину. Про функцюнальний стан Са2 -транспортувальних систем клiтин дослiджуваниx залоз судили на пiдставi змiн сумарного та мембранозвязаного вмiсту Ca2+ у тканиш та рiвня секрецп загального бiлка.
Базовий зовнiшньоклiтинний розчин мютив (ммоль/л): NaCl - 136,90; KCl - 5,36; CaCl2 - 1,76; MgCb - 0,49; Na2HPO4 - 0,35; KH2PO4 - 0,44;глюкоза -5,55; pH 7,2. Його використовували для дослiдження змiн вмiсту Ca2+ у тканинi залоз та секрецп загального бшка у базальних умовах. Потенщалозалежш Ca2+-канали активували гiперкалiевою деполяризацiею мембрани, збiльшуючи концентрацiю KCl у базовому зовшшньокл^инному розчиннi до 40 ммоль/л. У дослщженнях використовували блокатори цих каналiв: верапамiл (0,1 ммоль/л), дилиазем (0,1 ммоль/л), шфедишн (0,1 ммоль/л) та LaCl3 (0,1 ммоль/л). Для активiзацii Na+-Ca2+-обмiну у прямому режимi збiльшували [№]з до 180 ммоль/л, а у зворотному - зменшували [№]з до 35 ммоль/л, замшюючи 101,90 ммоль/л NaCl у базовому розчиш на е^молярну концентрацiю трис-Cl. Для дослiдження впливу хлорпромазину на стимульованi гiперкалiевим та гiпернатрiевим розчинами змiни вмiсту Ca2+ у тканинi залоз та секрецп загального бшка його додавали у концентращях 5, 20, 50 i 100 мкмоль/л до гiперкалiевого та у концентраци 100 мкмоль/л - до гiпернатрiевого середовищ шкубацп. Для активаци вивiльнення Ca2+ з ЕПР використовували кофе'н у концентрацiяx 1, 2, 4, 8, 10 та 15 ммоль/л. З метою щентиф^вання рiанодинчутливиx Ca2+-каналiв у внутрiшньоклiтинниx мембранах дослщжуваного об'екта використовували рiанодин (5 i 500 нмоль/л), а 1Фз-чутливих Ca2+-каналiв - iнозитол-1,4,5- трифосфат у концентраци 10 мкмоль/л та блокатор 1Ф3-чутливих Ca2+-каналiв гепарин (500 мкг/мл).
Середовище шкубацп для визначення загально' АТФазно' активностi тканини слинних залоз мютило (ммоль/л): NaCL - 16,0; KCl - 130,14; CaCl2 -0,10; MgCl2 - 5,0; трис-АТФ - 5,0; глюкоза - 5,55; pH 7,0.
Вмют Ca2+ у тканинi залоз визначали з використанням арсеназо III i виражали у наномолях на залозу; вмют загального бiлка у середовищi шкубацп визначали за методом Лоурi (Lowry et al., 1951) i виражали у % вщ сумарного
104
вмюту бшка у гомогенат залоз та середовищi шкубацп; визначення вмшту мембранозвязаного Ca2+ проводили на основi вимiрювання штенсивност флуоресценцiï комплексу Ca2+-хлортетрациклiн (Са2+-ХТЦ) за допомогою цитофлуориметра ЛЮМАМ-Р-З (Росiя) при збшьшенш 10x7 з дiаметром щшини 0,5 мм й iнтерференцiйним фшьтром À,max = 541±2нм; АТФазну актившсть виражали у мiкромолях неорганiчного фосфату на мЫграм бiлка за 30 хвилин (мкмоль Рн/мг бшка за 30 хвилин).
Цифровi результати уах вимiрювань пiддавали варiацiйно-статистичнiй обробцi за Стьюдентом. Опрацювання результатiв здiйснювали з використанням програмного пакету Microsoft Excel.
Результати дослщження. У ходi дослщжень виявилось, що пiдвищення [К ]з до 10, 20, 40, 80 i 100 ммоль/л викликае концентрацшнозалежне збшьшення вмiсту Ca2+ у тканинi слинних залоз в середньому у 1,7 - 2,8 рази (Р<0,05) та збшьшення вмюту загального бшка у середовищi шкубацп, що свщчить на користь факту надходження Ca2+ у кл^ини через потенцiалозалежнi Са2-канали. Стимульоване гiперкалiевим середовищем збiльшення вмiсту Ca2+ у тканинi залоз залежало вщ [Ca2+]з. Доказом потенцiалозалежного надходження Ca2+ у дослiджуванi клiтини е експериментальш данi, одержанi при додаваннi до гiперкалiевого середовища верапамiлу, нiфедипiну, дилиазему та LaCl3. У всiх випадках спостерiгалося пригнiчення стимульованого входу Ca2+ у клiтини залоз та секрецп загального бшка [2]. Пщ впливом La3+ К+ -стимульоване збiльшення вмiсту Ca у тканинi залоз пригнiчувалося з константою шпбування К0,5=70 мкмоль/л. Значення коефщента Хiлла (n=0,47) свiдчить про можливу наявнiсть негативноï кооперативностi i е наслщком, мабуть, того, що La3+ пригнiчуе не лише Ca2-транспортувальнi системи, якi забезпечують вхщний потiк Ca2+, але i системи вихiдного потоку [5]. Крiм того, К -стимульоване збшьшення вмшту Ca2+ у тканинi залоз пригшчуеться верапамiлом (на 58,82%; Р<0,01, n=6), дилтiаземом (на 64,50%; Р<0,05, n=6) та нiфедипiном (на 62,02%; Р<0,05, n=6). Цi данi узгоджуються з результатами вимiрювання змiн вмшту мембранозвязаного Ca2+ пiд впливом блокаторiв потенцiалозалежних Ca2+-каналiв на фонi гiперкалiевоï деполяризацiï мембрани. Виявлено, що стимулящя гiперкалiевим розчином змiни iнтенсивностi флуоресценцп Ca^-ХТЦ комплексу у контролi збшьшувалася у 3,68 разiв, у присутност дилтiазему - лише у 1,96 рази, а тд впливом шфедитну практично повнiстю пригнiчувалося стимульоване гiперкалiевим розчином збiльшення вмiсту мембранозвязаного Ca2+ у дослiджуваних клiтинах [9].
Для виявлення особливостей регуляцп кальмодулiном функцюнування Ca2+-транспортувальних систем ПМ до гiперкалiевого середовища iнкубацiï (40 ммоль/л) додавали блокатор кальмодул^ хлорпромазин у концентращях 5, 20, 50 i 100 мкмоль/л. З'ясувалося, що за таких умов стимулящя гiперкалiевим розчином збшьшення вмюту Ca2+ у тканинi залоз була меншою приблизно у 1,2 - 1,7 рази, а змша секрецп загального бшка виявила тенденщю до зменшення.
105
Ц даш свщчать про ефективне пригшчення хлорпромазином пасивного транспорту Са2+ у секреторних клпинах дослiджуваних залоз.
Ще однiею системою транспортування Са2+, локалiзованою у ПМ клiтин, е №+-Са2+-обмшник, наявнiсть якого у секреторних кл^инах дослiджуваних залоз доведена з використанням електрофiзiологiчних методiв на основi збшьшення вмiсту Са2+ у тканинi залоз i секреци загального бiлка у гшона^евих умовах [13] та при його активаци у прямому режимi в умовах гiпернатрiевих середовищ. 1нтенсивне зменшення вмiсту Са2+ у тканиш залоз (у 2,28 рази, Р<0,01) та секреци загального бiлка (у 1,21 рази, Р<0,05) виявилося максимальним при [№+]з = 180 ммоль/л. Це свщчить про ефективне за таких умов (пД^а>Др,са) виведення обмшником Са2+ iз секреторних клiтин проти його електрохiмiчного градiента. Очевидно, що у фiзiологiчних умовах робота системи Na+-Ca2+-обмiну у прямому режимi стимулюеться комплексом Са2-кальмодулiн. До такого висновку ми прийшли пiсля аналiзу змiн вмiсту Са2+ у тканиш залоз та секреци загального бшка за умов додавання до гiпернатрiевого розчину хлорпромазину у концентраци 100 мкмоль/л. При цьому обидва показники зменшувалися, що свщчить про пригшчення ним функцюнування обмшника у прямому режима
Системою, яка також забезпечуе активне виведення Са2+ у позакштинне середовище, е Са2+-помпа ПМ. На це опосередковано вказуе збшьшення ампл^ди струму —Ca2+-обмiну пщ впливом блокаторiв в Ca2+,Mg2+-АТФази еозину Y та ортованадату [13], а прямi пiдтвердження И наявност у секреторних клiтинах дослiджуваних залоз одержали, використовуючи метод визначення Ca2+,Mg2+-АТФазноl активной клiтинних мембран [3]. Як виявилося, кл^инш мембрани слинних залоз личинки ^копот^ plumosus L. характеризуються Ca2+,Mg2+-АТФазною, Mg2+-АТФазною та
строфантинчутливою №,К+-АТФазною активностями.
При виявленш залежностi активностi Ca2+,Mg2+-АТФази клiтинних мембран дослiджуваних залоз вщ концентраци АТФ у середовищi шкубаци з'ясувалося, що вона е найвищою за наявност 5 ммоль/л АТФ у середовищi шкубаци. Залежнiсть Mg2+-АТФазноl та №+,К+-АТФазно! активностi мала дещо iнший характер, що е свщченням того факту, що клiтиннi мембрани характеризуються рiзною iнтенсивнiстю протiкання ферментативного гiдролiзу АТФ. Як показали дослщження залежностi мiж Ca2+,Mg2+-АТФазною активнiстю i вмiстом Ca2+ у середовищi шкубаци, максимальний ефект спостерiгався при 0,1 ммоль/л Ca2+ у середовищi шкубаци (3,90±0,13 мкмоль Рн/мг бiлка за 30 хв). Вищi концентраци Ca2+ пригнiчували Ca2+,Mg2+-АТФазну активнiсть тканини слинних залоз.
Нами показано, що Ca2+,Mg2+-АТФазна активнiсть повнiстю пригшчувалася (Р<0,01, п = 6) пщ впливом еозину Y (10мкмоль/л) та суттево зменшувалася пiд впливом бутилгщроксихшону у концентраци 25 мкмоль/л (на 68,62±2,96%, Р<0,001) i окситоцину у концентраци 100 мкмоль/л (на 65,74±13,50 Р<0,001). З цими даними добре узгоджуються результати вимiрювань сумарного вмюту Ca2+ у тканинi залоз та рiвня секреци загального
106
бшка у присутност окситоцину та бутилгщроксихшону. Виявилося, що за таких умов обидва показники виразно збшьшувалися, що вказуе на пригшчення окситоцином та бутилгщроксихшоном Ca2+,Mg2+-АТФзноï активностi тканин залоз. З'ясувалося також, що бутилгiдроксихiнон викликав збшьшення вмшту мембранозвязаного Ca2+ у цих клiтинах у 1,16 разiв.
Вщомо, що вхiд зовнiшньоклiтинного Ca2+ створюе передумови для його вивiльнення з внутршньокл^инних депо i в першу чергу - з ЕПР. Внаслщок додавання кофеïну, вiдомого активатора вившьнення Ca2+ з ЕПР, у концентращях 1, 2, 4, 8, 10, i 15 ммоль/л до розчину з нормальним юнним складом виявили, що максимальний вмiст Ca2+ у тканинi залоз i секрещя загального бiлка були за умови дп кофеïну у концентраци 4 ммоль/л. Очевидно, що у даному випадку вмшт Ca2+ у тканинi залоз збiльшуeться завдяки змш функцiональноï активностi Са2-помпи ПМ чи ЕПР. Вiдносне зменшення цього показника пщ впливом кофеïну у високих концентращях (10-15 ммоль/л) та за наявност блокаторiв Ca2+ помпи можна розщнити як опосередкований доказ наявност у дослiджуваних клiтинах рiанодинчутливих Ca2+-каналiв [4]. Рiанодин у концентраци 5 нмоль/л викликав зменшення, а у концентраци 500 нмоль/л - збшьшення вмшту Ca2+ у тканиш залоз, що доводить наявшсть у секреторних кл^инах дослiджуваних слинних залоз рiанодинчутливих Ca2 -каналiв [1, 11]. Виявилося, що за сумюнох' ди рiанодину (5 нмоль/л) та шозитолтрифосфату достовiрних змiн у вмiстi Ca2+ не простежувалося. Ефект гепарину, як блокатора 1Ф3-чутливих Ca2+-каналiв, виявився лише за наявност рiанодину у вказанш концентраций Очевидно, що у дослщжуваних клiтинах без стимуляци функцiонують рiанодинчутливi Са2 -канали, якi перебувають у тшнш взаeмодiï з 1Ф3-чутливими Са2-каналами. У дослщженнях з використанням еозину Y та рутешю червоного, блокатора Са2+-уншортера мiтохондрiй, у мiтохондрiях секреторних кл^ин слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. щентифковано Ca2+-унiпортер, який, як з'ясувалося, транспортуе Ca2+ у м^охондри в станi спокою клiтини за вщсутност стимуляци, а не лише за високих концентрацш Ca2+ у цитозолi [10].
Висновки. На основi аналiзу отриманих результатiв можна говорити, що у секреторних кл^инах слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. функщонують не менше трьох просторово окреслених кальцiевих доменiв, якi сформоваш за участю ПМ та внутршньокл^инних мембран i мають рiзний набiр Са2+-транспортувальних систем [12]. Кальцiева сигналiзацiя у базальному кальцiевому доменi здшснюеться за участю потенцiалозалежних Ca2+-каналiв, №+-Са2+-обмшника, Са2+-помпи ПМ, а також Са2+-уншортера мiтохондрiй. У межах апiкального кальщевого домену генерацiю Са2 -сигналу забезпечуе ендоплазматична та ендоплазматично-мiтохондрiальна Са2+-функщональш одиницi. Очевидно, що у кл^инах наявний ще один, третш, ядерний кальцiевий домен.
107
Лггература
1. Бичкова С.В., Манько В.В. Рiанодинiндуковане вившьнення Ca2+ у секреторних клпинах слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. // Вiсник Львiв. ун-ту. Сер.бюл. - 2004. - Вип.35. - С.244-250.
2. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Вплив блокаторiв потенцiалозалежних кальщевих каналiв на стимульованш гiперкалieвою деполяризацieю вхiд Ca2+ у клiтини екзокринних залоз та ïx секреторну вiдповiдь // Галицький лiкарський вiсник. - 1998. - Т.5, №3. - С.46-48.
3. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Дослщження активного транспорту Ca2+ у секреторних кл^инах слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. // Бюлопя тварин. - 2000. - Т. 2, №1. - С.92-97.
4. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Вплив кофе1'ну на Ca2+-транспортш системи секреторних кл^ин слинноï залози личинки Chironomus plumosus L. // Експериментальна та клЫчна фiзiологiя i бiоxiмiя. - 1999. - Т.8, №4. - С.49-53.
5. Король Т.В., Манько В.В. Використання параметрiв рiвняння Хiлла, розрахованих з використанням модифiкованиx координат 1д>Хофси, у дослiдженняx потенцiалокерованиx Ca2+-каналiв секреторних кл^ин личинки комара-дергуна // Мехашзми функцiонування фiзiологiчниx систем: Матерiали Мiжнародноï науковоï конференцiï, приуроченоï до 60-л^тя новостворено1' кафедри фiзiологiï людини i тварин Львiвського унiверситету iменi 1вана Франка, 8-11 листопада 2006 р., м. Львiв. -Львiв, 2006. - С. 72-73.
6. Костерин С.А. Транспорт кальция в гладких мышцах. - К.: Наукова думка, 1990. - 213 с.
7. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. - М.: Наука, 1986. -254 с.
8. Максимов Г.В., Орлов С.Н. Транспорт ионов кальция при функционированим нервного волокна: механизмы и регуляция. - М.: Изд-во Московского ун-та. - 1994. - 87 с.
9. Манько В.В., Король Т.В., Клевець М.Ю., Демюв О.Т. Дослщження Са2 -транспортних систем секреторних кл^ин екзокринних залоз з використанням хлор тетраци^ну // Вюн. Харк. ун-ту, №488. Бiофiзичний вюник. - 2000. - Вип. 6(1). - С. 79-81.
10. Манько В.В., Стельмах С.В. Вплив рутешю червоного на вмют Ca2+ у тканиш слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. // Вюник Львiв. ун-ту. Сер. бюл. - 2002. - Вип.29. - С. 171-176.
11. Манько В.В., Бичкова С.В., Клевець М.Ю. 1дентифшащя каналiв вившьнення Ca2+ в секреторних кл^инах слинних залоз личинки комара-дергуна // Укр. бiоxiм. журн. - 2004. - Т.76, №1. - С. 65-71.
12. Манько В.В. Системи трансмембранного транспортування кальцш у секреторних кл^инах слинних залоз личинки Chironomus plumosus Linnaeus: Автореф. дис. ... доктора бюл. наук: 03.00.13 / Кшвський нацюнальний ун-т iменi Тараса Шевченка. - К.: 2008. - 43 с.
108
13. Федiрко Н.В. Характеристика струму та властивостей Na-Ca2+-o6MiHy мембрани секреторних кл^ин: Автореф. дис. ... канд. бюл. наук:03.00.13 / Кшвський ун-т iменi Тараса Шевченка. - К.: 1997. - 18 с.
14. Ambudkar I.S. Regulattion of calcium in salivary gland secretion // Critical reviews in oral biology 2 medicine. - 2000. - Vol. 11. - P. 4-25.
15. Park M.K., Ashby M.C., Erdemit G. et al. Perinuclear, perigranular and subplasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport // EMBO J. - 2001 ac. - Vol. 20, №8. - P. 18631874.
16. Petersen O.H. The functional organization of calcium signaling in exocrine acinar cells // J. Korean. Med. Sci. - 2000. - Vol. 15P. S 44-S45.
Summary
Korol T.V., Manko V.V., Klevets M.Yu.
ca2-transporting systems of chironomus plumosus l.
LARVAE'S SALIVARY GLANDS EXOCRINE CELLS
These was done a research of active and passive transport systems in exocrine secretory cells of Chironomus plumosus L. larvae's salivary gland. The functional confirmations of potentialdependent calcium channels presence in plasma membrane of these cells and their role in secretion activity of glands were received. It was established that chlorpromazine suppressed the passive transport of Ca2+ into these cells. Through plasma membrane of researched cells was established also Na+-dependent efflux of Ca2+ in extracellular medium. The role of the Ca2+-calmoduline complex in functioning of the Na+—Ca2+-exchange system in physiological conditions was shown. The presence of the prime-active Ca2+-transport system in secretory cells of the researched glands was proved and optimal concentrations of ATP and Ca2+ for Ca2+,Mg2+-ATPase activity was determined. The functioning of mitochondrial Ca2+-uniporter, ryanodine-sensetive and Ins (1,4,5) P3-sensetive Ca2+-channels of intracellular stores was found.
Key words: potentialdependent Ca2+-channels, Na+—Ca2+-exchanger, Ca2+,Mg2+-ATPase, RyRs, InsPRs, Ca2+-uniporter.
Стаття надшшла до редакцИ 20.09.2008
109
