CC BY
21
BicHUK ,fl,mnponeTpoBCBKoro ymBepcrneTy. Bionoria, eKonorifl. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2015. 23(2), 87-90.
doi:10.15421/011512
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online
www.ecology.dp.ua
УДК 581.198
Вплив Cu2+ та кислотносп середовища на вмiст цитоплазматичного кальщю та перекисне окиснення лiпiдiв
у коренях озимо'1 пшеницi
M.G. Рязанова, Т.1. Маковейчук, В.В. Швартау
1нститут ф1зюлоги рослин i генетики Нацюнально'1 академИ наук Украти, Кшв, Украта
Дослщжено вплив ioHiB Cu2+ на внутршньоклпинний гомеостаз Са2+ та перекисне окиснення лтщв в умовах р1зно! кислотностт середовиша. Показано, що зниження рН середовища зумовлюе тдвищення [Ca2+]cyt i може бути вщуком кттин кореня на кислот-ний стрес. Додавання мщ до середовища для пророшування насшня ймов!рно щдвищуе неселективну прониктсть мембрани та спричинюе И деполяризащю. Це може активувати Са-канали, що активуються за умов деполяризащ! та вщповщають за надходження кальщю до цитоплазми з апопласту. Пщвищення р!вня МДА свщчить про наявнсть окисного стресу, який може активувати гшерпо-ляризащйт Са-канали, що також впливають на [Ca2+]cyt. Таким чином, змши iнгенсивнoстi Са2+-залежних метабол!чних процеов (регулящя подлу клпин та рют кореня) можуть бути наслщком токсичного впливу ютв Cu2+ на рослини озимо! пшенищ.
Ключом слова: токсичтсть мщ; [Ca2+]cyt; кислоттсть середовища; малоновий даальдепд; Fluo-3 AM; Ca-канали
Effect of Cu2+ and pH on intracellular calcium content and lipid peroxidation in winter wheat roots
M.E. Riazanova, T.I. Makoveychuk, V.V. Schwartau
Institute of Plant Physiology and Genetics of NAS of Ukraine, Kiev, Ukraine
The study investigates the effect of copper ions and pH of external solution on intracellular calcium homeostasis and lipid peroxidation in winter wheat roots. Experiment was carried out with winter wheat. Sterile seeds were germinated in Petri dishes on the filter paper soaked with acetic buffer (pH 4.7 and 6.2) at 20 °C in the dark for 48 hours. Copper was added as CuSO4. It's concentrations varied from 0 to 50 цМ. The Ca2+-fluorescent dye Fluo-3/AM ester was loaded on 60 hour. Root fluorescence with Fluo-3 loading was detected using X-Cite Series 120 Q unit attached to microscope Olympus BX53 with camera Olympus DP72. Imaging of root cells was achieved after exciting with 488 nm laser and collection of emission signals above 512 nm. Preliminary analysis of the images was performed using software LabSens; brightness (fluorescence intensity) analysis was carried out by means of ImageJ. Peroxidation of lipids was determined according to Kumar and Knowles method. It was found that pH of solution had effect on release of calcium from intracellular stores. Low pH provokes an increase of [Ca2+]cyt which may be reaction of roots to acidic medium. Copper induces increase in non-selective permeability of plasma membrane and leads to its faster depolarization. This probably initiates Ca-dependent depolarization channels which are responsible for the influx of calcium from apoplast into the cell. Changing of the membrane permeability may occur due to interaction between Cu2+ ions and Ca-binding sites on plasma membrane or may be due to binding of copper with sulfhydryl groups and increasing of POL. Copper may also damage lipid bilayer and change the activity of some non-selective channels and transporters. Reactive oxygen species which are formed under some types of stress factors, especially the effect of heavy metals, can be activators of Ca-channels. Cu2+ ions rise MDA content and promote the oxidative stress. Low medium pH also induces its development. Oxidative stress apparently enhances activity of hyper- polarization of Ca-channels and leads to increase of [Ca2+]cyt. These Ca-channels may also be stimulated by calcium, which influxes into the cell, so Ca-signal can be self-enhanced one. Prolonged retention of high calcium concentration may be the evidence of copper toxicity to root cells and the consequence of deactivation of Ca-ATPases which promote Ca efflux from cell. The increase of [Ca2+]cyt may elicit changes in some metabolic processes.
Keywords: copper toxicity; [Ca2+]cyt; pH; malondialdehyde; Fluo-3 AM; Ca-channels
1нститут фтологп рослин i генетики НАН Украши, вул. Васильювська, 31/17, м. Кшв, 03022, Укра1на
Institute of Plant Physiology and Genetics of NAS of Ukraine, Vasylkivska Str., 31/17, Kyiv, 03022, Ukraine
Tel. +38-044-257-90-18, +38-063-362-30-36. E-mail: marina.rz@mail.ru, makoveyt@ukr.net, schwartau@ifrg.kiev.ua
Вступ
Кислоттсть середовища мае домiнуючий вплив на розчиннiсть i, як наслщок, на досгупнiсгь i потенцiал фгготоксичносп ютв (Rengel, 2011). У лужному сере-довищi спостерiгаеться зниження доступносп P, Zn, Fe та Cu, у кислому зростае токсичний вплив Al та Mn. Вважаеться, що оптимальний рiвень рН для засвоення елеменгiв живлення озимою пшеницею становить 6,07,5 (Zynchenko et al., 2001).
Мвдь - один i3 найважливiших мiкроелементiв для рослин. Нормальний рiст i розвиток потребуе оптимально! кшькосп Си2+. У той же час дапазон конценIрацiй Cu2+, як1 не чинять негативного ефекту на рослини, дос-татньо вузький. Незважаючи на можливi негативнi ефекти, обробка рослин Си-фунг^цидами залишаеться одним iз поширених щдход1в до культивування широкого спектра культур (Barker and Pilbeam, 2006; US EPA, 2008). Серед можливих пояснень токсичного впливу iонiв мiдi на рослинн клiтини у лiтературi найчаспше зустр!чаеться посилення перекисного окиснення мем-бранних лiпiдiв, змiна !х складу та щдвищення неспециф!чно! проникностi мембран (Berglund et al., 2002; Kanoun-Boule et al., 2008; Hong et al., 2012), але мехашзм ди залишаеться не з'ясованим.
1они кальцш володють унiкальними властивостями й ушверсальною здаттстю щодо проведення рiзних сигнал1в, яю здiйснюють первинну дш (гормони, пато-гени, свiтло, гравiтацiя тощо) (Medvedev, 2005). У кож-нш iз вщомих у рослин систем сигнально! трансдукци велике значення як вторинний посередник мають iони Са2+. Кальцш - ефективний регулятор метаболiчних процесш у вс1х клiтинах, де юнують системи, як1 реагу-ють на невелик! змши його концентраци. Основш вну-трiшньоклiтиннi мiшенi для ютв кальцш - рiзноманiтнi Са-зв'язувальнi бшки, одн з яких самi змшюють свою активнiсть (Lewit-Bentley and Rety, 2000), а шш! (наприк-лад, кальмодулш) опосередковують ефект цього катюна на р!зномаштш клпинт мшет (Roberts and Harmon, 1992). Мета дано! стат - виявити вплив ютв Cu2+ на внутршньоклпинний гомеостаз Са2+ та перекисне окиснення лщдш за р!зно! кислотносп середовища.
MaTepia™ i методи досл1джень
Стеритзоване (опромшювач бактерицидний ОБН-35м) насшня озимо! пшениц! сорту Смуглянка (Triticum aestivum L.) пророщували у чашках Петр! на двошаро-вому фшьтрувальному папер!, змоченому стерильним середовищем !з рН 4,7 та 6,2 (5 мМ ацетатний буфер) у темряв!, за +20 °С протягом 48 год (хладотермостат ХТ 3/70-2). На 48-му годину проводили обробку CuSO4 (50 мкМ). Завантаження коретв флуоресцентним щди-катором Fluo-3AM (Sigma) робили за методикою, опи-саною Zhang et al. (1998). 1нтактт корен! довжиною 0,5 см шкубували за +4 °С упродовж двох годин у темрявг Розчин для шкубащ! мктив 20 мкМ Fluo-3AM, 0,2 мМ Са02 та 50 мМ сорбгголу. Розчин Fluo-3 AM додано з вихщного розчину 1 мМ Fluo-3AM у ДМСО. Фшальна концентращя ДМСО в шкубацшному розчин!
складала <1%. Пюля шкубування KopeHi змивали бу-ферним розчином протягом 15 хв. Флуоресценцию коренв, пофарбованих Fluo-3 AM, дослвджували за до-помогою мiкроскопа Olympus BX53 i3 люмiнесцентним блоком X-Cite Series 120 Q i камерою-детектором Olympus DP72 за довжини хвил1 збудження 488 нм, хвил1 емiсii - 512 нм (зелений свiтлофiльтр). Контролем слугувала дистильована вода. Повторнiсть проведення дослвду - чотриразова, анал1тична семиразова.
Р1вень ПОЛ визначали за накопиченням малонового дiальдегiду (МДА) методом Kumar and Knowles (1993) iз деякими модифжащями. 200 мг коренв гомогензували з невеликою кiлькiстю Tris-NaCl буфера (рН 7,6), об'ем ек-стракту доводили до 3 мл. До отриманого гомогенату додавали 1 мл 0,5% розчину тiобарбiтуровоi' кислоти (ТБК) та 2 мл 20% трихлороцгово! кислоти (ТХО). Пробiрки з гомо-генатом витримували 30 хв на киплячш водянш банi з на-ступним центрифугуванням за 3 000 об./хв протягом 10 хв. Визначення проводили за довжини хвил 533 нм на спектрофотометрi UV-1800 (Shimadzu).
Суху бiомасу визначали вщповщно до ГОСТ 16932-93.
Попереднш аналз отриманих зображень проводили за допомогою програмного забезпечення LabSens, анал1з яскравосп (iнгенсивностi флуоресценцй) - ImageJ.
Статистичну обробку даних робили за допомогою програми Statistica 6.0.
Результата та ix обговорення
У станi спокою вмст iонiзованого кальщю у цито-плазмi рослинних кл1тин надзвичайно малий i варше вщ 100 до 200 нМ (Medvedev, 2005; Schwartau et al., 2014). Щдвищення цитозольного вмкту кальщю д1е як сигнал, що викликае змши фiзiологiчних та бюх1мчних процес1в (Webb et al., 1996; Pandey et al., 2000). Кислоттсть середовища впливае на концентращю [Ca2+]cyt. За рН 4,7 спосте-ртаеться щдвищення концентраци [Ca2+]cyt у 1,5 раза пор1вняно з оптимальним р1внем рН (рис. 1). Це можна пояснити вщгуком кальщево! сигнально! системи на кислотний стрес (Vodneev et al., 2007). Додавання iонiв Cu2+ до розчину для пророщування насшня викликае щдвищення внутршньоклиинного вмiсту Са2+ в обох варiантах дослщу. У пращ Demidchik et al. (1997) показано, що 10 мкМ Cu2+ зумовлюе швидке щдвищення неселективно! проникносп мембрани та l! деполя-ризащю. Це може iнiцiювати Са2 -канали, що активу-ються за умов деполяризацп та вщповщають за надход-ження кальщю до цитоплазми з апопласту (Thion et al., 1998). На плазмалемi iснуе багато сайпв впливу iонiв Cu2+. Одними з них е канали iонного вщтоку, змiна активностi яких може бути наслвдком перебудови лшщного бшару або шших неселективних канал1в i пе-реносник1в. Змiна проникноси мембрани може вщбува-тись внаслвдок взаемодй' м1ж iонами Cu2+ та Са-зв'язу-вальних сайпв на плазмалемi (Murphy et al., 1999), або бути результатом взаемодй' Cu2+ iз сульфпдрильними групами мембранних бiлкiв та шдвищенням ПОЛ. Цшстсть лшщного бiшару може пошкоджуватись унаслвдок витискання фiзiологiчно важливих катюн1в з !х центрiв зв'язування на поверхт мембрани, загального динамiчного пошкодження та щдвищення кiлькостi ко-
роткотривалих пор (Demidchik et al., 1997, 2001). Активт форми кисню (АФК), яю формуються за деяких титв сгресових чинниюв (наприклад, вплив важких мегалiв), можуть також виступати як активатори Са-про-никних каналiв. Окисний стрес спричинюе щдвищення ршня [Ca2+]cyt у тваринних (Klyubin et al., 1996), а також рослинних клтинах (Zhang et al., 1998; Cessna and Low, 2001). У кореневих волосках АФК, iмовiрно, стимулюють канали, якi активуються за умов гтперполяризаци (Pei et
80000 п
al., 2000; Lecourieux et al., 2002). Остант додатково можуть стимулюватися кальцieм, що надходить у клггану, тобто Са-сигнал здатен до самопосилення (Demidchik, 2012). Пiдгримання високо1 концентраци Са2+ протягом тривалого часу може свщчити про токсичний вплив iонiв мщ на клiтини коренш i проявлятися в шактиваци Са-каналiв тонопласту, яю сприяють завантаженню Са2+ назад до вакуол^ а також деактиваци Са-АТФаз, що сприяють вщгоку Са2+ з кттини.
о t*
70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0
вода
pH 4,7
pH 4,7 + 50 цМ CuSO4
pH 6,2
pH 6,2 + 50 цМ CuSO4
Рис. 1. Вплив сульфату мвд1 на вм1ст внутр1шньокл1тинного кальц1ю у коренях озимо!' пшенищ залежно ввд рН середовища
18 16 14 12 10 8 6 4 2
вода
pH 4,7
pH 4,7 + 50 |хМ CuSO4
pH 6,2
pH 6,2 + 50 |хМ CuSO4
Рис. 2. Вплив сульфату мвд на вм1ст МДА у коренях озимоУ мшемиц1 залежно ввд рН середовища
Для перевiрки наявносп окисного стресу провели аналiз накопичення продукту ПОЛ - малонового дальде-гтду. На рисунку 2 видно, що тдвищення концентраци Cu2+ викликало зростання концентраци МДА за рН 4,7 на 47%, а за рН 6,2 - на 23%, вщповщно. Слад зазначити, що зниження рН середовища для пророщування щдвишуе токсичний вплив Cu2+, що узгоджуеться з лггературними даними (Mortvedt et al., 1991).
Висновки
Вплив ютв Cu2+ стимулюе щдвищення [Ca2+]cyt у коренях озимо1 пшениц1, що може проявлятися у змЫ iнтенсивностi Са2+-залежних метабол1чних процесiв (ре-гулящя подшу кл1тин та рiст кореня) та е наслвдком токсичного впливу iонiв Cu2+ на рослини озимо1 пшеницi. Зростання юлькосп МДА сввдчить про наявнiсть окис-
ного cipecy, aKHH po3BHBaeTbca 3 mgBHmeHHHM koh^h-тpацiï îohîb Cu2+ i nocHHK>eTbca 3a yMOB 36№meHHH Ki^bKOCTÎ ioHiB boahto y cepegoBH^i.
Ei6.iorpa$iHHi iIOCII. i:iiiim
Barker, A.V., Pilbeam, D.J., 2006. Handbook of Plant Nutrition.
CRC Press, Boca Raton. Berglund, A.H., Quartacci, M.F., Calucci, L., Navari-Izzo, F., Pinzino, C., Liljenberg, C., 2002. Alterations of wheat root Plasma membrane lipid composition induced by copper stress result in changed physicochemical properties of plasma membrane lipid vesicles. Bioch. Biophys. Acta. Biomembranes 1564(2), 466-472. Cessna, S.G., Low, P.S., 2001. Activation of the oxidative burst in aequorin-transformed Nicotiana tabacum cells is mediated by protein kinase- and anion channel-dependent release of Ca2+ from internal stores. Planta 214, 126-134.
0
Demidchik, V., Sokolik, A., Yurin, V., 2001. Characteristics of non-specific permeability and H-ATPase inhibition induces in plasma membrane of Nitella flexilis by excessive Cu2+. Planta 212, 583-590.
Demidchik, V.V., 2012. Membrannye mehanizmy regulyacii aktivnosti ionov kal'ciya v citoplazme kletok vysshih ras-teniy [Membrane mechanisms of regulation ion calcium activity in cell cytoplasme of higher plants]. Trudy BGU 7(1), 99-105 (in Russian).
GOST 16932-93 Cellulose. Opredelenie soderzhanija suhogo veshhestva [Determination of dry matter content]. State standard of Ukraine.
Hong, R., Kang, T.Y., Michels, C.A., Gadura, N., 2012. Membrane lipid peroxidation in copper alloy-mediated contact killing of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 78(6), 1776-1784.
Kanoun-Boule, M., De Albuquerque, M.B., Nabais, C., Freitas, H., 2008. Copper as an environmental contaminant and essential nutrient: Consequences to plant and human health. In M.N.V. Prasad (Ed.), Trace elements as contaminants and nutrients: Consequences in ecosystems and human health. Willey and Sons Inc, Hoboken, New Jersey. P. 653-678.
Klyubin, I., Kiprichnikova, K.M., Gamaley, I.A., 1996. Hydrogen peroxide-induced chemotaxis of mouse peritoneal neu-trophils. Eur. J. Cell Biol. 70, 347-351.
Kumar, G.N.M., Knowles, N.R., 1993. Changes in lipid peroxi-dation and lipolitic and freeradical scavenging enzyme activities during aging and sprouting of potato (Solanum tuberosum) seed-tubers. Plant Physiol. 102, 115-124.
Lecourieux, D., Mazars, C., Pauly, N., Ranjeva, R., Pugin, A., 2002. Analysis and effects of cytosolic free calcium increases in response to elicitors in Nicotiana plumbaginifolia cells. Plant Cell. 14, 2627-2641.
Lewit-Bentley, A., Rety, S., 2000. EF-hand calcium-binding proteins. Curr. Op. Struct. Biol. 10, 637-643.
Medvedev, S.S., 2005. Kal'cievaya signal'naya sistema rasteniy [Calcium signalling system of plants]. Fiziologiya Rasteniy 52(1), 1-24 (in Russian).
Mittler, R., 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. 7, 405-410.
Mortvedt, J.J., Cox, F.R., Shuman, L.M., Welch, R.M., 1991. Micronutrients in agriculture. Soil Science Society of America, Madison,. Wisconsin, USA.
Murphy, A.S., Eisinger, W.R., Shaff, J.E., Kochian, L.V., Taiz, L., 1999. Early copper-induced leakage of K+ from Arabidopsis seedlings is mediated by ion channels and coupled to citrate efflux. Plant Physiol. 121, 1375-1382.
Pandey, S., Tiwari, S.B., Upadhyaya, K.C., Sopory, S.K., 2000. Calcium signaling: Linking environmental signals to cellular functions. Crit. Rev. Plant Sci. 19, 291-318.
Pei, Z.M., Murata, Y., Benning, G., Thomine, S., Klusener, B., Allen, G.J., Grill, E., Schroeder, J.I., 2000. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells. Nature 406, 731-734.
Rengel, Z., 2011. Soil pH, soil health and climate change. In: B.P. Singh, A.L. Cowie, K.Y. Chan (Eds.), Soil health and climate change. Springer-Verlag. 69-85.
Rengel, Z., Zhang, W.-H., 2003. Role of dynamics of intracellular calcium in aluminium-toxicity syndrome. New Phytol. 159, 295-314.
Roberts, D.M., Harmon, A.C., 1992. Calcium-modulated proteins: Targets of intracellular calcium signals in higher plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43, 697-725.
Schwartau, V.V., Virych, P.A., Makoveychuk, T.I., Artemenko, A.U., 2014. Kal'ciy v rastitel'nyh kletkah [Calcium in Plant Cells]. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 22(1), 19-32 (in Russian).
United States Environmental Protection Agency (USEPA). Copper facts. 2008.United States Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs,
Vodeneev, V., Pyatygin, S., Opritov, V.A., 2007. Reversible change of extracellular pH at the generation of mechano-induced electrical reaction in a stem of Cucurbita pepo. Plant Signal Behav. 4, 267-268.
Webb, A.A.R., McAinsh, M.R., Taylor, J.E., Hetherington, A.M., 1996. Calcium ions as intracellular second messengers in higher plants. Adv. Bot. Res. 22, 45-96.
Zhang, W-H., Rehgel, Z., Kuo, J., 1998. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: Loading of ace-toxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant J. 15(1), 147-151.
Zynchenko, O.I., Saldatenko, V.N., Bilonozhko, M.A., 2001. Roslynnyctvo. [Plant Growing]. Agrarna Osvita, Kyiv (in Ukrainian).
Надшшла до редколегп 28.06.2015
