CC BY
9
УДК 612. 014. 42:612. 31:591. 413. 2
Король Т.В., кандидат бюлопчних наук © Лье1еський нацюнальний утеерситет еетеринарног медицины та бютехнологт
¡мет С.З. Гжицького
ФУНКЦЮНАЛЬНЕ П1ДТВЕРДЖЕННЯ НАЯВНОСТ1 МЕМБРАННИХ СИСТЕМ ТРАНСПОРТУ СА2+ У КЛ1ТИНАХ СЛИННО1 ЗАЛОЗИ ЛИЧИНКИ CHIRONOMUS PLUMOSUS Ь. У ЗВ'ЯЗКУ З IX СЕКРЕТОРНОЮ ДШЛЬШСТЮ
Дослгдження ролг Са2+ ,як ушеерсального еторинного посередника, е еажлиеою проблемою сучасног ф1зюлогп .Доведено, що е актиеацп секрецИ бере участь як зоешшньо-, так / енутргшньоклтинний Са2+ . Перюдичш осциляцгг Са2+ у цитоплазмг залозистих клтин е необхгдною умоеою для реал1зацп усгх етате секреторного процесу I забезпечуються функцюнуеанням Са2+ - транспортуеальних систем плазматичног мембрани (ПМ) та мембран енутршньоклтинних кальщееих депо.
Ключовi слова: потенцгалозалежнг Са2+-канали, Ыа+-Са2+-обмтник, Са2+,Ы^+-АТФаза, рганодинчутлиег Са2+-канали, 1Фз-чутлиег Са2+-канали, Са2+-унтортер.
Вступ. Важливу роль у нейро-гуморально! регуляци секреторного процесу виконують катюни Са2+. Доведено, що кальцш бере участь в активаци секреци клггинами травних залоз [2,12,13,14]. Важливою ланкою у спряженш стимулу iз секрещею е короткочасне пiдвищення внутршньокл^инно! концентраци юшзованого Са2+, яке досягаеться завдяки його надходженню через специфiчнi кальцiевi канали ПМ за градiентом концентраци та системою Ш+-Са2+-обмшу (за умови, що пДц№ < ДцСа) з одного боку, а з шшого -мобшзащею Са2+ з ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) через Са2+- та 1Ф3-залежнi механiзми та його вившьненням з мiтохондрiй (МХ). Вiдновлення ж низького рiвня вiльних iонiв Са2+ у цитоплазмi лежить в основi формування умов для повторного запуску секреци i забезпечуеться депонуванням Са2+ у клiтинних органелах, зокрема ЕПР i МХ, та його виведенням у позакл^инне середовище за допомогою №-Са2+-обмшника та Са2-помпи ПМ.
Без сумшву, пiдтримання внутрiшньоклiтинного гомеостазу Са2+ досягаеться завдяки складнiй та координованш взаемоди систем i механiзмiв пасивного i активного транспорту Са2+ на рiвнi ПМ i ЕПР секреторних кл^ин, якi, в свою чергу, перебувають пiд контролем внутрiшньоклiтинних метаболiчних процесiв, що протягом вже тривалого часу знаходиться в центрi уваги багатьох дослщниюв. У теоретичному вщношенш дослiдження механiзмiв енергонезалежного та енергозалежного трансмембранного перенесення iонiв Са2+ у секреторних кл^инах необхiдне для поглиблення
© Король Т.В., 2009 174
знань про загальш 3aKOHOMipHOCTi, яю лежать в 0CH0Bi активаци секреци та И припинення. А з практично! точки зору тзнання функцюнально! poni Са2-транспортувальних систем цих клiтин, особливостей !х регуляци та фармаколопчно! чутливoстi вiдкpиваe перспективи для розробки метoдiв корекци порушення гомеостазу Са2+ у секреторних кл^инах, а тому мае значення для медицини i ветеринара.
Матер1ал i методи. Дoслiдження проводили на iзoльoваних малoклiтинних (32-48 клiтин) слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. Про функцюнальний стан Ca2+ -транспортувальних систем клiтин дoслiджуваних залоз судили на пiдставi змiн сумарного та мембранозвязаного вмiсту Ca2+ у тканиш та piвня секреци загального бшка.
Базовий зoвнiшньoклiтинний розчин для дослщження у базальних умовах мiстив (ммоль/л): NaCl - 136,90; KCl - 5,36; CaCb - 1,76; MgCb - 0,49; Na2HPO4 - 0,35; KH2PO4 - 0,44;глюкоза - 5,55; pH 7,2. Потенщалозалежш Ca2+-канали активували гiпеpкалiевoю депoляpизацiею мембрани, збшьшуючи кoнцентpацiю KCl у базовому зовшшньокл^инному poзчиннi до 40 ммоль/л. У дослщженнях використовували блокатори цих каналiв: веpапамiл (0,1 ммоль/л), дилтiазем (0,1 ммоль/л), шфедитн (0,1 ммоль/л). Для активiзацil Na+-Ca2+-oбмiну у прямому pежимi збiльшували [№+]з до 180 ммоль/л, а у зворотному -зменшували [№]з до 35 ммоль/л, замшюючи 101,90 ммоль/л NaCl у базовому розчиш на еквiмoляpну концентрацш трис-Cl. Для активаци вивiльнення Ca2+ з ЕПР використовували кофеш у концентращях 1, 2, 4, 8, 10 та 15 ммоль/л. З метою щентифжування piанoдинчутливих Ca2+-каналiв у внутршньокл^инних мембранах дoслiджуванoгo об'екта використовували piанoдин (5 i 500 нмоль/л), а 1Фз-чутливих Ca2+-каналiв - iнoзитoл-1,4,5- трифосфат у концентраци 10 мкмоль/л та блокатор 1Ф3-чутливих Ca2+-каналiв гепарин (500 мкг/мл).
Середовище шкубаци для визначення загально! АТФазно! активнoстi тканини слинних залоз мютило (ммоль/л): NaCL - 16,0; KCl - 130,14; CaCl2 -0,10; MgCl2 - 5,0; трис-АТФ - 5,0; глюкоза - 5,55; pH 7,0.
Вмкт Ca2+ у тканинi залоз визначали з використанням арсеназо Ill i виражали у наномолях на залозу; вмкт загального бiлка у сеpедoвищi шкубаци визначали за методом Лoуpi (Lowry et al., 1951) i виражали у % вщ сумарного вмюту бiлка у гoмoгенатi залоз та сеpедoвищi шкубаци; визначення вмiсту мембранозвязаного Ca2+ проводили на oснoвi вимipювання iнтенсивнoстi флуоресценци комплексу Ca2+-хлopтетpациклiн за допомогою
цитофлуориметра ЛЮМАМ-Р-З (Рoсiя) при збiльшенi 10x7 з дiаметpoм щiлини 0,5 мм й штерференцшним фiльтpoм A,max = 541±2нм; АТФазну активнiсть виражали у мжромолях неopганiчнoгo фосфату на мшграм бiлка за 30 хвилин (мкмоль Рн/мг бшка за 30 хвилин).
Цифpoвi результати уЫх вимipювань пiддавали ваpiацiйнo-статистичнiй oбpoбцi за Стьюдентом. Опрацювання pезультатiв здiйснювали з використанням програмного пакету Microsoft Excel.
Результати дослщження. Через мембрану секреторних кл^ин слинно! залози личинки Chironomus plumosus L. зареестровано вхщний кальцiевий
175
струм, що е електрофiзiологiчним тдтвердженням наявност у нiй потенцiалозалежних кальцiевих каналiв [3]. Як виявилося у ходi дослiджень , тдвищення [К]з до 10, 20, 40, 80 i 100 ммоль/л викликае концентрацшнозалежне збiльшення вмiсту Ca2+ у тканинi слинних залоз в середньому у 1,7 - 2,8 разiв (п=5,Р<0,05) та збiльшення вмкту загального бiлка у середовищi шкубаци, що свщчить на користь факту надходження Ca2+ у клiтини через потенщалозалежш Са2+-канали.Щ канали за сво1ми потенцiалозалежними характеристиками найближчi до каналiв Т-типу збудливих клiтин [10 ], а за фармаколопчними - до кальщевих каналiв L-типу, оскiльки стимульоваш гiперкалiевою деполяризацiею вхiд Ca2+ у дослщжуваш клiтини та рiвень секреци загального бшка пригшчувались класичними синтетичними кальщевими антагонiстами верапамiлом, нiфедипiном та дилиаземом. У всiх випадках спостер^алося пригнiчення стимульованого входу Ca2+ у клггини залоз та секреци загального бшка [4].З'ясувалося, що К-стимульоване збшьшення вмiсту Ca2+ у тканиш залоз пригшчуеться верапамiлом (на 58,82%; Р<0,01, n=6), дилтiаземом (на 64,50%; Р<0,05, n=6) та нiфедипiном (на 62,02%; Р<0,05, n=6). Цi даш узгоджуються з результатами вимiрювання змш вмiсту мембранозвязаного Ca2+ пiд впливом блокаторiв потенцiалозалежних Ca2+-каналiв на фош гiперкалiевоï деполяризаци мембрани. Виявлено, що стимулящя гiперкалiевим розчином змiни штенсивност флуоресценцiï Ca2+-ХТЦ комплексу у контролi збiльшувалася у 3,68 разiв, у присутност дилтiазему - лише у 1,96 разiв, а пiд впливом шфедишну практично повнiстю пригнiчувалося стимульоване гiперкалiевим розчином збiльшення вмiсту мембранозвязаного Ca2+ у дослiджуваних клiтинах [7].
Ще однiею системою транспортування Ca2+, локалiзованою у ПМ клiтин, е Na+-Ca2+-обмiнник, наявнiсть якого у секреторних кл^инах дослiджуваних залоз доведена з використанням електрофiзiологiчних методiв на основi збiльшення вмiсту Ca2+ у тканиш залоз i секреци загального бшка у гiпонатрiевих умовах [11] та при його активаци у прямому режимi в умовах гiпернатрiевих середовищ. 1нтенсивне зменшення вмiсту Ca2+ у тканиш залоз (у 2,28 разiв, Р<0,01) та секрецiï загального бшка (у 1,21 разiв, Р<0,05) виявилося максимальним при [Na+k = 180 ммоль/л. Це свщчить про ефективне за таких умов (nAp,Na>Ap,Ca) виведення обмшником Ca2+ iз секреторних кл^ин проти його електрохiмiчного градiента.
Системою, яка також забезпечуе активне виведення Ca2+ у позакштинне середовище, е Ca2+ -помпа ПМ. На це опосередковано вказуе збшьшення ампл^уди струму Na+—Ca^-обмшу пiд впливом блокаторiв Ca2+,Mg2+-АТФази еозину Y та ортованадату [13], а прямi пiдтвердження ïï наявност у секреторних клiтинах дослiджуваних залоз одержали, використовуючи метод визначення Ca2+,Mg2+-АТФазноï активност клiтинних мембран [5]. Як виявилося, кл^инш мембрани слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. характеризуються Ca2+,Mg2+-АТФазною актившстю, яка становить 5,94±0,13 мкмоль Рн/мг бшка за 30 хв.(22,88±0,56% вщ загальноï АТФ-азноï активностi), Mg2+-АТФазною актившстю (7,33±0,26 мкмоль Рн/мг бiлка за 30 хв.) та
176
строфантинчутливою №,К-АТФазною актившстю (2,47±0,14 мкмоль Рн/мг бшка за 30 хв.). Як свiдчать результати дослщжень залежностi активностi Ca2+,Mg2+-АТФази кл^инних мембран слинних залоз вiд концентраци АТФ у середовищi шкубаци, вона е найвищою за наявностi 5 ммоль/л АТФ у середовищi шкубаци. Залежнiсть Mg2+-АТФазноl та №+,К+-АТФазно1 активност мала дещо iнший характер, що е свщченням того факту, що кл^инш мембрани характеризуються рiзною штенсившстю протiкання ферментативного гiдролiзу АТФ. Як показали дослщження залежностi мiж Са2+^2+-АТФазною активнiстю i вмiстом Са2+ у середовищi шкубаци, максимальний ефект спостер^ався при 0,1 ммоль/л Са2+ у середовищi шкубаци (3,90±0,13 мкмоль Рн/мг бшка за 30 хв). Вищi концентраци Са2+ пригнiчували Ca2+,Mg2+-АТФазну актившсть тканини слинних залоз.
Нами показано, що Са2+^2+-АТФазна активнiсть повнiстю пригшчувалася (Р<0,01, п = 6) тд впливом еозину Y (10мкмоль/л) та суттево зменшувалася пiд впливом бутилгщроксихшону у концентраци 25 мкмоль/л (на 68,62±2,96%, Р<0,001) i окситоцину у концентраци 100 мкмоль/л (на 65,74±13,50 Р<0,001). З цими даними добре узгоджуються результати вимiрювань сумарного вмкту Са2+ у тканинi залоз та рiвня секреци загального бiлка у присутност окситоцину та бутилгiдроксихiнону. Виявилося, що за таких умов обидва показники виразно збшьшувалися, що вказуе на пригшчення окситоцином та бутилгщроксихшоном Ca2+,Mg2+-АТФзноl активностi тканини залоз. З'ясувалося також, що бутилгiдроксихiнон викликав збшьшення вмiсту мембранозвязаного Са2+ у цих клггинах у 1,16 разiв.
Вщомо, що вхiд зовнiшньоклiтинного Са2+ створюе передумови для його вивiльнення з внутршньокл^инних депо i в першу чергу - з ЕПР. Внаслщок додавання кофешу, вiдомого активатора вившьнення Са2+ з ЕПР, у концентращях 1, 2, 4, 8, 10, i 15 ммоль/л до розчину з нормальним iонним складом виявили, що максимальний вмкт Са2+ у тканиш залоз i секрецiя загального бшка були за умови ди кофешу у концентраци 4 ммоль/л. Очевидно, що у даному випадку вмют Са2+ у тканинi залоз збшьшуеться завдяки змiнi функщонально1 активност Са2+ -помпи ПМ чи ендоплазматично! мембрани (ЕПР). Вiдносне зменшення цього показника тд впливом кофе1ну у високих концентращях (10-15 ммоль/л) та за наявност блокаторiв Са2+ помпи можна розщнити як опосередкований доказ наявност у дослiджуваних клiтинах рiанодинчутливих Ca2+-каналiв [6]. Рiанодин у концентраци 5 нмоль/л викликав зменшення, а у концентраци 500 нмоль/л - збшьшення вмкту Са2+ у тканиш залоз, що доводить наявшсть у секреторних кл^инах дослщжуваних слинних залоз рiанодинчутливих Ca2+-каналiв [1,9]. Переконливо доведено, що у мембран внутрiшньоклiтинних кальщевих депо функцiонують IФз-чутливi Са2-канали. З використанням еозину Y та рутенш червоного, блокатора Са2-унiпортера МХ, у МХ секреторних кл^ин слинних залоз личинки СЫгопотш plumosus L. iдентифiковано Ca2+-унiпортер, який, як з'ясувалося, транспортуе Са2+ у м^охондри в сташ спокою клiтини за вщсутност стимуляци, а не лише за високих концентрацш Са2+ у цитозолi [8].
177
Висновки. Отже, наведеш результати дослщжень е функцiональним пщтвердженням наявност у ПМ секреторних кл^ин слинно1 залози личинки Chironomus plumosus L. потенцiaлозaлежних Ca2+-кaнaлiв, Na+-Ca2+-обмiнникa, Са2-помпи , а також Ca2+-уншортерa м^охондрш та рiaнодин- i 1Фз-чутливих канашв вивiльнення Ca2+ з депо, яю забезпечують пiдтримaння
ГЛ 2+ 5
внутршньокштинного гомеостазу кaтiонiв Ca у зв язку з ix участю у регуляцil секреторного процесу.
Л1тература
1. Бичкова С.В., Манько В.В. Рiaнодинiндуковaне вившьнення
Ca2+ у
секреторних клiтинaх слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. // Вкник Львiв. ун-ту. Сер.бiол. - 2004. - Вип.35. - С.244-250.
2. Гринькив М.Я., Клевец М.Ю., Шостаковская И.В. Роль кальция в экструзии пищеварительных ферментов ацинарными клетками поджелудочной железы //Физиол. журн. - 1988. - Т.34, №2. - С.13-18.
3. Клевец М.Ю., Гураль З.В. Идентификация активируемого деполяризацией кальциевого тока мембраны секреторных клеток // Физиол. журн. - 1990. - Т.36, №2. - С.102-104.
4. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Вплив блокaторiв потенщалозалежних кальщевих кaнaлiв на стимульовaнiй гiперкaлiевою деполяризaцiею вхiд Ca2+ у кл^ини екзокринних залоз та 1х секреторну вщповщь // Галицький лiкaрський вкник. - 1998. - Т.5, №3. - С.46-48.
5. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Дослщження активного транспорту Ca2+ у секреторних кл^инах слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. // Бюлопя тварин. - 2000. - Т. 2, №1. - С.92-97.
6. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Вплив кофешу на Ca2+-транспортш системи секреторних кл^ин слинно! залози личинки Chironomus plumosus L. // Експериментальна та клЫчна фiзiологiя i бiохiмiя. - 1999. - Т.8, №4. - С.49-53.
7. Манько В.В., Король Т.В., Клевець М.Ю., Демюв О.Т. Дослщження Ca2+-трaнспортних систем секреторних клiтин екзокринних залоз з використанням хлортетрациклшу // Вкн. Харк. ун-ту, №488. Бiофiзичний вiсник. - 2000. - Вип. 6(1). - С. 79-81.
8. Манько В.В., Стельмах С.В. Вплив рутенш червоного на вмкт
Ca2+
у тканиш слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. // Вкник Львiв. ун-ту. Сер. бюл. - 2002. - Вип.29. - С. 171-176.
9. Манько В.В., Бичкова С.В., Клевець М.Ю. ¡дентифкащя кaнaлiв вившьнення Ca2+ в секреторних клiтинaх слинних залоз личинки комара-дергуна // Укр. бiохiм. журн. - 2004. - Т.76, №1. - С. 65-71.
10. Манько В.В. Системи трансмембранного транспортування кальцш у секреторних кл^инах слинних залоз личинки Chironomus plumosus Linnaeus: Автореф. дис. ... доктора бюл. наук: 03.00.13 / Кшвський нацюнальний ун-т iменi Тараса Шевченка. - К. : 2008. - 43 с.
178
11. Федiрко Н.В. Характеристика струму та властивостей Na+-Ca2+-обмшу мембрани секреторних клггин: Автореф. дис. ... канд. бюл. наук:03.00.13 / Кшвський ун-т iменi Тараса Шевченка. - К.: 1997. - 18 с.
12. Ambudkar I.S. Regulattion of calcium in salivary gland secretion // Critical revlews in oral biology 2 medicine. - 2000. - Vol. 11. - P. 4-25.
13. Park M.K., Ashby M.C., Erdemit G. et al. Perinuclear, perigranular and subplasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport // EMBO J. - 2001 ac. - Vol. 20, №8. - P. 1863-1874.
14. Petersen O.H. The functional organization of calcium signaling in exocrine acinar cells // J. Korean. Med. Sci. - 2000. - Vol. 15P. S 44-S45.
Summary Korol T.V.
FUNCTIONAL CONFIRMATION OF CA2TRANSPORTATION MEMBRANE SYSTEMS EXISTENCE IN CHIRONOMUS PLUMOSUS L.
LARVAE'S SALIVARY GLAND CELLS IN CONNECTION WITH THEIR SECRETION ACTIVITY
Investigation of Ca2+ role as a second messenger is a very important problem of modern physiology. It has been established that extra- and intracellular Ca2+ take part in activation of secretion. Periodical Ca2+ oscillations in gland cells cytoplasma is a necessary condition for all the stages of the secretion process realization and is provided by the functioning of the plasma membrane and intracellular store membrane Ca2+-transport systems.
Key words: potentialdependent Ca2+-channels, Na+—Ca2+-exchanger, Ca2+,Mg2+-ATPase, RyRs, InsPRs, Ca2+-uniporter.
Стаття надшшла до редакцИ 10.04.2009
179
