CC BY
18обнаруживали маркеры вирусных гепатитов В и С. Средние уровни АсАТ и АлАТ были равны 364+52 и 376+97 МЕ/л, ЩФ и ГГТ - 569+313 и 114+47 МЕ/л соответственно. Содержание CD4-лимфоцитов у пациентов этой группы было наибольшим - 270+37 клеток в 1 мкл.
Помимо вышеуказанных групп у 3-х пациентов (4,8%) поражение печени было обусловлено развитием токсоплазмоза. Обращало на себя внимание большое количество токсоплазменных цист в синусоидах и паренхиме печени среди фокусов коагуляционных некрозов. У 2-х пациентов патология печени была связана с криптококкозом и характеризовалась большой площадью поражения, наличием множества молодых форм криптококка и слабо выраженной воспалительной реакцией. В 1 наблюдении имела место генерализованная кандидозная инфекция с гранулема-тозом и микроабсцессами печени. В 2-х случаях гепатит развился вследствие септического процесса бактериальной этиологии. Количество СВ4-лимфоцитов у данных пациентов колебалось в пределах 10-50 клеток в 1 мкл. и лишь у 1-го пациента с бактериальным сепсисом оно было равно 110 клеткам в 1 мкл. Уровни АсАТ и АлАТ у большинства пациентов были повышены умеренно (100-250 МЕ/л) и только у пациента с бактериальным сепсисом были более чем в 10 раз выше верхней границы нормы (420 и 440 МЕ/л).
Кроме того, у 4-х пациентов (6,5%) зарегистрирован гранулематозный гепатит не установленной этиологии, в 2-х случаях - с диффузным поражением паренхимы печени.
Заключение. У больных ВИЧ-инфекцией, помимо широко распространенных заболеваний печени, обусловленных вирусами гепатитов А, В, С, D, имеют место поражения, связанные с тяжелыми вторичными заболеваниями (ЦМВ-инфекция, туберкулез, саркома Капоши, токсоплазмоз и другие), которые, как правило, диагностируются на поздних стадиях ВИЧ-инфекции. Среди вторичных заболеваний у ВИЧ-инфицированных больных наиболее часто патологию печени вызывают микобактерии и цитомегаловирус. У большинства пациентов выявляют одновременно несколько тяжелых вторичных патологий (ЦМВИ+СК, туберкулез + ЦМВИ, СК + криптококкоз и др.), что существенно затрудняет расшифровку этиологии поражения печени, которая часто устанавливается только при аутопсии. Необходимо отметить, что у больных ВИЧ-инфекцией симптомы поражения печени в большинстве случаев были не выражены и не являлись ведущими в клинической картине вторичного заболевания. Изменение уровней биохимических параметров крови пациентов, имевших поражение печени, обусловленное вторичным заболеванием, было умеренным. Вместе с тем, у лиц, страдающих манифестной ЦМВ-инфекцией, повышение уровня ГГТ было максимальным, что, возможно, связано с вне- и внутрипеченочным склерозирующим холангитом, характерным для этого заболевания.
У ряда пациентов поражение печени было обусловлено токсическим воздействием: злоупотребление алкоголем, прием лекарственных препаратов (рифампицин, изониазид и другие).
В.И.. Шахгильдян, А.В. Кравченко, О.А. Тишкевич, Федеральный научно-методический центр профилактики и борьбы со СПИДМЗ РФ, Инфекционная клиническая больница №2, г. Москва.
БЫСТРЫЕ МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С с ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНАЛИЗА КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИ-МОРФИЗМА ОДИНОЧНЫХ ЦЕПЕЙ ДНК и ГЕТЕРОДУПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА. Введение: В
настоящее время в Российской Федерации насчитывается от 3 до 5 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС). Каждый год в нашей стране регистрируется более 30 000 случаев острого гепатита С ( показатель заболеваемости за 2000 г. - 20,73/100 000 населения) и свыше 55 000 вновь выявленных случаев хронического гепатита С (38,09/100 000) [Здоровье населения и среда обитания (ЗНиСО). Ежемесячный бюллетень Госсанэпиднадзора МЗ РФ 2001, 1:34.1].
Характерными чертами данной этиологической формы гепатита являются высокий уровень хронизации инфекции (80%), существование длительного периода бессимптомного течения у большинства хронически инфицированных и выраженная связь с развитием тяжёлых
отдалённых последствий у таких больных - цирроза печени (в 20% случаев) и гепатоклеточной карциномы (2-3%) [SeeffL.B., 1999.].
Различные системы классификации выделяют шесть и более генотипов вируса, каждый из которых представлен несколькими подтипами [Simmonds P. et al., 1997, Robertson В. et al., 1998, Virus Taxonomy - Classification and Nomenclature of Viruses: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, 2000]. ВГС демонстрирует уникальную для вирусов гепатитов генетическую вариабельность, которая проявляется в гетерогенности вирусной популяции у инфицированного индивида (наличие так называемых квазивидов), и, на уровне эпидемических процессов, в существовании генотипов ВГС. Исследование генотипического разнообразия изолятов ВГС, циркулирующих на определённой территории, необходимо для полноты понимания эпидемического процесса при данной инфекции (очага, механизмов передачи, восприимчивого коллектива), а также для совершенствования диагностики.
Получены данные о различной чувствительности разных генотипов ВГС к противовирусной терапии [Diamantis I. et a!,, 1998; Hanley J.P. et al., 1996; Mizokami M. 1996; Tsubota A. et al., 1994], причём генотип Ib более устойчив к лечению препаратами интерферона, чем другие генотипы [Zein N.N., 2000]. В связи с этим, генотипирование вирусных изолятов приобрело важное значение для выбора режима терапии [Koff R.S., 1999; Teuber G. et al., 2000] и прогноза эффективности лечения [Mondelli M.U. and Silini E., 1999; Weiland O. et al., 1999]. В настоящее время коммерчески доступны наборы для генотипирования, использующие серологические подходы [Круглов И.В. и др., 2000; Pawlotsky J.M. et al., 1997] либо генотип-специфические различия в нуклеотидных последовательностях генома ВГС. К первой группе относятся набор Murex HCV Serotyping 1-6 Assay (Murex Diagnostics) и мультипептидная тест-система для выявления генотип-специфических антител к ВГС производства НПП Аквапаст (ЭПР 018 СП-99, НПП Аквапаст, Санкт-Петербург). Ко второй группе относится набор INNO-LiPA HCV II (Innogenetics. Belgium), в котором генотипирование изолятов ВГС проводится путём дифференциальной гибридизации продуктов амплификации области 5'-UTR вирусного генома с типоспецифичными зондами [Stuyver L. et al. ,1993].
Помимо использования коммерчески доступных наборов, используются лабораторные системы для генотипирования, опирающиеся на амплификацию с типоспецифическими праймерами [Okamoto H., 1996], исследование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (RFLP) [Khan R.U. et al., 1997; Pohjanpelto P. et al., 1996; Pujol F.H. et al., 1997], конформационно-специфический гидролиз одноцепочечных фрагментов ДНК (CFLP) [Marshall
D.J. et al., 1997], гетеродуплексный анализ (НМА) [37], метод исследования конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) [Lareu R.R. et al., 1997; Lee J.H. et al., 1997; Ильина Е.Н., и др., 1999], прямое секвенирование продуктов амплификации [Doglio A. et al., 1998; Holland J. et al., 1998], дидеокси-фингерпринт [Fox S.A. et al., 1995].
К числу самых простых в технологическом отношении и удобных для целей массового скрининга относится методы SSCP и НМА. Данные методы не требуют специального оборудования, дорогостоящих реактивов и вполне пригодны для рутинного использования в любой лаборатории, где гель-электрофорез нуклеиновых кислот является обычной практикой. Метод SSCP был успешно использован для генотипирования изолятов ВГС как зарубежными [Lareu R.R. et al., 1997], так и российскими авторами [Ильина Е.Н., и др., 1999], В работе
E.Н.Ильиной с соавторами [1999] проводили амплификацию с радиоактивно-меченными праймерами, и для визуализации картин электрофоретического разделения использовали радиоавтографию. Применение радиоактивных изотопов является нежелательным моментом, в особенности для клинико-диагностических лабораторий.
В данной статье отработаны и приведены простые протоколы SSCP и НМА, в которых для визуализации результатов гель-электрофореза используется окрашивание геля бромистым этидием. Эти протоколы пригодны для генотипирования изолятов ВГС путём анализа продуктов амплификации области 5'-UTR в тестах SSCP и НМА и позволяют получать хорошо воспроизводимые и легко интерпретируемые результаты.
MA ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Сыворотки крови и иммуноферментный анализ (ИФА), За период с 1996 по 1999 гг. проводили обследование сотрудников (врачи и младший медицинский персонал) и пациентов двух крупных больниц Новосибирской области: Областной Клинической больницы г. Новосибирска, Центральной Районной больницы г. Искитима, Муниципальной Клинической Инфекционной больницы. Взятие крови у испытуемых производилось из локтевой вены с помощью одноразовой системы "Вакутайнер" (производства "Бектон Дикинсон", Германия). Все сыворотки исследовали методом ИФА с использованием диагностических тест-систем "РекомбиБест анти-ВГС IgG" (ФС 42-3157-95, ЗАО "Вектор-Бест", пос. Кольцове, Новосибирская обл., РФ) и "ГепаСкрин" (ЗАО "Вектор-МайСтар", пос. Кольцове, Новосибирская обл.. РФ).
Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). Методом ОТ-ПЦР исследовали только сыворотки, содержащие антитела к антигенам ВГС по данным ИФА. Процедуры проводили как описано в нашей работе [Шустов А.В. и др., 2000]. Суммарные РНК. выделенные из 50 мкл сыворотки, подвергали обратной транскрипции с использованием статистического праймера (Promega, США) и обратной транскриптазы Mo-MLV (Amersham, США). Для обнаружения в пробах вирусспецифических кДНК проводили ПЦР с праймерами, фланкирующими район 5'-нетранслируемой области (5'-UTR) генома ВГС [Stuyver L. et al., 1993]. Использовали пару праймеров S50+AS52 на первом раунде и S51+AS53 - на втором (Табл.1).
Таблица 1.
Праймеры для амплификации фрагментов генома ВГС.
Код Последовательность (5-3') Область генома Раунд Ориентация/ Позиция ', нт Tann 2, 0C
S50 AS52 CCCTGTGAGGAACTWCTGT CTTCACGC GGTGCACGGTCTACGAGAC ст 5'-UTR I I S (-299)-(-273) AS(-21)-(-l) 55
S51 AS53 TCTAGCCATGGCGTTAGTRY GAGTGT CACTCGCAAGCACCCTATC AGGCAGT II II S (-264)-(-239) AS (-54)-(-29) 55
1 Ориентация: Б - сене, АБ - антисенс. Указаны положения 5г-и З'-концов праймеров на геноме ИСУ-1 (нумерация: А в инициирующем кодоне АТО имеет позицию +1);
2 Tann - Экспериментально подобранная оптимальная температура отжига.
Детекция и очистка продуктов ПЦР. Аликвоты реакционных смесей ПЦР (5 мкл), содержащих продукты амплификации, подвергали электрофорезу в 6% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем IX ТАЕ (20 мМ трис-гидроксиметиламинометан, 20 мМ СН3СООН, 1 мМ ЭДТА). Гели окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ свете. Для очистки продукта амплификации участки геля, содержащие фрагменты ДНК ожидаемого размера, вырезали из гелевой пластины и измельчали гель путём центрифугирования через носик в 1.5 мл пробирку. К измельчённому гелю добавляли 600 мкл буфера для пассивной элюции (0,5 М ацетат аммония, 0.01 М MgCl2, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS), перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем к смеси добавляли 600 мкл фенола (уравновешенного при рН 8,0) и 200 мкл 70% этанола, перемешивали и центрифугировали в течение 5 мин при 14000 об/мин. В данных условиях происходит разделение водной и органической фаз, причём кусочки ПААГ остаются на дне пробирки, что позволяет отобрать водную фазу, не захватывая акриламид. Водную фазу отбирали в новую пробирку, экстрагировали равным объёмом хлороформа, добавляли к ней 20 мкг гликогена и ацетата
натрия до О.ЗМ и осаждали ДНК равным объёмом изопропилового спирта. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в 10 мкл воды.
Определение нуклеотидньх последовательностей. Все продукты амплификации были секвенированы по обеим цепям, что позволило генотипировать выявленные изоляты ВГС. Нуклеотидные последовательности продуктов амплификации определяли методом Сэнгера с использованием ДНК-полимеразы Taq [KrefZ, К. et al., 1994]. Секвенирование продуктов ПЦР проводили по обеим цепям. Полученные данные сравнивали с последовательностями прототипных изолятов ВГС с использованием программы ClustalX и пакета PHYLIP [Felsenstein 1,1989]
Исследование конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP). Для проведения анализа SSCP 5 мкл реакционной смеси ПЦР, содержащей продукты амплификации 5'-UTR, смешивали с 10 мкл буфера для денатурации (95% формамид, 0,05% бромфеноловый синий) и инкубировали при 95 С в течение 5 мин, после чего немедленно охлаждали во льду. Денатурированные продукты амплификации подвергали электрофорезу в ПААГ, содержащем 0,5Х ТВЕ (44,5 мМ трис-гидроксиметиламинометан, 44,5 мМ борной кислоты, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3) и 5% глицерина. Для разделения использовали ПААГ с различными концентрациями акрил амида (С) и отношением бис-акриламид/акриламид (Т). Оптимальным было признано соотношение: С=10%, Т=1%. Использовали гели размером 10см X 8,5см X 0,8мм. Электрофорез проводили при температуре 8° С, напряжении 200 В в течение 4-5 ч. Гель окрашивали бромидом этидия и визуализировали ДНК в УФ свете.
В каждом эксперименте вместе с экспериментальными пробами исследовали т.н. "генотипические контроли". В качестве генотипических контролен использовали секвенированные и генотипированные продукты амплификации 5'-UTR трёх генотипов (1Ь, 2а/2с и За), полученные с использованием тех же пар праймеров, что и экспериментальные пробы. Генотипические контроли и экспериментальные пробы подвергали денатурации-отжигу в одинаковых условиях. Кроме этого, для удобства описания картины результатов электрофореза вместе с экспериментальными пробами и генотипическими контролями электрофорезу подвергали маркёр молекулярных масс (гидролизат pBR322 по сайтам Mspl); маркер денатурации не подвергали. Следует заметать, что подвижность одиночных цепей ДНК по отношению к маркёру зависит от времени электрофореза и может отличаться от эксперимента к эксперименту.
Генотипирование изолятов ВГС по результатам SSCP проводили путём сравнения электрофоретических дорожек экспериментальных проб с дорожками генотипических контролен.
Проведение гетеродуплексного анализа (НМЛ). Для проведения гетеродуплексного анализа в три пробирки, подписанные с указанием генотипов 1, 2 и 3, вносили по 2-5 мкл генотипического контроля соответствующего генотипа. В каждую из трёх пробирок вносили равный обьём экспериментальной пробы (продукты амплификации 5'-UTR). К смесям (проба+генотипический контроль) добавляли по 2 мкл буфера для нанесения образцов на гель (50% глицерин, 0.02% бромфеноловый синий) и воду до финального объёма 10 мкл. Нуклеотидный материал денатурировали при 95° С в течение 5 мин, затем температуру снижали по следующей программе: 5 мин при 60° С, 5 мин при 40° С, 5 мин при 30° С. Подготовленные таким образом пробы подвергали электрофорезу в 6% ПААГ, содержащем IX ТАЕ. Использовали гели размером 10см X 8,5см X 0,8мм. Электрофорез проводили при комнатной температуре, при напряжении 200 В в течение 1 часа. Разделившиеся гомо- и гетеродуплексы визуализировали прокрашиванием ДНК бромидом этидия и фотографировали в УФ свете. Для генотипирования вирусных изолятов сравнивали электрофоретические дорожки, относящиеся к одной экспериментальной пробе и генотипическим контролям трёх различных генотипов ВГС (подтипы 1b, 2а/2с, За). Выявляли дорожки, не содержащие полосы гетеродуплексов, что означает совпадение генотипов экспериментальной пробы и использованного генотипического контроля.
РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Генотипирование изолятов ВГСметодом SSCP. Методом ББСР было исследовано 24 продукта амплификации области 5'-иТЯ ВГС. Результаты одного из типичных экспериментов по 88СР приведены на рисунке 1.
Рисунок 1.
SSCP продуктов амплификации 5'-UTR генома ВГС.
М - маркёр молекулярных масс (гидролизат pBR322 по сайтам Mspl).
1-3 - генотипические контроли (генотипы 1b, 2а/2с, За соответственно)
4, 5, 7, 9,10, 12, 14 - пробы генотипа 1b;
6, 11 - пробы генотипа 2а/2с;
3, 8, 13, 15 - пробы генотипа За.
Принцип метода SSCP основан на выявлении различий в электрофоретических подвижностях конформационных форм одноцепочечных молекул ДНК [Hayashi К., Yandell D.W., 1993; Nataraj A.J. et al., 1999; Rolfs A. et al., 1992]. Различные конформационные формы вьывляются как расположенные определённым образом, различающиеся по интенсивности полосы (бэнды). Интерес для генотипирования представляют так называемые "основные" полосы, которые являются генотип-специфическими, отличаются высокой интенсивностью и при сохранении неизменными условий проведения теста воспроизводятся от эксперимента к эксперименту для каждой пробы. Помимо "основных" полос в отдельных пробах возможно появление "дополнительных" полос, усложняющих картину результатов электрофореза и затрудняющих сравнение проб между собой. Мы наблюдали "дополнительные" полосы преимущественно в экспериментальных пробах, которые по данным предварительного аналитического электрофореза (без денатурации) содержали кроме специфического продукта побочные продукты амплификации. Когда для исследования методом SSCP брали продукты амплификации, очищенные гель-электрофорезом и элюцией, "дополнительные" полосы не наблюдались.
В описанных нами условиях при исследовании методом SSCP продуктов амплификации с праймерами S50-AS52 (Таблица 1) к числу "основных" полос относится полоса в области 300 Ьр, полосы в области 700 - 900 Ьр, а для генотипа 3 - также полоса в области 600 Ър (здесь и далее положения полос указаны относительно не подвергавшегося денатурации и отжигу маркёра молекулярных масс). "Основная" полоса в области приблизительно 300 Ьр соответствует по размеру продукту амплификации S50-AS52 (Таблица 1). Появление данной полосы мы связываем с частичной ренатурацией продукта амплификации и образованием
дуплексов, которые при проведении электрофореза в ПААГ движутся быстрее одноцепочечных продуктов. Существенно то обстоятельство, что подвижность указанной полосы при электрофорезе в подобранных нами условиях (ПААГ с С=10%, Т=1%, содержащий 0,5Х ТВЕ и 5% глицерин) была различна для продуктов амплификации 5'-иТЯ различных генотипов, что оказалось полезным для генотипирования проб. Результаты секвенирования продуктов амплификации показали, что во всех случаях мы подвергали исследованию методом 88СР фрагменты 5'-ИТЯ, относящиеся к какому-либо одному из трёх встречающихся на территории Западной Сибири субтипов вируса: 1Ь, 2а/2с и За. Воспроизводимые и хорошо заметные отличия в электрофоретической подвижности фрагмента из области 300 Ър при 88СР-анализе продуктов амплификации 850-А852 были выявлены для всех трёх исследованных субтипов ВГС. Максимальная подвижность данного фрагмента наблюдалась для субтипа 1Ь, минимальная - для субтипа 2а/2с.
Таблица 2.
Сравнение результатов генотипирования изолятов ВГС методами SSCP и
секвенирования в ПЦР.
№ пробы Генотип по нуклеотидной последовательности 5'-иТЯ Генотип по 88СР
Я46 2а/2с 2а
Я78 За За
Я101 1Ь 1Ь
Я131 1Ь 1Ь
Ш45 2а/2с 2а
Я178 1Ь 1Ь?
Ш98 За За
И227 1Ь 1Ь
Я240 1Ь 1Ь
И267 1Ь 1Ь
Я296 2а/2с 2а
Я300 2а/2с 2а
Я357 1Ь 1Ь
Я365 1Ь 1Ь
Я466 1Ь 1Ь
Я483 2а/2с 2а
Я646 1Ь 1Ь
Я902 2а/2с 2а
Я971 1Ь 1Ь
Я982 2а/2с 2а
Я1П5 1Ь 1Ь
Ю172 2а/2с 2а
НС-ТАЗ 1Ь 2а?
НСКА2 1Ь 1Ь
В области 700 - 900 Ьр для всех трёх исследованных нами субтипов ВГС наблюдали сложный рисунок полос. Данные полосы, видимо, соответствуют различным конформациям одиночных цепей ДНК. Рисунок полос в области 700 - 900 Ьр воспроизводим для каждой пробы от эксперимента к эксперименту и содержит генотип-специфические полосы, однако последние по интенсивности всегда значительно слабее, чем бэнд в области 300 Ьр, и могут различаться по интенсивности в пробах одного и того же генотипа. Данное обстоятельство затрудняет использование рисунка полос в области 700 - 900 Ьр для генотипирования изолятов ВГС путём сравнения электрофоретических дорожек экспериментальных проб с дорожками генотипических контролей. Это связано с использованием для прокрашивания геля бромистого этидия, который имеет низкое связывание с одноцепочечными участками ДНК, что не позволяет получить достаточно чёткую картину.
Полосу 600 Ьр мы наблюдали только в пробах продуктов амплификации 850-А852 генотипа 3 (подтип 3а). Наличие данного бэнда отличает пробы генотипа 3 от проб других
генотипов ВГС (lb, 2a/2), причём указанное отличие наблюдается воспроизводимым образом от пробы к пробе и от эксперимента к эксперименту, что было использовано нами для генотипирования.
Из литературных данных известно, что рисунок полос, наблюдаемый в SSCP-анализе, существенным образом зависит от ряда факторов: длины и первичной структуры фрагментов ДНК, химического состава проб, композиции геля, условий подготовки проб и проведения электрофореза [Hayashi К., Yandell D.W., 1993; Holland J. et al., 1998; Okamoto H., 1996].
Мы исследовали влияние некоторых из выше указанных параметров и подобрали оптимальные условия проведения SSCP-анализа для продуктов амплификации области 5'-UTR генома ВГС с целью генотипрования вирусных изолятов.
Влияние концентрации ДНК в пробе на качество SSCP. Оказалось, что количество продукта амплификации в пробах, подвергаемых анализу SSCP, существенным образом сказывается на качестве получаемой картины. Оптимальная концентрация ДНК в пробе была определена экспериментально. Наилучшие результаты были получены, когда содержание ДНК в пробе было в пределах 125-250 нг. В пробах с содержанием ДНК меньше 100 нг визуализация полос в областях 700 - 900 и 600 Ьр (предположительно, соответствующих различным конформациям одиночных цепей ДНК) была затруднена. Данное обстоятельство, вероятно, связано с использованием для окрашивания гелей бромистого этидия, который плохо связывается с одноцепочечиыми участками ДНК. Поэтому в наших условиях для лучшей визуализации конформационных форм одиночных цепей необходимо использовать достаточное (>150 нг) количество исходного продукта амплификации.
Влияние условий денатурации. Поскольку степень денатурации-ренатурации продукта амплификации в процессе подготовки пробы зависит от условий проведения процесса, мы исследовали влияние химического состава буфера для амплификации (содержание катионов калия и магния, анионов) и различных температурных режимов на качество картин электрофореза в SSCP-анализе. В протоколах по проведению SSCP, описанных в литературе, в состав буфера для денатурации иногда включают ЭДТА. Теоретически, присутствие ЭДТА в концентрации до 20 мМ может улучшить чёткость полос в SSCP за счёт способности ЭДТА связывать двухвалентные катионы. В наших исследованиях картины электрофоретического разделения в SSCP-анализе закономерно лучше получались в экспериментах, когда для денатурации проб использовали буфер без ЭДТА, чем в случаях, когда денатурирующий буфер содержал ЭДТА (состав последнего: 95% формамид, 0,05% бромфеноловый синий, 20 мМ ЭДТА). При исследовании в SSCP-анализе проб генотипа 3 фрагмент 600 Ьр был ярким и чётким только в случае использования денатурирующего буфера без ЭДТА. Данный факт можно объяснить стабилизацией ионами Mg2+ определённой конформационной формы продукта амплификации S50-AS52, которая имеет при электрофорезе в подобранных нами условиях промежуточную подвижность, между подвижностями двухцепочечной и одноцепочечных форм.
Температура и продолжительность этапа денатурации также оказывали существенное влияние на наблюдаемую в SSCP картину полос. При использовании температуры денатурации ниже 95° С мы получали картины электрофоретического разделения с нечёткими полосами, что, по-видимому, связано с неполной денатурацией продукта амплификации. Оптимальное разделение наблюдали, когда пробы денатурировали при температуре 95° С в течение 5 минут. Кроме этого, важное значение имеет скорость охлаждения проб (отжига): по истечении времени тепловой денатурации пробы следует немедленно переносить в лёд и, по возможности, быстро наносить на гель для электрофореза.
Влияние условий проведения электрофореза. Мы изучали влияние на подвижность фрагментов ДНК в SSCP-электрофорезе следующих факторов: концентрации акриламида, отношения бисакриламид/акриламид, содержания глицерина, продолжительности электрофореза и напряжения электрофореза.
При сравнении ПААГ с концентрацией акриламида 6%, 8%, 10% и 14% (и одинаковым отношением бисакриламид/акриламид Т=1%) наилучшая разрешающая способность в SSCP-анализе наблюдалась для 10%-ого геля. Эта концентрация была выбрана нами в качестве оптимальной. Снижение концентрации акриламида ниже 8% приводило к сжатию "разбега"
полос SSCP в областях 700 - 900 Ър и 300 Ър, что затрудняло сравнение экспериментальных проб с контролями. Повышение концентрации акриламида до 14% увеличивало время проведения электрофореза, что является нежелательным моментом, поскольку приводит к уширению бэндов за счёт диффузии и частичной ренатурации. Изменение отношения бисакриламид/акриламид в сторону увеличения жёсткости геля (до Т=2%, при общей концентрации акриламида 10%) уменьшало различия в подвижности фрагментов 300 Ьр между пробами разных генотипов.
В качестве необходимого компонента в состав геля для проведения SSCP часто включают глицерин. Наши эксперименты с варьированием содержания глицерина в геле от 0% до 10% показали, что увеличение концентрации глицерина закономерно снижает электрофоретическую подвижность как фрагментов в области 600 Ьр (предположительно, одноцепочечных форм), так и фрагментов 300 Ьр (двухцепочечной формы). При этом также становятся более заметными различия в электрофоретических подвижностях отдельных конформационных форм одиночных цепей ДНК. В качестве оптимальной нами была выбрана концентрация глицерина в геле 5%. Дальнейшее повышение содержания глицерина до 10% приводило к уменьшению различий в подвижности различных конформационных форм одиночных цепей.
Влияние присутствия в пробе олигонуклеотидных праймеров на картину полос SSCP. В одной из работ [Holland J. et al., 1998], посвящённой оптимизации условий проведения SSCP, изучалось влияние присутствия в пробах олигонуклеотидных праймеров на получаемые результаты. Было выяснено, что добавление к пробам перед денатурацией и отжигом достаточно длинных (12-мерных) олигонуклеотидов, способных гибридизоваться с одиночными цепями продукта амплификации, приводит к стабилизации некоторых выделенных конформаций одиночных цепей. При этом достигается большая чёткость полос в SSCP-анализе и элиминируются "дополнительные" полосы. Кроме этого, в работе [Holland J. et al., 1998] высказано предположение, что присутствие в пробах для анализа методом SSCP остатка не прореагировавших праймеров, происходящих из реакционной смеси для ПЦР, оказывает влияние на результаты SSCP и может быть причиной низкой воспроизводимости экспериментов по SSCP от лаборатории к лаборатории. Мы исследовали данный вопрос путём добавления к пробам, предназначенным для анализа в SSCP, большого молярного избытка праймеров. К продукту амплификации (как очищенному, так и в составе реакционной смеси после ПЦР), полученному с использованием внешней пары праймеров (S50 и AS52), добавляли один из внутренних праймеров (S51 либо AS53). После этого пробы денатурировали и подвергали электрофорезу для SSCP в подобранных нами оптимальных условиях. Каждый из внутренних праймеров добавляли до конечной концентрации 0,3 о.е./мл (примерно в 3 раза превышает рабочую концентрацию любого из выше приведённых праймеров в реакционной смеси для ПЦР). Результаты проведённых экспериментов показали существенное влияние добавления праймеров, соответствующих по структуре внутренним областям продукта амплификации, на вид полос ж их взаимное положение в получаемой картине SSCP. При добавлении любого из праймеров S51 или AS53 к пробам для SSCP наблюдаемые в геле полосы фрагментов ДНК становились более чёткими. В остальном влияние праймеров S51 и AS53 на паттерны SSCP было различно. Добавление праймера S51 не приводило к изменению картины распределения полос (по сравнению с пробами без добавления праймеров), в то время как добавление праймера AS53 уменьшало подвижность одной из одноцепочечных форм из области 700 - 900 Ьр. Добавление праймера AS53 к пробам продукта амплификации 5'-UTR подтипа За приводило к исчезновению полосы 600 Ьр, что затрудняло генотипироваиие. Таким образом, присутствие в пробах для анализа методом SSCP избыточного количества олигонуклеотидных праймеров может оказывать существенное влияние на результаты SSCP-анализа. Мы рекомендуем в тех случаях, когда для проведения SSCP используются неочищенные реакционные смеси ПЦР, проводить несколько предварительных экспериментов, варьируя содержание праймеров в реакционной смеси. Описанный нами метод пассивной элюции позволяет получать с большим выходом очищенный продукт амплификации, пригодный для проведения экспериментов по SSCP,
Таким образом, описанные нами условия проведения анализа 88СР продуктов амплификации З'-ШЯ позволяют генотипировать изоляты ВГС, относящиеся к трём основным для Российской Федерации генотипам вируса: 1, 2 и 3.
С целью оценки правильности генотипирования изолятов ВГС по разработанной нами методике 88СР-анализа мы сравнили данные, полученные методом 88СР и посредством прямого секвенирования продуктов амплификации по обеим цепям (Таблица 2). Представленные в таблице 2 данные показывают почти полное совпадение результатов генотипирования изолятов ВГС двумя использованными методами. Из 24-х исследованных методом 88СР образцов 22 (91,7%) образца были правильно и однозначно генотипированы данным методом. Один образец (Я178, Таблица 2) показал в 88СР-анализе рисунок полос, характерный для субтипа 1Ь, но отличавшийся от последнего наличием "дополнительной" полосы в районе 300 Ьр. Появление "дополнительного" бэнда не было связано с присутствием в пробе Я178 побочных продуктов амплификации, поскольку его появление мы наблюдали и в случае использования для 88СР-анализа продукта амплификации, очищенного гель-электрофорезом и элюцией. Другой изолят (НС-ТАЗ) при генотипировании методом 88СР демонстрировал сходство с генотипом 2, однако секвенирование выявило уникальную структуру продукта амплификации НС-ТАЗ. Нуклеотидная последовательность изолята НС-ТАЗ оказалась сходной с последовательностями прототипных изолятов ВГС подтипа 1Ь, но отличалась от них наличием однобуквенной инсерции А в положении -136 (положения рассчитаны по структуре прототипного изолята ИСУ-1; нумерация предусматривает, что А в инициирующем кодоне АТС имеет позицию +1).
Резюмируя полученные нами результаты, следует заключить, что метод 88СР имеет следующие достоинства: низкая трудоёмкость выполнения теста, сравнительно высокие скорость получения результатов (4-5 ч.) и пропускная способность теста, минимальные требования к аппаратному обеспечению метода. К недостаткам метода 88СР следует отнести, прежде всего, требовательность к чистоте экспериментальных проб (отсутствие в них побочных продуктов амплификации), к количеству специфического продукта амплификации в пробе (не менее 150 нг), а также сложность в интерпретации происхождения конкретных полос и высокую чувствительность к качеству реактивов для электрофореза и условиям проведения процесса.
Гетеродуплексный анализ. На рисунке 2 представлены результаты типичного эксперимента по генотипированию изолятов ВГС с использованием гетеродуплексного анализа. На Рисунке 2 каждой экспериментальной пробе соответствуют три электрофоретические дорожки, соответствующие смесям (проба + генотипический контроль известного генотипа). В случае совпадения генотипов экспериментальной пробы и генотипического контроля на этапе денатурации-отжига формируется только гомодуплекс и в геле наблюдается одна полоса. При несовпадении генотипов изолятов ВГС из пробы и генотипического контроля наряду с гомодуплексами ожидаемой подвижности формируются гетеродуплексы с меньшей электрофоретической подвижностью. Подвижность гетеродуплексов (относительно подвижности гомодуплекса) для большинства изолятов ВГС оказалась зависящей только от сочетания генотипов экспериментальной пробы и генотипического контроля. Для ряда изученных нами изолятов ВГС, имевших отличия в структуре 5'-ИТЯ (инсерция), подвижность гетеродуплексов оказалась аномальной. Различные эксперименты по оптимизации проведения НМА показали слабую зависимость получаемых результатов от условий проведения процесса (что радикально отличает метод НМА от метода 88СР). Существенными требованиями в случае проведения анализа методом НМА оказались только чистота экспериментальных проб (отсутствие в них побочных продуктов амплификации) и совпадение количеств смешиваемых специфических продуктов амплификации 5'-ИТЯ из экспериментальной пробы и из генотипического контроля. В случае существенно различающихся количеств ДНК в пробе и в контроле визуализация бэндов гетеродуплексов становится затруднительной.
Рисунок 2.
НМЛ анализ продуктов амплификации 5'-UTR генома ВГС. Показаны результаты электрофореза термоденатурированных-отожжённых смесей экспериментальных проб с
генотипическими контролями (см. текст).
М - маркёр молекулярных масс (гидролизат pBR322 по сайтам Mspl).
Не - область положения гетеродуплексов;
Но - область положения гомодуплексов;
Экспериментальные пробы:
1-3 - проба генотипа 1Ь;
4-6 - проба генотипа За;
7-9-пробагенотипа2аУ2с;
10-12 - проба генотипа 3а;
13-15 - проба генотипа 3а;
Генотипические контроли (ГК):
1,4,7ЛО, 13-ГКгенотипа 1b;
2, 5, 8, 11, 14 - ГК генотипа 2а/2с;
3, 6, 9, 12, 15 - ГК генотипа 3а.
Использование методов SSCP и НМА для генотипирования изолятов ВГС является неплохой альтернативой существующим коммерчески доступным наборам. Коммерчески доступные наборы для генотипирования, использующие молекулярно-биологические подходы. имеют весьма высокую стоимость. Наиболее точный и надежный, среди лабораторных методов, метод прямого секвенирования достаточно трудоёмок, требует специального оборудования и, в основном, используется для научно-исследовательских целей. Метод RFLP является простым и нетрудоёмким, но требует использования редких и дорогостоящих ферментов рестрикции. Диапазон применения типоспецифичных праймеров или зондов для типирования ВГС ограничен из-за высокой степени изменчивости вирусного генома. Система амплификации с типоспецифическими праймерами по Н. Okamoto с соавторами [Pawlotsky J.M. et al., 1997], разработанная для типирования изолятов ВГС из японской популяции, оказалась малоэффективной для европейской популяции. В одной из работ, использовавших данный подход, в более, чем 30% случаев не удавалось установить генотип вируса [Harrison T.J. and Ziickerman A.J., 1997]. Таким образом, из имеющего арсенала методов для генотипирования
далеко не все являются подходящими для использования в клинической лаборатории или для проведения масштабных скрининговых исследований. Полученные нами результаты подтверждают тот факт, что методы SSCP и НМЛ могут рассматриваться как наиболее подходящие для генотипирования вирусных изолятов в условиях рутинной лабораторной практики.
Заключение. Метод исследования конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов и метод гетеродуплексного анализа были успешно использованы для генотипирования изолятов ВГС [Ильина Е.Н. и др., 1999; Lee J.H. et al., 1997; Marshall DJ. et al., 1997; Zein N.N., 2000]. Мы использовали метод SSCP для генотипирования 24-х изолятов ВГС, полученных от населения Западной Сибири. Для 22-х (91,7%) образцов продуктов амплификации области 5'-UTR в SSCP-тесте были получены чёткие, воспроизводимые картины электрофореза, позволившие отнести каждый из исследованных изолятов ВГС к одному из трёх встречающихся на территории Западной Сибири подтипов вируса (1Ъ, 2а/2с и За). Для двух изолятов было выявлено расхождение между результатами, полученными методом SSCP и методом прямого секвенирования продукта амплификации. Проведённое исследование выявило необычную нуклеотидную последовательность области 5'-UTR (наличие инсерции А в положении - 136 у одного из указанных изолятов ВГС).
Методы SSCP и НМА отличаются простотой выполнения, низкой стоимостью, относительной быстротой, возможностью организовать выполнение практически в любой лаборатории, где гель-электрофорез нуклеиновых кислот является рутинной практикой.
Благодарности. Данное исследование было материально поддержано доктором R.W. Ryder (Yale University, Connecticut, USA). Авторы выражают большую признательность В.П.Торшину и А.И.Пальцеву за оказанную помощь в организации сбора экспериментального материала, а также всем лицам, согласившимся принять участие в исследовании. И.В. Гаврилова, А.В. Шустов, С.В. Нетёсое, Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", пос. Кольцова, Новосибирская обл.
ВНИМАНИЕ!!!
С 1 января 2000 года в Интернете по адресу www.hepatitinfo.ru открыта страница нашего некоммерческого партнерства «ГЕПАТИТИНФО».
Только на этой странице Вы найдете:
Полнотекстовые варианты бюллетеня «Мир вирусных гепатитов» и бюллетеня «Вирусные гепатиты: достижения и перспективы», издаваемых при содействии Московского представительства фирмы «ШерингПлау» (до выпуска их печатных аналогов).
Информацию о различных конференциях с опубликованием наиболее интересных тезисов.
Электронную обновляемую версию «Энциклопедический словарь - Вирусные гепатиты» (М.С. Балаян и М.И. Михайлов).
Специальный раздел, посвященный препарату «.Зеффикс» ('«Ламивудин») фирмы «ГлаксоВэллком». Вы найдёте тезисы, слайды и ещё много разнообразной информации.
ЗАХОДИТЕ, НЕ ПОЖАЛЕЕТЕ.
