CC BY
49
Микробиология и эпидемиология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 70-74
УДК 578.835.15
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ кДНК ГЕНОМА ПОЛИОВИРУСОВ В МИКСТОВЫХ ПРОБАХ
© 2012 г. Л.Б. Луковникова, С.Г. Фомина, Н.А. Новикова
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной
mevirfc @ramЫer.m
Поступила в редакцию 11.04.2012
Представлен метод дифференциальной амплификации фрагментов кДНК генома полиовирусов в пробах, содержащих РНК нескольких серотипов вируса. Метод является специфичным в отношении полиовирусов серотипов 1, 2, 3 и может применяться для дополнительной молекулярно -генетической характеристики штаммов полиовирусов на этапе их первичного скрининга в различных типах клинического материала и объектах окружающей среды.
Ключевые слова: полиовирус, вакцинные штаммы полиовируса, полимеразная цепная реакция, ге-нотип-специфическая детекция.
Введение
Полиомиелит - одно из самых значимых в патологии человека заболеваний энтеровирус-ной этиологии, проявляющееся в разнообразных клинических формах, начиная от абортивных до паралитических. Полиовирусы могут быть причиной слабых гастроэнтеральных симптомов, а также вызывать асептический менингит, часто связанный с болью и спазмами в мышцах. Такой «непаралитичный» тип по-лиовирусной инфекции возникает в 1-2% случаев, полиомиелит с параличом развивается в 0.1-2% случаев [1]. Паралитические формы полиомиелита возникают вследствие поражения вирусом серого вещества передних рогов спинного мозга и двигательных ядер черепномозговых нервов и клинически проявляются развитием вялых или периферических параличей, преимущественно ног и туловища [2].
В 1988 г. Всемирная Ассамблея здравоохранения приняла решение о глобальной ликвидации полиомиелита, а страны-члены Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в том числе Российская Федерация, приступили к его выполнению. Под искоренением понимают не только ликвидацию клинических форм болезни, но и полное исключение циркуляции «диких» вирусов полиомиелита внутри популяции. Вследствие глобальной инициативы ВОЗ по ликвидации полиомиелита заболеваемость, связанная с «диким» полиовирусом, к 2008 г. снизилась на 99% [3]. К настоящему времени ВОЗ сертифицировала как свободные от циркуляции
«дикого» полиовируса три региона земного шара: Америку в 1994 г. (36 стран), Западный Тихоокеанский Регион в 2000 г. (37 стран и территорий) и Европейский Регион в 2002 г. (51 страна). В то же время паралитический полиомиелит продолжает оставаться серьезной проблемой для многих стран. Так, в некоторых странах - Афганистане, Индии, Нигерии, Пакистане - циркуляция «дикого» полиовируса никогда не прерывалась. По данным ВОЗ в 2011 г. в мире зарегистрировано 104465 случаев острого вялого паралича, полиовирусы были выявлены в 0.7% случаев, из которых 92.3% идентифицированы как «дикие» [4].
Выяснение природы циркулирующих по-лиовирусов стало первостепенной задачей эпидемиологического надзора за полиомиелитом. Традиционно вирус полиомиелита характеризуется в соответствии с его антигенными свойствами. Существуют три серотипа полиовируса. Вакцинные вирусы, используемые в составе оральной полиовирусной вакцины (ОПВ), были получены Сэбином путем аттенуации «диких» полиовирусов трех серотипов [5]. Методы дифференциации полиовирусов на «дикие» и вакцинородственные, а также дифференциации «диких» штаммов полиовируса между собой по антигенным свойствам имеют существенные ограничения, связанные со способностью по-лиовирусов к антигенному дрейфу в естественных условиях репродукции [6, 7]. Восстановление нейровирулентности вакцинных штаммов в редких случаях приводит к развитию вакциноассоциированного паралитического полиомие-
лита (ВАПП) у реципиентов вакцины или контактирующих с ними лиц. Однако в последние годы стало известно, что некоторые вакцинородственные вирусы способны циркулировать и даже вызывать вспышки паралитического полиомиелита [8, 9]. В руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита, рекомендованном ВОЗ, основной акцент сделан на классические вирусологические методы исследований. Однако уровень современной научнометодической базы позволяет использовать для характеристики полиовирусов анализ вирусного генома [10]. Молекулярно-генетические методы позволяют одновременно проводить выявление полиовирусов, «молекулярное серотипирова-ние», оценивать уровень мутационной и рекомбинационной изменчивости, а также изучать филогенетические взаимоотношения изолятов полиовирусов и устанавливать их происхождение.
Цель данного исследования - разработка метода амплификации серотиповой области генома (VP1) вакцинных полиовирусов в пробах, содержащих РНК нескольких серотипов вируса, для дальнейшего анализа методом прямого се-квенирования.
Материалы и методы
Выделение РНК. РНК полиовирусов для постановки ОТ-ПЦР выделяли из копрофильтра-тов методом высокосолевой очистки [11], а также с применением комплекта реагентов «РИБО-сорб» производства ФБУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению.
ОТ-ПЦР и анализ продуктов амплификации. Обратную транскрипцию осуществляли в объеме 7.5 мкл с использованием реагентов производства ЗАО «Силекс» (Москва): 0.15 мкл гекса-праймера (0.5 мкг/мл), 0.75 мкл смеси дНТФ (2 мМ каждого), 0.15 мкл РНазина (20 ед/мкл), 0.15 мкл M-MLV обратной транскриптазы (200 ед/мкл), 0.5 мкл х10 буфера для M-MLV обратной транскриптазы, 2.05 мкл воды, свободной от нуклеаз, 3.5 мкл матрицы. Реакционную смесь инкубировали по программе: 42оС -35 мин, 95оС - 5 мин, полученную кДНК разводили в три раза ТЕ-буфером: 10 мМ трис-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА (рН 8.0). ПЦР для обнаружения кДНК полиовирусов проводили с использованием комплекта реагентов для ПЦР «АмплиСенс Poliovirus-FL» производства ФБУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению, и лабораторного варианта ПЦР на основе специфических праймеров для диф-
ференциального выявления РНК полиовирусов трех серотипов. Олигонуклеотидные праймеры синтезированы НПО «Синтол» (Москва). Амплификацию осуществляли в объеме 15 мкл с использованием реагентов производства ФБУН ЦНИИЭ (Москва): 2 мкл х5 ПЦР-буфера blue 15 мМ Mg2+, 1 мкл х5 ПЦР-буфера 0 мМ Mg2+, 0.1 мкл TaqF полимеразы (5 ед/мкл), 0.9 мкл смеси дНТФ (2 мМ каждого), 0.2 мкл смеси прямого и обратного праймеров (20 пМ), 5.8 мкл воды, свободной от нуклеаз, 5 мкл кДНК. Реакционную смесь, приготовленную для обнаружения кДНК полиовирусов типа 1, 3, инкубировали по программе: 95оС - 15 мин, (95оС - 10 с, 50оС - 10 с, 72оС - 10 с) х 42 цикла, 72оС - 2 мин, реакционную смесь, приготовленную для обнаружения кДНК полиовирусов типа 2 инкубировали по программе: 95оС -15 мин, (95оС - 10 с, 55оС - 10 с, 72оС - 10 с) х х 42 цикла, 72оС - 2 мин в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-Технология». Детекцию продуктов ПЦР осуществляли в 1.5% агарозном геле, содержащем 5 мкг/мл бромида этидия, в течение 40 мин при 100 В в трис-боратном буферном растворе: 0.089 М трис, 0.002 М ЭДТА (рН 8.0). Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм на системе обработки изображений «VITran» фирмы «Биоком» (Москва). Размер получаемых фрагментов кДНК определяли путем сравнения электрофоретической подвижности с фрагментами ДНК-маркера.
SSCP-анализ. К 3 мкл раствора продуктов ПЦР добавляли равный объем формамида, содержащего 20 мМ ЭДТА, прогревали в течение 10 мин при 95°С и помещали в охладитель на 12 мин. Электрофорез онДНК проводили в 10% ПААГ с 3% концентрирующим гелем при комнатной температуре в системе буферных растворов Лэммли [12] в течение 3-х часов при 8 мА. После электрофореза гель выдерживали в
0.19% растворе нитрата серебра в течение 20 мин, затем промывали дистиллированной водой, заливали восстанавливающим раствором (0.75 М NaOH, 0.3% формальдегид) и экспонировали до развития окраски. Реакцию останавливали погружением геля в 5% раствор уксусной кислоты.
Секвенирование кДНК. Определение первичной структуры кДНК осуществляли с использованием специфических праймеров, набора реагентов для генетического анализа (Beckman Coulter Inc., DTCS-Quick Start Kit (США)), в автоматическом режиме на при-
боре GenomeLab™ GeXP, согласно рекомендациям производителя. Нуклеотидные последовательности фрагментов кДНК использовали для идентификации близкородственных штаммов полиовирусов с применением пакета программ BLAST [13]. Выравнивание и анализ 64-х нуклеотидных последовательностей генома полиовирусов, представленных в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ [14], проводили с использованием программы MEGA 5.0 [15].
Результаты и обсуждение
Для конструирования праймеров были использованы нуклеотидные последовательности области VP1 генома полиовирусов. Выбор данной области генома не случаен, так как капсид-ный белок VP1 несет один из четырех антигенных сайтов полиовируса [16], что делает этот участок генома оптимальным для конструирования серотип-специфичных праймеров. Кроме этого, капсидный белок VP1 вакцинных по-лиовирусов трех серотипов несет сайты аттенуации, анализ которых позволяет дифференцировать вакцинные и вакцинородственные штаммы полиовирусов [9].
С использованием программы MEGA 5.0 был проведен сравнительный анализ 64-х выровненных нуклеотидных последовательностей вакцинных полиовирусов и полиовирусных изолятов типов 1, 2, 3, представленных в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ. На основе анализа этих последовательностей сконструированы три пары специфичных олигонуклеотидных праймеров для каждого серотипа полиовируса. Подобранные пары праймеров фланкируют фрагмент области генома, включающий антигенные сайты и сайты аттенуации (рис. 1). С применением пакета программ BLAST установлено, что олигонуклеотиды проявляют гомологию с геномными последовательностями полиовирусов (96-100%) и не про-
являют комплементарности с последовательностями неполиомиелитных энтеровирусов и вирусов кишечной группы (рота-, норо-, астровирусов). Для сконструированных пар праймеров была рассчитана температура отжига, а также подобраны условия и временные параметры амплификации.
Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на пробах биоматериала, содержащих РНК полиовирусных изолятов, выделенных от реципиентов пероральной полиовирусной вакцины, пробах, содержащих РНК неполиомиелитных энтеровирусов. Образцы фекалий, содержащие полиови-русы вакцинного происхождения, были идентифицированы с использованием коммерческого набора реагентов «АмплиСенс РоИоу1гш-FL», позволяющего выявлять энтеровирусы вида С с последующей дифференцировкой на вакцинные штаммы полиовирусов типов 1, 2, 3. В процессе ОТ-ПЦР были получены фрагменты ожидаемой длины.
На следующем этапе работы проведена оценка отсутствия перекрестной амплификации фрагментов кДНК генома полиовирусов трех серотипов методом конформационного полиморфизма одиночных нитей амплифицирован-ных фрагментов кДНК (SSCP-анализа) [17]. Этот метод является одним из наиболее чувствительных методов, позволяющих идентифицировать наличие нуклеотидных замен в ДНК, которые служат причиной различий в электрофоретической подвижности онДНК в неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). Электрофоретическая подвижность фрагментов онДНК зависит от ее конформационного состояния, а конформация нити - от наличия замен в нуклеотидной последовательности. Впоследствии было показано, что SSCP позволяет устанавливать штаммовую гетерогенность возбудителей, идентифицированных с использованием других
Рис. 1. Схема структурной организации генома полиовирусов: P1, P2, P3 - полиовирусы типов 1, 2, 3 соответственно; цифрами указаны позиции критических аттенуирующих мутаций
Рис. 2. Схема SSCP-профилей фрагментов кДНК генома полиовирусов вакцинного происхождения типов 1, 2, З, полученных с использованием разработанных пар праймеров: І - фрагмент кДНК полиовируса вакцинного происхождения типа 1; 2 - фрагмент кДНК полиови-руса вакцинного происхождения типа 2; З - фрагмент кДНК полиовируса вакцинного происхождения типа З
методов [18, 19]. На рис. 2 видно отсутствие двойных профилей онДНК, что свидетельствует о типовой специфичности праймеров. Специфичность сконструированных праймеров также подтверждена методом прямого секвенирования фрагмента кДНК полиовирусных изолятов, выделенных от реципиентов пероральной по-лиовирусной вакцины. Путем сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов кДНК с использованием пакета программ BLAST установлена их принадлежность к полиовирусам вакцинного происхождения типов 1, 2, З соответственно.
Заключение
Сконструированы три пары праймеров нового дизайна, позволяющие избирательно ампли-фицировать фрагмент кДНК области VP1 генома полиовирусов в микстовых пробах, достаточный для анализа нуклеотидной последовательности.
Список литературы
1. Minor P.D. Polioviruses. General Features // J. Gen. Virol. 1995. V. 73. P. 1-19.
2. Грачев В.П. Полиомиелит // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. № 5. С. 14-21.
3. Информационный бюллетень N°114 [Электронный ресурс]. - URL: http://www.who.int/ media-centre/factsheets/fs114/ru (дата обращения 23.03.2012).
4. http ://apps. who. int/immunization_monitoring/en/ diseases/poliomyelitis/afpextract.cfm (дата обращения 21.03.2012)
5. Sabin A.B. Oral poliovirus vaccine: history of its development and use and current challenge to eliminate poliomyelitis from the world // J. Infect. Dis. 1985. V. 151. P. 420-436.
6. Липская Г.Ю., Черкасова Е.А., Иванова О.Е. и др. Генотипирование диких штаммов вируса полиомиелита, изолированных на территории России и СНГ в 1987-1995 гг. // ЖМЭИ. 1995. № 5. С. 70-74.
7. Яковенко М.Л., Короткова Е.А. Эволюция вакцинных штаммов полиовируса // Вопросы вирусологии. 2008. № 3. С. 45-49.
8. Cherkasova E.A., Korotkova E.A., Yakovenko M.L. et al. Long-term circulation of vaccine-derived poliovirus that causes paralytic disease // J. Virol. 2002. V. 76. P. 6791-6799.
9. Kew O.M., Sutter R.W., de Gourville E.M. et al. Vaccine-derived polioviruses and the endgame strategy for global polio eradication // Annu. Rev. Microbiol. 2005. V. 59. P. 587-635.
10. Kew O.M., Nottay B.K., Rico-Hesse R. et al. Molecular epidemiology of wild poliovirus transmission. In: Applied virology research. N.Y.: Plenum Publishing Corporation, 1990. V. 2. P. 199-221.
11.Новикова Н.А., Голицына Л.Н., Епифанова Н.В., Федорова О.Ф., Луковникова Л.Б. Способ выделения РНК кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции. Патент на изобретение № 2313792, приоритет от 10 апреля 2006 года.
12. Laemmli U.K. Cleavage of structure proteins during the assembly of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
13. On-line ресурс BLAST. - URL: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
14. База данных. - URL: http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/pubmed/
15. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., and Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Molecular Biology and Evolution (submitted).
16. Strik H.J., Thornton J.M. The BC loop in poliovirus coat protein VP1: an ideal acceptor site for major insertions // Protein Englneering. 1994. V. 7. P. 47-56.
17. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H. et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation pol-
ymorphisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2766-2770.
18. Emeny R.T., Herron J.R., Hi L.F. et al. Comparison of variant-specific hybridization and single-strand conformational polymorphism methods for detection of mixed human papillomavirus
type 16 variant infections // J. Clin. Microbiol. 1999. V. 37. P. 3627-3633.
19. Kaczanowski R., Trzeciak L., Kucharczyk K. Multitemperature single-strand conformational polymorphism // Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 3539-3545.
DIFFERENTIAL AMPLIFICATION OF POLIOVIRUS GENOME cDNA FRAGMENTS
IN MIXED SAMPLES
L.B. Lukovnikova, S.G. Fomina, N.A. Novikova
We present a method for differential amplification of cDNA fragments of the poliovirus genome in samples containing RNA of several virus serotypes. The method is specific for poliovirus serotypes І, ї, З, and can be used for further molecular genetic characterization of poliovirus strains during their first screening in various types of clinical and environmental materials.
Keywords: poliovirus, vaccine strains of poliovirus, polymerase chain reaction, genotype-specific detection.
