CC BY
346
раб. и доп. - М.: ВУНМЦ, 1999. - 18. Fonriesu A., Severy С. // J. Biophis. Biochern. Cytol. - 1956. -Vol..2..-гP. 293-299. .
A.A.Shuldyakov, O.B.Lisko, V.I.Yereomin ' - ■
Diagnostic and Forecast Importance of Giycoproteids and Aminotransferase Isoenzymes in Severe Diphtheria Cases
Saratov State Medical University
Fifty-eight severe diphtheria patients were examined to assess their clinical symptoms and laboratory findings involving a complex study of giycoproteids and isoenzyme aminotransferases spectrum, with the aim of
improving the quality of diphthera infection diagnosis. Metabolic disorders in the connective tissue were shown to play an important role in the development of the pathologic diphtheria process while the isoenzymatic spectrum of aminotransferases was characterized by strongly pronounced disbalance with preferential enhancement of the mitochondrial; isoenzymes. The degree of the alterations observed was found to bear a clear correlation to the severity of the disease with the pathologic shifts, in case of toxic forms, being maintained after the expiry of the acute stage of the disease during the period of complications onset. ?.■ . - :
Поступила 19.01..05 .
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 576.851.2
Н.Г.Тихонов!, В.М.Самыгин, А.В.Липницкий, Л.К.Жога
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Разработаны питательная среда и условия глубинного, культивирования, обеспечивающие эффективное получение биомассы антибиотикорезистентных штаммов В. subtilis, которая является основой производства пробиотиков для профилактики и лечения инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии.
Разработка и использование различных пробиотиков, являющихся антагонистами многих патогенных бактерий, остаются в числе наиболее значимых проблем медицинской микробиологии. Препараты, содержащие живые микроорганизмы-сапро-фиты, экологически безопасны, совершенно безвредны и не имеют явных противопоказаний для клинического применения. К настоящему времени полученные на основе микроорганизмов рода Bacillus (в основном В. subtilis) препараты-пробиотики весьма положительно зарекомендовали себя в случаях коррекции микрофлоры при дисбактериозах, вызванных антибиотикотерапией, при острых кишечных и некоторых других заболеваниях [1-3]. Однако сведения о пробиотиках, полученных на основе генетически измененных вариантов микроорганизмов, которые обладают множественной лекарственной устойчивостью и антибактериальной активностью в отношении патогенных видов и могут быть использованы для профилактики и лечения инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии, единичны [4, 5]. Тем более остаются неисследованными биотехнологические процессы получения таких микроорганизмов, в том числе условия культивирования, обеспечивающие интенсивное размножение клеток.
Целью настоящего исследования явилась разработка условий культивирования генетически измененных антибиотикорезистентных штаммов В. subtilis для эффективного получения биомассы, являющейся основой в производстве пробиотиков.
В работе использовали штаммы В. subtilis КМ-115 и КМ-117, запатентованные и депонированные в Российской коллекции патогенных бактерий противочумного института «Микроб» (Саратов). Штамм В. subtilis КМ-115 отличался устойчивостью
к рифампицину, ампициллину, стрептомицину (Rif, Amp, Strr), а В. subtilis КМ-117, кроме того - к тетрациклину и хлорамфениколу (Rif, Ampr, Strr, Тсг, Cmr). Оба штамма проявляли ингибирующую активность в тесте «отсроченного антагонизма» в отношении возбудителей чумы, мелиоидоза, холеры и сибирской язвы.
Штаммы выращивали глубинным способом и в стационарном режиме. Глубинное культивирование осуществляли в модифицированной установке «Биофло» («Брунсвик», США) с рабочим объемом культурального сосуда 400 мл [6]. Посев культуры и отбор проб проводили посредством создаваемого йзбыточного разрежения воздуха. Бактерии выращивали в периодическом режиме в условиях искусственной аэрации и термостатирования. Аэрацию осуществляли за счет непрерывного барботирова-ния и перемешивания среды, при этом расход стерильного воздуха составлял 0,8-1,0 л/мин, а скорость вращения . магнитной мешалки - 200-250 об/мин. Температуру в культуральном сосуде в пределах 37 °С поддерживали при помощи электронагревателя и термореле, а контролировали с помощью комбинированного электрода. Концентрацию биомассы в отбираемых через каждые 4 ч пробах определяли при помощи отраслевого стандартного образца (ОСО) мутности ГИСК им. Тарасевича. Продолжительность культивирования не превышала 12 ч. При стационарном выращивании культуру засевали во флаконы с жидкой питательной средой и помещали в термостат при 37 °С на 24 ч.
В качестве основы питательных сред были использованы молочная сыворотка и дрожжевой ауто-лизат, к которым добавляли в различных сочетаниях и концентрациях неорганические соли, углеводы (в основном моно- и дисахариды), органические и
аминокислоты, витамины и некоторые другие соединения.
На начальном этапе исследования в качестве основы питательной среды была использована молочная сыворотка как один из наиболее дешевых, доступных и полноценных по аминокислотному составу продуктов молочного производства. Сыворотку осветляли путем добавления 1 N раствора едкого натрия до pH 7,0-7,2, прогревали на водяной бане при 80 °С в течение 30 мин и освобождали от осадка фильтрованием. В осветленную сыворотку вносили в различных сочетаниях определенные добавки (в %): дрожжевой аутолизат (1,5), сернокислые соли магния (0,3) и марганца (0,001), а также соли молибденово-кислого (0,001) и хлористого (0,5) натрия. Оказалось, что размножение сенной, палочки в стационарных условиях наблюдалось во всех испытанных питательных средах, но более интенсивно происходило в среде, в которую были добавлены все перечисленные соединения. Тем не менее, поскольку максимальная концентрация биомассы не превышала 109 м.к./мл, с целью ее повышения в последующих опытах были испытаны метабисульфит натрия (0,003 %), аскорбиновая кислота (0,01 %) и цистеин (0,01 %), позитивное влияние которых на рост бактерий в значительной мере связано с изменением окислительно-восстановительного потенциала среды, а также витамины Вь В3 и ферментативный гидролизат черного альбумина (ФГЧА). Было установлено, что витамины Вь В3 и ФГЧА не влияли на рост изучаемой культуры, тогда как первые из перечисленных трех соединений в равной степени проявляли стимулирующее действие, в результате чего конечная концентрация биомассы увеличивалась до (2-2,5)-109 м.к./мл.
Достоверно установлено, что процессы развития микробных популяций во многом зависят от катаболической активности клеток, которая, в свою очередь, определяется субстратной специфичностью конкретного микроорганизма; В связи с этим в составе питательной среды в качестве источников углерода и энергии испытаны углеводы и натриевые соли органических кислот. В числе испытанных были арабиноза, сахароза, глюкоза, ксилоза, лактоза, а также натрий лимонно-кислый, щавелево-кислый, янтарно-кислый. Кроме того, в опытах использовали нейтрализованную молочную кислоту, содержащуюся в молочной сыворотке. Экспериментально обнаружено, что из испытанных соединений утилизировались с образованием кислоты глюкоза и сахароза, в меньшей степени сукцинат натрия, а цитрат натрия и различные концентрации молочной кислоты оказывали ингибирующее действие на размножение клеток сенной палочки. Причем эти данные были аналогичными как для стационарной, так и для глубинной культуры, выращенной при 37 °С в течение 12 ч.
Известно, что развитие бактериальных популяций сопряжено не только с лимитирующими рост субстратами, но и определяется ингибирующими факторами, в том числе имеющими неспецифическую природу. Для проверки этого известного обстоятельства были исследованы питательные среды на основе молочной сыворотки, которую с двукратным интервалом предварительно разводили дистиллированной водой. Исследования показали, что использование сред с разведенной в 8 раз молочной
сывороткой обеспечивало урожайность биомассы, не превышавшую показателей предыдущих опытов, и результаты оказались идентичными как для глубинного, так и стационарного способов культивирования. Таким образом, можно полагать, что исполь: зование питательных сред на основе молочной сыворотки для культивирования. изучаемых штаммов В. зиЬпШ является неперспективным. ;
В дальнейшем в качестве основы экспериментальной среды был исследован дрожжевой/аутолизат, нашедший широкое применение при изготовлении питательных сред различного предназначения. Прежде всего были поставлены опыты по определению влияния концентрации аминного азота на размножение В. ¡иЫШз. Для этого исходный дрожжевой. аутолизат (с аминным. азотом 240 мг%) разводили водой в 2, 4 и 8 раз и добавляли хлористый натрий в концентрации 0,5 %. Культуру засевали в количестве 10 м.к./мл и выращивали стационарно при .37 °С в течение 24 ч. Было установлено, что оптимальной является среда с содержанием аминного азота 120 и 60 мг%. Однако, поскольку последнее значение экономически более целесообразно, то в последующем в опытах на 100 мл среды брали 25 мл исходного дрожжевого аутолизата, что соответствовало 60 мг% аминного азота.
С учетом полученных данных в состав среды вошли следующие компоненты: дрожжевой аутолизат - 25 мл, аскорбиновая кислота - 0,05 г,, 1ЧаС1 -0,5 г, ]У^804-7Н20 - 0,03 г, Мп804-7Н20 -;*),001 г, Ма2Мо04-2Н20 - 0,001 г, вода - до 100 мл, pH 7,2. Динамика развития глубинной культуры в такой среде представлена на рис. 1, а, б. >;
. 1. Динамика роста глубинной культуры В^иЬШ¿5 КМ-115:
а - простая периодическая культура; 6 - культивирование в условиях коррекции pH при помощи растворов НС1 и ЫаОН; '
8 - размножение клеток в экспериментальной среде при коррекции pH сахарозой и щавелевог кислым натрием; г - простая периодическая культура в среде с сахарозой и щавелево-кислым натрием
I
Как видно, размножение клеток происходило после непродолжительной (2-3 ч) лаг-фазы,: а через 12 ч от начала опыта урожайность биомассы (х) достигала максимальных значений, .равных 3-109 м.к./мл (рис. 1,.а). Удельная скорость роста (р.) при этом составила 0,57 ч“1, а время генерации (^)
1,2 ч. Следует отметить, что такая же урожайность биомассы наблюдалась и при стационарном выращивании, однако в. последнем случае максимальную концентрацию удавалось получать лишь для
24-часовой культуры штаммов сенной палочки.
Развитие популяций В. ъиЫШь сопровождалось изменением pH среды, что отмечено и для других видов бацилл [7]. При этом показатель водородных ионов после незначительного увеличения к концу лаг-фазы (до 7,4) начинал медленно, но постоянно снижаться й к концу опытов непременно фиксировался на отметке 6,5—6,6. Автоматическая, основанная на принципе обратной связи коррекция pH в процессе культивирования 10 % растворами соляной кислоты и гидроокиси натрия, стабилизировала pH на заданном уровне, способствуя увеличению концентрации клеток до (4-5)-109 в 1 мл (рис. 1, б), хотя и не решала проблемы эффективного получения биомассы.
На основе анализа данных по субстратной специфичности исследуемого микроорганизма и динамики pH в процессе его размножения были изменены условия культивирования, прежде всего корригирующие pH растворы. Оказалось, что оптимальными для культивирования пробиотических антибиотикорезистентных штаммов В. зиЬйШ являются , условия, при которых используют указанную выше дрожжевую питательную среду, содержащую аскорбиновую кислоту, соли хлористого и молибденово-кислого натрия, а также сернокислые соединения марганца и магния. Вместе с тем бациллы выращивают при 37 °С при постоянной аэрации, осуществляемой за счет подачи стерильного воздуха и перемешивания среды, а pH корригируют посредством 10 % растворов сахарозы и щавелево-кислого натрия. В таких условиях размножение клеток В. БиЫШз происходило достаточно интенсивно, и уже через 8 ч урожайность биомассы достигала Ю10м.к./мл (рис. 1, в). Максимальная концентрация клеток оставалась на этом уровне в течение 4 ч (срок наблюдения), а pH не изменялся за пределы 6,9-7,2. Примечательно, что при использовании двух корригирующих субстратов не в качестве экзогенных источников, а непосредственно в составе питательной среды, кривая роста приобретала вид, представленный на рис. 1, г. В этом случае наивысшая концентрация клеток также отмечалась через 8 ч от начала культивирования, однако в последующие часы происходило ее постепенное снижение. Параметры роста при каждом из двух способов культивирования составили соответственно: х=Ю10 и 8-109 м.к./мл, ц.=0,77 и 0,73 ч-1, ^=0,9 и 0,95 ч. Сравнивая на рис. 1 кривые виг, нельзя не заметить, что урожайность биомассы при использовании сахарозы и сукцината натрия в качестве корригирующих растворов была несколько выше, чем в тех случаях, когда оба субстрата использовались непосредственно в составе питательной среды. Можно предположить, что из двух субстратов наиболее эффективно утилизировалась сахароза, о чем свидетельствует стабильное закисление среды в процессе роста исследуемого микроорганизма (рис. 2). Кроме того, такое положение подтверждают наши данные, согласно которым использование в качестве корригирующего pH раствора либо в виде компонента питательной (среды одного лишь сукцината натрия (а не в сочетании с сахарозой) не приводило к существенным изменениям в урожайности культуры.
Также не влияла на урожайность биомассы замена сахарозы на глюкозу.
Время, ч
Рис. 2. Динамика pH в процессе глубинного культивирования В. subtilis'.
а - изменение pH при простом периодическом культивировании, б - изменение pH при выращивании клеток в среде с сахарозой и сукцинатом натрия
Таким образом, полученные результаты позволили определить состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие эффективное получение биомассы антибиотикорезистентных штаммов В. subtilis в короткие сроки.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Афонская С.В., Смирнов В.В. // Микробиол. журн. - 1993. - Т. 55, № 5. - С. 81—83. - 2. Смирнов В.В., Резник С.Р., Выо-ницкая В. А. и др. // Микробиол. журн. - 1993. - Т. 55, № 4. -С. 92-112. - 3. Сергейчук Т.М., Сорокулова И.Б.//Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания: Матер. науч. конф., поев. 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова. - Харьков, 1995. - С. 269. - 4. Буланцев А.Л., Тихонов Н.Г., Липницкий А.В. Штамм Bacillus subtilis РАС, ■ резистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам. Патент РФ № 2115725 от 20.07.1998 // Бюл. №20.-5. Буланцев А.Л., Тихонов Н.Г., Липницкий А. В. Штамм Bacillus subtilis ТРАХС, резистентный к тетрациклину, рифампицину, ампициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью к патогенным видам микроорганизмов. Патент РФ №2118364 от 27.08.1998 // Бюл. № 24. - 6. Самыгин В.М., Владимцева И.В., Спиридонов В. А. и др.// Биотехнол. - 2000.-№ 3. -С. 53-57. - 7. Степин А.А., Самыгин В.М., Владимцева И.В. и др. //Биотехнол. - 1994. -№ 3. - С. 31—33.
N.G.Tikhoiiov, V.M.Samyghin, A.V.Upnitsky, L.K.Zhoga
Biotechnological Aspects of Culturing of Probiotic Bacillus subtilis Strains Resistant to Antibiotics
Volgograd Anti-Plague Research Institute
A nutritional medium and the conditions of submerged cultivation have, been designed to provide for efficient yield of antibiotic resistant
B. subtilis strains biomass, that may be used in the process of production of probiotic preparations for the prevention and treatment of infectious diseases parallel to antibiotics therapy. ■ 1
Поступила 01.04.04.
