Питательная среда для приготовления жидкого лактобактерина Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 576.851.24

Н.А. Глушанова, Л.И. Блинов

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЖИДКОГО ЛАКТОБАКТЕРИНА

Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей (Новокузнецк)

Разработана питательная, среда для. приготовления жидкого лактобактерина. Представлены, результаты. исследования, накопления биомассы. 10 штаммов лактобацилл, в том. числе 5 производственных и 5 индигенных, выделенных из кишечника человека и животных. Лактобактерин, приготовленный из L. acidophilus 317/402 на этой среде, обеспечивает, сохранение жизнеспособности лактобацилл не менее чем 9 и. 7 Lg КОЕ/мл в течение 2 и. 4 месяцев хранения соответственно.

Ключевые слова: питательная среда, жидкий лактобактерин

CULTURE MEDIUM FOR PREPARATION FLUID LACTOBACTERIN

N.A. Glushanova, A.I. Blinov Novokuznetsk State Institute of Physicians’ Training, Novokuznetsk

Culture medium, for preparation fluid, lactobacterin are developed. Results of research of biomass accumulation of 10 lactobacilli strains, including 5 productions and 5 indigenous, received from intestine person and animals. Lactobacterin from. L. acidophilus 317/402 on this culture medium, are prepared, ensures a conservation of viability lactobacilli not less than 9 and. 7 Lg PFU /ml, during 2 and. 4 months of keeping, consequently.

Key words: culture medium, fluid lactobacterin

ВВЕДЕНИЕ ящее время является бактериотерапия. Основным

Общепринятым способом сохранения и восста- средсгв°м бактериотерапии служат

новления нарушенных микробиоценозов в насто- а также ^одукгы функ-

ционального питания [5, 15]. В ряде случаев пробиотики успешно используются в качестве альтернативы антибиотикам для подавления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Среди бактерий, используемых для изготовления пробиотиков широкое применение находят представители рода Lactobacillus. Однако в последние годы появились данные о том, что пробиотические штаммы лактобацилл могут оказывать антагонистические воздействия не только на патогенные и условнопатогенные микроорганизмы (УПМ), но и на резидентные лактобактерии потребителя, вследствие чего снижается эффективность пробиотикотера-пии. В связи с изложенным, возникает необходимость индивидуального приготовления пробиотиков на основе лактобацилл, биосовместимых с резидентной лактофлорой пациента и/или способных подавить нежелательную микрофлору [3]. Для получения таких препаратов необходима питательная среда, способная обеспечить не только накопление биомассы пробиотических лактобацилл, но и продолжительное сохранение их жизнеспособности и возможность для энтерального или местного применения. Диагностические питательные среды для культивирования лактобацилл, представляющие собой варианты известной среды MRS, содержат токсические компоненты и не могут быть использованы для энтерального употребления.

Ранее, с целью выделения индигенных лактобацилл из клинического материала нами была раз-работа жидкая селективная питательная среда обогащения [12]. Удовлетворительные ростовые качества этой питательной среды подтвердили лабораторные исследования и практическое использование. Изменение состава и физико-химических свойств вышеуказанной питательной среды позволили получить модифицированную неселективную питательную среду для накопления биомассы пробиотических лактобацилл.

Цель работы — исследование ростовых качеств модифицированной питательной среды и изучение возможности ее использования для изготовления индивидуальных препаратов лактобактерина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Жидкие питательные среды для накопления биомассы лактобацилл:

1) молочно-дрожжевая среда [7];

2) модифицированная среда, г/л: гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный (Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов «Им-Био») 30,0 ± 3,0; аутолизат дрожжей концентрированный 110,0 ± 10,0; агар пищевой (ГОСТ 16280-89) 0,8; вода дистиллированная до 1 литра; 20%-ный водный раствор натрия гидроксида (Ч.д.а., ГОСТ 4328-77) до рН среды 6,4 ±0,1. Питательную среду стерилизовали в автоклаве при 110 °С в течение 20 мин. (Заявка №2002131983/ 13(033762), приоритет 27.11.02). Плотная питательная среда для отбора колоний, соответствующих паспортным данным штамма, отличается от

вышеуказанной жидкой повышенным (18,0 — 20,0 г/л) содержанием агара.

В качестве тест-культур для исследования ростовых качеств модифицированной питательной среды использованы производственные штаммы лактобацилл: Lactobacillus acidophilus NK 1, L. acidophilus М100, L. acidophilus К3 III 24, (МНИ-ИЭМ им. Г.Н. Габричевского); L. plantarnm 8PA3 (Томский НИИВС «Фермент»); L. acidophilus317/ 402 — (АО «Биомед»), а так же свежевыделенные штаммы резидентных лактобацилл из фекалий человека (L. coprophiïus, L. deïbrueckii) и белых мышей (L. acidophilus 2, L. cellobiosus, L. plantarum).

Выделение резидентных лактобацилл из фекалий осуществляли разработанным нами способом [12. Видовую идентификацию лактобактерий осуществляли определением их ферментативного профиля по укороченному спектру углеводов: (L( + )арабиноза, Dфруктоза, сахароза, D( + )мальтоза, aDMelezitose, целлобиоза, D( + )сорбит, Dсалицин, эскулин) [13, 14].

Методика изготовления пробиотика из лиофи-лизированных производственных штаммов лактобацилл заключалась в следующем. С целью предварительного восстановления биологических свойств дегидратированных бактерий и получения рабочей стартерной культуры проводили не менее 3 пассажей. Для этого в асептических условиях содержимое флакона растворяли в 5 мл модифицированной жидкой питательной среды и переносили в колбу, содержащую 25 — 30 мл питательной среды того же состава, инкубировали при 38 ± 1 °С в течение 16— 18 ч (первый пассаж). Затем производили рассев полученной культуры (второй пассаж) на поверхности плотной питательной среды для культивирования лактобацилл. Чашки с посевами инкубировали крышкой вниз при температуре 38 ± 1 °С в течение 18 — 20 ч в атмосфере, содержащей 5 % углекислого газа и 16 % кислорода, после чего отбирали типичные колонии. Каждую отобранную колонию засевали в пробирку с 10 мл жидкой питательной среды (третий пассаж), инкубировали при температуре 38 ± 1 °С в течение 14— 16 ч, проверяли чистоту культуры лактобацилл в каждой пробирке и использовали в качестве стартерной рабочей культуры для получения жидкого лактобактерина (четвертый пассаж). Для этого питательную среду подогревали на водяной бане до температуры 38 ± 1 °С, добавляли рабочую культуру лактобацилл в соотношении 1:10, инкубировали при температуре 39 °С в течение 18 ч. Оптимальное время инкубации (18 ч), обеспечивающее максимальное накопление жизнеспособных клеток для штамма L. acidophilus 317/402, было определено предварительно при помощи разработанного нами экспресс-метода [4]. Пробиотический препарат охлаждали до 20 °С, разливали в асептических условиях по 10 мл во флаконы под обкатку и сохраняли при температуре 4 ± 2 °С.

Свежевыделенные штаммы резидентных лактобацилл исследовали без пассирования. Для рас-

чета средних значений титров биомассы посев каждого вида лактобацилл осуществляли в десяти повторностях.

Концентрацию жизнеспособных лактобацилл в приготовленном лактобактерине определяли методом десятикратных серийных разведений при помощи дозатора фирмы «Ленпипет» по 0,5 мл в объеме 4,5 мл жидкой среды.

Определение титруемой кислотности проводили общепринятым методом [10].

Статистическая обработка полученных данных проведена на персональном компьютере с использованием программ «Биостатистика» (primer of Biostatistics version 4.03 by Stanton

A. Glantz); «Instat — 2» (GraphPad Instat tm Copyright (c) 1990— 1994 GraphPad Software.

V2. 05a; SIGMA I-6140 Lot 116H1240). Проведено непараметрическое множественное сравнение при помощи критерия Ньюмена-Кейлса (q). Критические значения критерия Ньюмена-Кейлса для бесконечного числа степеней свободы (v = œ): q = 2,772 для интервала сравнения l = 2; q = 3,314 для l = 3; q = 3,633 для l = 4; q = 3,858 для l = 5 [2]. Определение влияния продолжительности хранения на жизнеспособность L. acidophilus 317/ 402 в лактобактерине проведено при помощи критерия Даннета (q') — непараметрического множественного сравнения для выборок равного объема. Критическое значение q' = 2,44 для интервала сравнения l = 5 и v = œ [2]. Критический уровень значимости (Р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05 [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведенные нами исследования показали, что выращивание L. acidophilus 317/402 на широко известной молочно-дрожжевой среде [7] позволяет получить максимальную концентрацию био-

массы 6 х 108 КОЕ/мл. Однако в результате хранения при температуре 4 ± 2 °С в течение 2 месяцев титр жизнеспособных клеток лактобацилл понизился до 103 КОЕ/мл. Изучение ростовых качеств модифицированной питательной среды посевом разных представителей рода Lactobacillus (табл. 1) показало, что все тест-штаммы, как промышленные, так и свежевыделенные из фекалий, активно накапливают биомассу в течение 18 ч при температуре 39 °С. Среди производственных штаммов лактобацилл наибольшей энергией роста обладал L. acidophilus 317/402 — средний титр 9,6 ± 0,34 (М ± ст, Lg КОЕ/мл), наименьшей — L. acidophilus К3 III 24, средний титр которого составил 8,9 ± 0,45 (М ± ст, Lg КОЕ/мл). Из числа свежеизолированных (индигенных) резидентных кишечных лактобацилл самой высокой продуктивностью отличались штаммы видов L. plantarnm (11,1 ± 0,41 М ± ст, Lg КОЕ/мл) и L. cellobiosus (10,4 ± 0,29 М ± ст, Lg КОЕ/мл), полученные от мышей.

Для статистического анализа возможных различий в накоплении биомассы лактобацилл, принадлежащих к одному виду, были проведены непараметрические множественные сравнения первичных данных среди пяти представителей вида L. acidophilus и для двух штаммов вида L. plantarum при помощи критерия Ньюмена-Кейлса. Установлены статистически значимые различия в концентрации биомассы для L. acidophilus 317/402 и L. acidophilus К3 III 24 (q = 6,784, l = 5), L. acidophilus 317/402 и L. acidophilus М100 (q = 3,918, l = 4), L. acidophilus 2 и L. acidophilus К3Ш24 (q = 4,395,

l = 4), L. acidophilus NK1 и L. acidophilus К3Ш24 (q = 3,631, 3), L. acidophilus М100 и L. acidophilus К3Ш24 (q = 2,867, l =2). Различия в концентрации биомассы у L. plantarum и L. plantarum 8PA3 также статистически значимы (q = 5,345, l = 2). Следовательно, накопление биомассы лактобацилл при культивировании в одинаковых условиях является штам-

Таблица 1

Накопление биомассы лактобациллами различного происхождения

№ пп Вид лактобацилл Происхождение штаммов Титр лактобацилл, Lg КОЕ/мл

М ± ст (n = 10) Доверительный интервал 95 %

1 L. acidophilus К3Ш 24 Производственные пробиотические 8,9 ± 0,45 8, 5 ■I- 9, 2

2 L. acidophilus М100 - 9,2 ± 0,24 9, 0 ■ 9, 3

3 L. acidophilus NK 1 - 9,2 ± 0,37 9, 0 ■ 9, 5

4 L. acidophilus 317/402 - 9,6 ± 0,34 9, 3 ■ 9, 8

5 L. plantarum 8PA3 - 9,1 ± 0,31 8, 8 ■ 9, 3

6 L. acidophilus 2 Фекалии белой мыши 9,3 ± 0,15 9, 2 ■ 9, 4

7 L. cellobiosus - 10,4 ± 0,29 10,1 +10,6

8 L. plantarum - 11,1 ± 0,41 10,8 *11,4

9 L. coprophilus Фекалии человека 9,6 ± 0,73 9,1 -И0,1

10 L. delbrueckii - 9,9 ± 0,52 9,5 -И0,2

Примечание: п - число определений; М - среднее; в - стандартное отклонение; 1_д - десятичный логарифм; КОЕ -колониеобразующая единица.

моспецифическим свойством и не зависит от их видовой принадлежности.

Исследование динамики изменения концентрации биомассы L. acidophilus 317/402 (Lg КОЕ/ мл) и титруемой кислотности (°Т) в лактобактери-не на протяжении четырехмесячного хранения при температуре 4 ± 2 °С показано в таблице 2.

Было проведено непараметрическое множественное сравнение первичных данных (титров лактобактерина, n = 10) при помощи критерия Даннета для пяти моментов наблюдения (после изготовления и в течение четырех месяцев). Установлено, что через 1 и 2 месяца хранения концентрация биомассы не изменилась по сравнению с исходной (q'2 = 2,109, l = 5). Статистически значимые снижения концентрации жизнеспособных лактобацилл наступили через 3 и 4 месяца хранения (q'3 = 2,661 и q'4 = 5,208, соответственно).

ВЫВОДЫ

Известно, что в клинической практике используются две основные формы пробиотических препаратов: жидкая и лиофилизированная. По мнению Ю.В. Козьминых и соавт. жидкие пробиотики значительно эффективнее сухих сублимированных препаратов [8]. По данным Л.Н. Петрова оптимальной формой применения жидких лактопробиотиков являются кисломолочные продукты [9]. Однако такие формы пробиотиков имеют малый срок годности, например, кисломолочный продукт «Витафлор» на основе симбиотических лактобацилл хранится в течение 3 — 5 дней [9].

Лактобактерин, приготовленный из L. acidophilus 317/402 на предложенной нами питательной среде, обеспечивает сохранение жизнеспособности лактобацилл при температуре 4 ± 2 °С не менее чем 9 и 7 Lg КОЕ/мл в течение 2 и 4 месяцев, соответственно. Существенным моментом при изготовлении лактобактерина является своевременная остановка развития культуры на стационарной фазе, когда в среде накапливается оптимальное количество экзометаболитов, обеспечивающих наибольшую стойкость культуры при хранении и облегчающих адаптацию ее при попадании в новые условия. Необходимо обратить внимание на низкую титруемую кислотность лактобактерина, при-

готовленного на основе L. acidophilus 317/402 (от 70,8 до76,2 °Т), что также способствует длительному сохранению жизнеспособности лактобацилл. Низкая кислотность лактобактерина связана с отсутствием в составе питательной среды глюкозы, наличие которой способствует интенсивному накоплению кислых продуктов метаболизма.

Продолжительное сохранение жизнеспособности лактобацилл в модифицированной среде связаны, вероятно, с высокой концентрацией дрожжевого аутолизата. По данным А.М. Скоро-думовой внесение дрожжей при длительном хранении закваски значительно повышает стойкость молочнокислых бактерий [10]. Следует отметить, что по утверждениям Е.Г. Борисенко и С.Ю. Солдатовой дрожжевые продукты обладают выраженным пребиотическим лакто- и бифидогенным действием, повышая при их приеме содержание этих бактерий в организме на 1—2 порядка [1]. Следовательно, лактобактерин, приготовленный на разработанной нами среде, может оказывать дополнительное пробиотическое действие на резидентную флору пациента.

Состав модифицированной питательной среды отвечает потребностям разных видов и штаммов лактобацилл. Наши исследования показали, что предложенная питательная среда обеспечивает накопление биомассы всех использованных в опытах штаммов лактобацилл в пределах от 8,9 ± 0,45 до 11,1 ±0,41 (М ± ст, Lg КОЕ/мл). Эти значения соответствуют регламентируемому содержанию жизнеспособных клеток в одной дозе пробиотика, которое составляет от 6 до 10 Lg КОЕ/мл, в зависимости от препарата [6]. Низкая концентрация ацетата, присутствующая в модифицированной среде, по-видимому, способствует активному накоплению биомассы лактобацилл. Т.Я. Вахитов и соавт. отмечают, что ацетат в низких концентрациях способен стимулировать рост бактериальной культуры, а в высоких — оказывать ингибирующее действие [11]. Разработанная питательная среда проста и физиологична по составу, позволяет осуществлять приготовление лактобактерина на основе штаммов, индивидуально подобранных для пациента и оказывающих оптимальное профилактическое и/или лечебное действие.

2

Таблица

Динамика показателей качества лактобактерина при хранении

Интервал наблюдения Титр лактобацилл М ± a, Lg КОЕ/мл (n = 10) *Титруемая кислотность, °Т

Исходные значения 9,6 ± 0,34 70,8

Через 1 мес. 9,4 ± 0,35 71,5

Через 2 мес. 9,2 ± 0,23 72,4

Через 3 мес. 9,0 ± 0,19 73,7

Через 4 мес. 7,9 ± 0,20 76,2

Примечание: * - титруемую кислотность определяли из средней пробы, объединением остатков содержимого флаконов (п = 10) после отбора проб для определения титра.

ЛИТЕРАТУРА

1. Борисенко Е.Г. Дрожжевые пробиотики: технология и биологическое действие / Е.Г. Борисенко, С.Ю. Солдатова // Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. матер. междунар. науч.-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. — М., 2002. — С. 76.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. — М.: Практика, 1999. — 459 с.

3. Глушанова Н.А. Экспериментальное изучение колонизации кишечника гомопробиотиками / Н.А. Глушанова // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - Т. 19, № 1. - С. 48-51.

4. Глушанова Н.А. Экспресс-метод определения максимального накопления живых клеток лактобактерий / Н.А. Глушанова, А.И. Блинов, Б.М. Дворецкий // Бюл. лабораторной службы: Информационное издание Красноярской краевой Ассоциации медицинской лабораторной диагностики. - 1998. - Вып. 6. - С. 23-25.

5. Доронин А.Ф. Функциональное питание /

A.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров. - М.: Грантъ, 2002.

- 296 с.

6. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева,

B.В. Поспеловой. - М.: ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002. - 608 с.

7. Инструкция по изготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях № 11-14/6-33: Утв. МЗ СССР от 27.03.87. М.: МЗ СССР, 1987. - 12 с.

8. Козьминых Ю.В. Подбор и конструирование питательных сред для производства жидких пробиотиков / Ю.В. Козьминых, А.В. Малков,

В.Н. Марков // Пробиотические микроорганизмы

- современное состояние вопроса и перспекти-

вы использования: Сб. матер. междунар. науч.-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. — М., 2002.

- С. 77-78.

9. Петров Л.Н. Витафлор. Бактерийный препарат нового поколения для лечения и профилактики дисбактериозов / Л.Н. Петров. — СПб.: Санкт-Петербургская торгово-промышленная палата, 2003. — 68 с.

10. Скородумова А.М. Диетические и лечебные кисломолочные продукты (микробиологические основы). 2-е изд. / А.М. Скородумова. — МЕД-ГИЗ, Ленинградское отделение. — 1961. — 203 с.

11. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17 / Т.Я. Вахитов, Е.Н. Момот, О.Н. Шалаева, Л.Н. Петров // Журн. микробиол. — 2003. — № 6. — С. 20 — 25.

12. Способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала: Пат. 2178171 Россия, МКИ Cl 7 7 G 01 N 33/48, C 12 N 1/ 20. / Н.А. Глушанова, А.И. Блинов, Б.М. Дворецкий (Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей). № 2000119999/14. За-явл. 26.07.2000. Опубл. 10.01.2002, Бюл. № 1.

13. Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл.: Дис. ... канд. мед. наук. — М., 1990. — 146 с.

14. Шендеров Б.А. Микробиологическая характеристика некоторых анаэробных грамполо-жительных необразующих споры бактерий, обитающих в организме человека / Б.А. Шендеров // Медицинские аспекты микробной экологии. — М., 1991. — С. 6—17.

15. Holzapfel W.H. Introdoction to pre-and probiotics / W.H. Holzapfel, U. Schilinger // Elsevier Scince Ltd. — Food Research International. — 2002.

— Vol. 35. — P. 109—116.