CC BY
37
Щ SCIENCE TIME Щ
(jj II < 5л ' 1-1Ф -1 щг 1 - 4_W JT |Г1 1 r^g) БИОСИНТЕЗ И ОЧИСТКА р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ ИЗ BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM Букуру Лиз Криста, Скворцов Евгений Владимирович, Багаева Татьяна Вадимовна, Казанский федеральный университет, г. Казань E-mail: blysechrista@yahoo.fr E-mail: eskvortsov@rambler.ru E-mail: tatbag@rambler.ru
Аннотация. в-галактозидаза - фермент класса гидролаз, катализирующий расщепление лактозы на галактозу и глюкозу и прежде всего находит широкое применение в молочной, пищевой и фармацевтической промышленности. В нашем исследовании определён наиболее активный продуцент в-галактозидазы-— Bifidobacterium bifidum с максимальной в-галактозидазной активностью 512 IU/ml на 3 сутки культивирования. На разных этапах очистки КЖ бактерии рода Bifidobacterium bifidum получена наибольшая в-галактозидазная активность (174.363 IU/ml) при проведении высаливания белков 80% раствором сульфата аммония и 52.095 IU/ml в отдиализованном образце.
Ключевые слова. в-галактозидазная активность, продуцент, Trichoderma reesei - M18.2, Bifidobacterium bifidum, Bacillus megaterium, в-галактозидаза.
Фермент в-галактозидаза (EC 3.2.1.23) - расщепляет лактозу молока на глюкозу и галактозу. в -галактозидазы является важным ферментом в пищевой и фармацевтической промышленности. Гидролиз лактозы в глюкозу и галактозу с помощью в-галактозидазы является одним из важных процессов в пищевой промышленности и имеет важное технологическое и экологическое значение [1]. В молочной промышленности в-галактозидазы используются для предотвращения кристаллизации лактозы для увеличения сладости молочных продуктов [2]. Он также используется для увеличения растворимости молочного продукта у людей с непереносимостью лактозы или с лактазной недостаточностью [3]. Следует отметить, что лактазная недостаточность является наиболее часто встречающейся патологией тонкой кишки, для которой характерно развитие синдрома нарушенного переваривания и всасывания [4].
I
SCIENCE TIME
I
Однако Р-галактозидазы являются ферменты, которые очень полезны в качестве катализаторов, которые представляют несколько интересных применений в пищевой промышленности, например, гидролиз лактозы в молоке для производства новых молочных продуктов без лактозы в их составе. Полное устранение лактозы в молоке требуется решить проблему непереносимости лактозы в большой процент населения мира. Также предотвращение кристаллизации лактозы или увеличение сладости во время приготовления мороженого, сгущенного молока и т.д. - интересные преимущества этой реакции
ß-галактозидазу получают из животных, растений и микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи). Микроорганизмы, способные использовать лактозу в качестве единственного источника углерода и энергии являются продуцентами ß - галактозидазы. Коммерческие лактазы производятся из дрожжей рода Kluyveromyces Lactis и Kluyveromyces fragilis, и плесневых грибов рода Aspergillus niger и Aspergillus огугае [6], бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium [7]. Очень часто для очистки белков применяются метод центрифугирования, высаливания при разных концентрациях солей сульфата аммония(NH4)2SO4 и метод диализа [7]. Увеличение производства безлактозных продуктов питания и поиск новых эффективных продуцентов ß - галактозидаз является актуальной задачей в пищевой и фармацевтической промышленности для укрепления здоровья людей с лактазной недостаточностью. В связи с этим продолжают быть актуальными исследования, направленные на поиск новых эффективных продуцентов ß - галактозидаз. Исходя из этого, цель работы -скрининг продуцентов ß -галактозидазы и оптимизация процессов её очистки.
Материалы и методы исследования
В работе использовали микроскопический гриб Trichoderma reesei M18.2, предоставленный лабораторией Саксонского института прикладной биотехнологии (Лейпциг, Германия), полученный путём селекции штаммов, подвергнутых воздействию мутагенных факторов, бактерии рода Bifidobacterium bifidum и бактерии рода Bacillus megaterium.
Культивирование микроорганизмов. Культивирование Trichoderma reesei M18.2, Bacillus megaterium, Bifidobacterium bifidum для выявления у них ß-галактозидазной активности проводили глубинным способом в колбах ёмкостью 250 мл с объёмом питательной среды 50. Стерилизацию осуществляли на автоклаве ГК - 100 (Тюмень) при 120°С 30 минут. Культуры микроорганизмов для инокуляции выращивали на скошенном КГА в 20 мл пробирках в течение 5 суток при температуре 2 8 оС. Bifidobacterium bifidum выращивали в колбах ёмкостью 250 мл с объёмом питательной среды 50 мл жидкой среде гидролизата казеина факультативно анаэробном способом при 37.5°С. Культивирование
[5].
| SCIENCE TIME |
микроорганизмов Trichoderma reesei - M18.2 при 28°С и Bacillus megaterium в жидких средах осуществлялось, 37°С, 130 об/мин в темноте на шейкере -инкубаторе «INNOVA 43R» (USA). Длительность культивирования составляла 6 суток. Отбор проводили в течение 5 дней.
Определение р-галактозидазной активности. Определение Р-галактозидазной активности проводили в отфильтрованной культуральной жидкости по методу Konig [9] с модификациями. Субстрат для определения Р-галактозидазной активности - 1% лактоза в ацетатном буфере. Измеряли абсорбцию при длине волны 540 нм на спектрофотометре «Shimadzu 1800». Выход восстанавливающих сахаров определяли по калибровочным графикам, построенным по глюкозе.
Выделение и очистка р-галактозидазы. Проводили частичную очистку фермента найболее эффективного продуцента. С этой целью, полученный супернатант центрифугированием культуральной жидкости при 10 тыс. об./мин. в течении 10 мин и осаждали 80% сульфатом аммония в охлажденном состоянии на 24 часа. Полученный расвор центрифугировали при 10 тыс. об/ мин. 20 мин. Полученный осадок растворяли в 0.05 М ацетатном буфере (1.36г CH3COONa + 0.294г СаС12 в 90мл дН2О + 0.4мл Tween, довести до 100мл, рН 5.0). Затем диализовали на 48 часов в холодильнике. Были измерены концентрация белка и ферментативная активность в культуральной жидкости Bifidobacterium bifidum на каждом этапе очистки.
Для статистической обработки данных использовали программу Excel. Для сравнения применяли интервальные оценки. Уровень значимости р < 0,05. Данные на рисунке представлены как среднее ± стандартное отклонение [10].
Результатов и обсуждение
Проведён скрининг р-галактозидазной активности культуральной жидкости продуцентов Trichoderma reesei M 18.2, Bacillus megaterium и Bifidobacterium bifidum. На графиках (рис.1) представлена динамика изменения р -галактозидазной активности при культивировании продуцентов в течение 5 суток. Видно, что у бактерий рода Bifidobacterium bifidum и у бактерий рода Bacillus megaterium, активность фермента увеличивалась с начала культивирования до третьих суток, а у микроскопического гриба Trichoderma активность увеличивалась в течении четырех суток. р-галактозидазная активность у бактерии рода Bifidobacterium bifidum достигла максимума 512 IU/ ml на третьи сутки культивирования. Максимум активности у бактерии рода Bacillus megaterium составлял 170.3 IU/ml, что значительно меньше по сравнению с бактериями Bifidobacterium bifidum. В культуральной жидкости (КЖ) микроскопического гриба Trichoderma reesei M 18.2 максимум активность фермента отмечен на четвертые сутки и составлял 41.33 IU/ml.
Сравнивая р-галактозидазную активность всех трех микроорганизмов в течение 5 суток, видно, что наиболее эффективным штаммом является Bifidobacterium bifidum. Максимум его активность проходился на 3 сутки и составлял 512 IU/ml.
Рис. 1 Динамика изменения р-галакгозидазной активности КЖ исследуемых микроорганизмов в течение 5 суток
На табл.1 представлены характеристики культуральной жидкости наиболлее эффективного продуцента р-галактозидазы на разных этапах её очистки.
Таблица 1
Характеристики культуральной жидкости Bifidobacterium bifidum на разных этапах очистки
До высаливания После высаливания После диализа
Концентрация белка, мг/мл 24.106 13.391 4.670
Р-галактозидазная ак-тивность,IU/ml 137.333 174.363 52.095
Удельная Р-галактозидазная активность, IU/мг 5.697 13.021 11.155
Выводы
В данном исследовании проведён скрининг микроорганизмов продуцентов Р-галактозидазы(рис.1). Наиболее активным продуцентом являлся Bifidobacterium bifidum. Её максимальная р-галактозидазная активность была отмечена на 3 сутки культивирования и составляла 512 IU/ml. При высаливании
I SCIENCE TIME I
белков КЖ Bifidobacterium bifidum, отобранной на 6 сутки культивирования (табл.1), общая концентрация белков составила 13.391 мг/мл; а ß-галактозидазная активность 174.363 IU/ml, удельная активность 13.021 IU/мг. После диализа высоленных белков, концентрация белков составила 4.670 мг/мл, а ß-галактозидазная активность 52.095 IU/ml, удельная активность 11.155 IU/мг.
Литература:
1. Maity, M. Studies on Isolation and Characterization of Lactase Produced from Soil Bacteria [Text] / Maity M., Sanyal S., Bhowal J. and Bhattacharyya D. K // Research Journal of Recent Sciences. - 2013. - Vol. 2 ( ). - P. 92-94.
2. Princely, S. Biochemical characterization, partial purification, and production of an intracellular beta-galactosidase from Streptococcus thermophilus grown in whey [Text] / S. Princely, N. Saleem Basha, J. John Kirubakaran and M.D. Dhanaraju // European Journal of Experimental Biology. - 2013, 3 (2): P. 242-251
3. Murugan, T. Isolation, screening and characterization of ß-galactosidase enzyme producing microorganisms from four different samples [Text] / T. Murugan // Global research journal of pharmaceutical sciences grjps. - 2013. Vol. 2. Issue 1. P. 12-14
4. Бабаян М.Л. Лактазная недостаточность: современные методы диагностики и лечения / М.Л. Бабаян // remedium.ru [Электронный ресурс]. - URL: http: //http:// www.remedium.ru/drugs/doctor/pediatrics/detail.php?ID=60570/
5. Benavente, R. Improving Properties of a Novel ß-Galactosidase from Lactobacillus plantarum by Covalent Immobilization [Article] / Rocio Benavente, Benevides C. Pessela, Jose Antonio Curiel, Blanca de las Rivas, Rosario Muñoz, Jose Manuel Guisán, Jose M. Mancheño, Alejandra Cardelle-Cobas, Ana I. Ruiz-Matute, and Nieves Corzo // Molecules, 20, 7 74-7 9; - 2015. -DOI: 10.3390/molecules20057 74.
6. Swati, S. Biotechnological utilization of dairy waste to solve environmental problem [Text] / Swati Soni and Sanjay Timande // Journal of Environmental Research and Development. - 2012. - Vol. 6. No. 3A. - P. 721-726.
7. Mozumder, N. Study on Isolation and Partial Purification of Lactase (ß-Galactosidase) Enzyme from Lactobacillus Bacteria Isolated from Yogurt [Text] / N. H. M. R. Mozumder, M. Akhtaruzzaman, M.A. Bakr and Fatema-Tuj-Zohra // J. Sci. Res. - 2012. 4 (1). P. 239-249.
8. Rafal, A. Extraction and purification of ß-galactosidase from a local isolate of lactobacillus acidophilus [Text] / RafaL Ahmad, Mohammed A. Jebor, Anwara. Abdulla & Rasha K. Mahdi // International Journal of Medicine and Pharmaceutical Sciences (IJMPS) ISSN (P): 2250-0049; ISSN (E): 2321-0095. - 2014. - Vol. 4. P. 4754.
9. König, J. Determination of xylanase, glucanase, and cellulase activity [Text] / J. König, R. Grasser, H. Pikor, K. Vogel // Anal Bioanal Chem. - 2002. - V. 37. - P. 0-7.
| SCIENCE TIME |
10. Акберова Н.И. Описательная статистика. Интервальные оценки: Учебно-методическое руководство и сборник задач к практическим занятиям по курсу «Математические методы в биохимии» [Текст] / Н.И. Акберова. - Казань: Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина. - 2004. -40 с.
