CC BY
50
Химия растительного сырья. 1999. №2. С. 81-84
УДК 634.0.86:547.992:577.158
БИООТБЕЛКА СУЛЬФАТНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ОКСИДАЗНЫМИ ФЕРМЕНТАМИ ГРИБА DAEDALEOPSIS CONFRAGOSA
© Г.П. Александрова, С.А. Медведева
Иркутский институт химии СО РАН, Иркутск (Россия) E-mail: admin@irioch.irk.ru
В работе изучена лигниндеструктирующая способность базидиального гриба Daedaleopsis confragosa. Показана перспективная возможность использования комплекса оксидазных и ксиланазных ферментов, продуцируемых грибом, для деструкции и снижения содержания остаточного лигнина сульфатных целлюлоз.
Введение
Одной из актуальных проблем целлюлознобумажной промышленности является создание схем отбелки, исключающих использование элементарного хлора из процесса получения беленых целлюлоз. Хлор заменяют различными реагентами, например, пероксидом водорода, озоном, кислородом. В качестве делигнифицирующего агента могут использоваться ферменты дереворазрушающих грибов [1]. Качественный состав и де-лигнифицирующая активность ферментного комплекса зависят от свойств продуцента, поэтому, несмотря на большой объем исследований, поиск высокоактивных лигнинолитических культур остается актуальным.
Целью работы явилось определение возможности использования на предварительной ступени делигнификации лигноцеллюлозных материалов ферментов базидиомицета Daedaleopsis confragosa.
Экспериментальная часть
В работе были использованы культуры базиди-альных грибов Phanerochaete sanguinea (Fr) Bres. BKMF-2487D и Daedaleopsis confragosa. Инкубирование грибов осуществляли в термостатируе-
мых условиях при оптимальной для грибов температуре 26°С. В качестве субстрата использовали древесину осины в возрасте 30-40 лет, произрастающую на территории Иркутской области. После пропитки образцов размером 20x30x5 мм дистиллированной водой их стерилизовали в автоклаве 30 мин при 0.5 атм. В конических широкогорлых колбах емкостью 500 мл на сусло-агаровой среде выращивали культуры грибов в течение 7 сут. После разрастания мицелия в колбы помещали образцы древесины и культивировали в термостате 14-84 сут. По окончании опыта определяли потерю массы каждого образца с учетом влажности. Близкие по потере массы образцы объединяли, измельчали и отбирали пробы для химического анализа. Содержание целлюлозы в образцах определяли по методу Кюршнера, лигнина - по методу Класона в модификации Комарова [2]. Потери целлюлозы (С) и лигнина (Ь) рассчитывали от их первоначального количества.
Соотношение количества разлагаемых культурами целлюлозы и лигнина в субстрате характеризовали индексом ксилолиза [3] 1с=С/(С+Ь), где С и Ь - потери целлюлозы и лигнина.
Для определения ферментативной активности гриб Daedaleopsis сonfragosa культивировали на жидкой питательной среде Кирка, содержащей
0.1 % глюкозы [4]. Отбор проб проводили ежедневно в течение 20 сут. Содержание белка в ферментных препаратах определяли по методу Брэдфорда [5].
Активность лигниназы определяли спектрофотометрически при 310 нм по скорости окисления вератрового спирта до вератрового альдегида [4]. Активность лакказы определяли по скорости окисления пирокатехина при 410 нм [4].
Ксиланазную активность определяли по способности гидролизовать ксилан [6], целлюлазную активность определяли по количеству редуцирующих сахаров, образующихся при гидролизе фильтровальной бумаги [6]. Редуцирующие сахара определяли методом Шомоди-Нельсона, используя в качестве стандарта ксилозу и глюкозу соответственно [6].
Ферментативная обработка целлюлозы. Стерильную навеску целлюлозы массой 400 мг помещали под разросшийся мицелий семисуточной культуры Daedaleopsis confragosa и четырнадцатисуточной культуры Phanerochaete sanguinea и инкубировали при постоянной температуре в течение 7-15 сут. По окончании культивирования параллельные образцы объединяли и обрабатывали в течение 0.5 ч при 70°С 1 н раствором №ОН. Содержание остаточного лигнина в образцах целлюлозы определяли стандартным методом по числу Каппа [2], содержание целлюлозы - по методу Кюршнера [2]. Пероксидную отбелку выполняли при 80°С с расходом пероксида водорода 3%, гидроксида натрия 3%. После промывки дистиллированной водой готовили стадартные отливки для определения белизны.
Обсуждение результатов
Гриб Daedaleopsis confragosa был выбран в результате целенаправленного скрининга [7] по лиг-ниндеструктирующей способности (индексу ксилолиза) (табл. 1). За относительно короткий срок инкубирования (14 сут) при небольшой потере массы древесины (ПМД) (5%) и целлюлозы (всего
0.9%), потери лигнина, вызванные действием Daedaleopsis confragosa, составляли 23%. Эти показатели деятельности гриба, с точки зрения эффективности и избирательности делигнификации, несколько лучше, чем для Phanerochaete
sanguinea, одного из наиболее известных [8] лиг-нинолитических грибов (табл. 1 ).
Биоотбелка сульфатных целлюлоз может осуществляться ферментами, прежде всего, оксидаз-ного типа за счет окислительной деструкции лигнина, что приводит к его функционализации и способствует увеличению растворимости [1]. Среди лигнинразрушающих ферментов известны лиг-нинпероксидаза и лакказа, которые осуществляют одноэлектронный перенос с молекулы субстрата -лигнина - и тем самым катализируют широкую серию далее протекающих с ним реакций [9]. Кроме того, гемицеллюлазные ферменты способны гидролизовать гемицеллюлозы, переосажден-ные на поверхности целлюлозного волокна, облегчая последующую экстракцию лигнина. В связи с этим среди внеклеточных ферментов, продуцируемых Daedaleopsis confragosa, мы выявили наличие лигнинпероксидазной, лакказной, ксила-назной и целлюлазной активностей (табл. 2). Максимальная активность перечисленных ферментов проявляется у гриба на 7 сутки культивирования. Активность лигнинпероксидазы оказалась доминирующей, а целлюлазы - минимальной. Такое сочетание ферментативной активности позволяет считать Daedaleopsis confragosa перспективной культурой для использования в процессах отбелки.
Обработку небеленой сульфатной хвойной целлюлозы осуществляли семидневной культурой Daedaleopsis confragosa и проследили влияние продолжительности обработки на состав сульфат-целлюлозной массы в сравнении с Phanerochaete sanguinea (табл. 3).
Таблица 1. Изменение компонентного состава древесины осины при воздействии дереворазрушающих грибов
Сроки ин- Потеря Содержа- Потери Содержание Потери Индекс ксило-
Микроорганизм кубирова- массы дре- ние лиг- лигни- целлюлозы, целлюло- лиза,
ния, сут. весины, % нина, % на, L % % зы, C % Ic = C/(C + L)
Контроль 18.5 55.1
Daedaleopsis 14 5.0 15.6 22.8 54.9 0.9 0.03
confragosa 28 13.1 14.7 27.7 49.8 8.6 0.24
28 6.4 17.8 4.0 52.4 4.9 0.55
Phanerochaete
30 8.9 16.8 9.2 51.8 6.0 0.39
sanguinea
84 13.6 15.1 18.4 48.0 12.9 0.41
Таблица 2. Динамика ферментативной активности и секреции белка грибом Daedaleopsis confragosa
Активность, Е\мл
5 сут 6 сут 7 сут 8 сут 9 сут 13 сут 15 сут
Лигниназа 0.38 2.33 2.49 1.79 0.55 0.33 0.29
Лакказа 0.14 0.23 0.52 0.40 0.21 0.18 0.16
Ксиланаза 0.04 - 0.58 0.21 0.07 0.07 0.07
Целлюлаза 0.15 - 0.29 0.18 0.06 0.06 0.05
Белок, мг\мл 0.88 0.99 1.16 1.30 1.21 1.10 1.05
Таблица 3. Изменения сульфатцеллюлозной массы при воздействии дереворазрушающих грибов
Микроорганизм Сроки ин-кубирова-ния, сут Число Каппа, ед. Содержание лигнина, % Потери лигнина, L % Потери целлюлозы, C % Белизна, % Белизна после пероксидной отбелки, %
Контроль 36 5.4 23.0 53.5
Daedaleopsis 7 29.5 4.4 22.3 3.6 30.0
œnfragosa 15 26.1 3.9 36.7 10.9 33.0 59.5
Phanerochaete 10 29.6 4.4 21.4 7.7 29.0
sanguinea 14 24.7 3.7 41.6 14.2 32.0 58.5
Воздействие грибов на целлюлозу однозначно способствует повышению ее белизны. Daedaleopsis confragosa за 7 сут культивирования деструктирует лигнина столько же (22.3%), сколько и Phanerochaete sanguinea за 10 сут (21.4%), а потери целлюлозы при этом в 2 раза меньше. При более длительных сроках инкубирования (14-15 сут) Phanerochaete sanguinea по эффективности делигнификации превосходит Daedaleopsis confragosa (потери лигнина составляют 41.6 и 36.7% соответственно), но при этом больше разрушает целлюлозу (14.2 и 10.9% соответственно). Эти результаты наглядно показывают достоинства Daedaleopsis con-
fragosa в процессах избирательной деструкции лигнина в небеленой целлюлозе.
Ступень биологической отбелки мы совместили с последующей ступенью пероксидной отбелки. При отбелке пероксидом водорода биологически обработанной целлюлозы удалось получить целлюлозу с более низким содержанием лигнина и белизной на 6% выше, чем при прямой пероксидной отбелке.
Таким образом, показана перспективная возможность использования комплекса окси-дазных и ксиланазных ферментов, продуцируемых Daedaleopsis confragosa, для деструкции и увеличения экстрагируемости остаточного лиг-
нина сульфатных целлюлоз. Установлено, что введение предварительной микробиологической стадии в схему отбелки пероксидом водорода дает возможность повысить белизну хвойной сульфатной целлюлозы на 6%, снизив ее жесткость на 5 ед. Каппа.
Список литературы
1. Медведева С.А., Александрова Г.П., Бабкин
В.А. Экологическое преобразование производства целлюлозы на основе биотехнологий //Химия в интересах устойчивого развития. 1996. № 5-6. С. 313-320.
2. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович
А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М., 1991. 319 с.
3. Соловьев В.А., Малышева О.Н., Малева И.Л., Саплина В.И. Изменение химического состава древесины под действием лигнинразрушающих грибов // Химия древесины. 1985. №6. С. 94-100.
4. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Белик Ю.В. Внеклеточные ферменты неко-
торых лигнинолитических базидиомицетов рода Trametes // Химия древесины. 1994. №2. С. 39-45.
5. Bradford M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
6. Методы экспериментальной микологии / Под ред. Билай В.И. Киев, 1982. 550 с.
7. Александрова Г.П., Медведева С.А., Петров
A.Н., Бабкин В.А. Скрининг лигнинразрушающих грибов для биотехнологических процессов // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. №3. С. 270-275.
8. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин
B.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Совершенствование биологической отбелки сульфатной целлюлозы // Химия древесины. 1993. №4. С. 14-17.
9. Головлева Л.А., Леонтьевский А. Биодеградация лигнина // Успехи микробиологии. 1990. Вып. 24.
C. 128-155.
Поступило в редакцию 22.06.1999.
