CC BY
32
УДК 579.84/86:57.083 Д. О. Степанський
Б1ОЛОГ1ЧНА РОЛЬ ГРАМПОЗИТИВНИХ КАТАЛАЗОНЕГАТИВНИХ КОК1В I МЕТОДИ IX ВИД1ЛЕННЯ ТА 1ДЕНТИФ1КАЦ11
Дтпропетровська державна медична академiя
кафедра мiкробiологii, вiрусологii, iмунологii та епiдемiологii
(зав. - д. мед. н., проф. Г.М.Кременчуцький)
Ключовi слова: грампозитивш каталазонегативнi коки, методи 1дентиф1каци, тфекцп Key words: gram-positive catalase-negative cocci, methods of identification, infections
Резюме. В статье речь идет об особенностях малоизученной группы микроорганизмов (граммположительные каталазоотрицательные кокки) и обобщаются мировые достижения в методах их выделения и идентификации. Особенно актуально вопросы выделения и иденти-фикаци стоят в наше время, когда наблюдается рост тяжелых инфекций, вызванных граммположительными каталазоотрицательными кокками. В связи с большой актуальностью этот вопрос должен привлечь внимание не только микробиологов, но и практикующих врачей. Summary. The article dwells upon the peculiarities of the insufficiently explored group of microorganisms (gram-positive catalase-negative cocci) and generalizes the worldwide achievements in the methods of their distinguishing and identification. The problem of distinguishing and identification is particularly topical nowadays, when the rise of severe infections caused by gram-positive catalase-negative cocci is observed. Regarding a high actuality, this problem must draw attention both of microbiologists and practitioners.
В останш роки спостертаеться наростання частоти важких шфекцш, викликаних грампо-зитивними, каталазонегативними коками, яю ра-шше не враховувалися при видшенш культур збудниюв.
Група гем-негативних коюв мютить 12 родiв. Представники родiв усередиш ще! групи розрiз-няються продукщею пдролази L-пiролiдонил-P-нафтиламщу (L-pirrolidonyl-P-naphtylamide; PYR) i лейцинамшопептидази (LAP), здатшстю гидро-лiзувати ескулш у присутност солей жовч^ продукщею газу i3 глюкози, здатнiстю рости в при-сутностi 6,5% NaCl i при 45°C, рухливiстю, чутливiстю до ванкомщину та типом гемолiзу [ 7 ]. У лiтературi з'являеться усе бшьше статей про аерококи, що викликають рiзнi шфекци [6, 9]. Був описаний новий патогенний вид A.urinae, що викликае шфекци сечовивщних шлях1в, ендо-кардити й сепсиси, яю часто закiнчуються летально у людей л^нього вшу й пащенпв зi схильнiстю до сечових шфекцш [14].1з кровi та вагшального секрету були видiленi аерококи, вщнесет до роду Aerococcus, виду A. christen-senii [15]. 1з клiнiчних зразкiв (iз кровi хворих на пневмонiю, ендокардит i у хворих iз нез'ясо-ваною клшкою) було видiлено 16 культур, вщ-несених до виду A. sanguinicola. А. sanguinicola -каталазонегативнi, vancomycin-чутливi, грампо-зитивнi коки, розташованi скупченнями та тетрадами, як вс види Aerococcus, крiм А. chris-
tensenii (3 культури)[ 10]. На 0CH0Bi аналiзу 16S rRNA gene sequence and DNA-DNA hybridization data була проведена рекласифiкацiя виду Pedio-coccus urinaeequi, вiднесеного до роду Aerococcus з iм'ям Aerococcus urinaeequi comb. nov. [10] P.A. Lawson et al. (2001)[5] провели фшогенетичне й фенотишчне вивчення грампозитивних, ката-лазонегативних кокiв, видiлених i3 сечi. Порiв-няльне вивчення послщовност генiв 16S r-RNA показало, що видшеш коки е новим видом роду Aerococcus. Було запропоновано класифшувати новий вид як Aerococcus urinaehominis sp. nov.
[9].
Практичнi мшробюлоги часто не звертають увагу на описуваш мiкроорганiзми через 1хню нестандартшсть у вiдношеннi бiохiмiчних i фiзiологiчних властивостей, у результатi чого вони не враховуються в клiнiчних аналiзах. Необхiдна розробка спецiальних методiв транс-портування i 1хнього зберiгання, з огляду на те, що щ бактери е факультативно анаеробними, мшроаерофшьними, або облiгатно аеробними. Ми поставили за мету проаналiзувати спектр грампозитивних каталазонегативних ванкомщин-чутливих кокiв, видшюваних iз сечi хворих з шфекщею сечовивiдних шляхiв, що вiдносяться до аерококоподiбних кокiв.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ
Матерiалом дослiдження були аналiзи сечi хворих, що надiйшли в бактерюлопчну лабо-
раторда кафедри мшробюлоги з лiкарень м. Дшпропетровська. 3a6ip i транспортування ана-лiзiв, а також iдентифiкацiя мiкроорганiзмiв проводились згiдно з унiфiкованими методиками
[5, 9.]
Визначення продукци пероксиду водню до-слiджуваними культурами проводилось йодо-метричним методом [2]. 1дентифшащя культур аерококiв проводилася згiдно з визначником бак-терiй Берджi [15]. З метою виявлення аерокоюв при дослщженш сечi було додатково введене шдикаторне середовище з калiй-йод-крохмаль-ною системою визначення пероксиду водню, яка була розроблена Г.М. Кременчуцьким та сшвавт. [4]. Чутливють до антибiотикiв визначалася методом дифузи в агар iз застосуванням дискiв [3]. Антагошстична дiя аерококiв по вiдношенню до тест-культури мiкроорганiзмiв вивчалася з вико-ристанням методики вiдстроченого антагонiзму [1].
Наявшсть каталазно! активностi визначалась за методикою: частину колони помщають на предметне скло або порожню чашку Петрi й спостерiгають за появою пухирщв пiсля дода-вання краплi 3%-ого H2O2.
Тест чутливостi до ванкомщину визначався за методом Facklam i Вашингтона [13].
LAP-тест визначае наявшсть ферменту лей-цин-амiнопептидази (синонiм - лейцин-арила-мiдаза) i визначаеться за допомогою API -швидко! стрептококово! системи (bioMerieux Vitek, Hazewood, Мо.) та комерцшного швидкого дискового тесту LAP (Carr-Scarborough Microbio-logicals, Inc., Stone Mountain, Ga.).
Рiст на 6,5% NaCl визначався вщповщно до методу Facklam й Washington [13].
PYR-тест, тест на гiдролiз ескулшу визнача-лися згiдно iз загальноприйнятими методиками
[9].
Якщо проводилась вибiркова iзоляцiя членiв ванкомiцинрезистентних родiв Leuconostoc й Pediococcus, використовувалось середовище Та-ер-Мартина, щоб пригнiтити рют нормально! флори й iнших контамшаипв [7].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
Дослiдження проводилися на базi мшро-бюлопчно! лаборатори Дншропетровсько! державно! медично! академи. Було проведено 2730 аналiзiв сечi, що надiйшли в лабораторда з лiкувальних установ мюта. Видiленi аероко-коподiбнi мiкроорганiзми з сечi склали 3,7% (101 мшрооргашзм). Всi штами були видiленi вщ осiб з iнфекцiями сечовивiдних шляхiв (1СВШ), не супутнiх iншим захворюванням.
Таблиця 1
Перелж штампв аерококопод1бни\ м1кроорган1зм1в, видшених з аналЫв сеч1
Юльюсть культур
.Щагноз
10 61
5
24 101
Хротчний телонефрит
1нфекци сечовив1дни\ шляхш у ваг1тни\
Гострий телонефрит
Хрон1чний цистит
Всi видшеш культури були грампозитивними, нерухомими коками 1,0- 2,0 мкм у дiаметрi, розташовувалися парами та кластерами. У мазках iз культур, вирощених на рщких жи-вильних середовищах, вони розташоваш тетрадами. На агаризованих середовищах бактери утворюють бiло-сiрi колони. На кров'яному агарi викликають а-гемолиз, можливо, за рахунок утворення Н2О2, хоча проведенi нами модельнi експерименти по введенню розчинiв Н2О2 в кров'яний агар не дали позеленшня кров'яного агару. На вдикаторному середовищi з калш-йод-крохмальню системою продукщя аерококами пероксиду водню дае характерну зону посиншня. Видiленi аерококоподiбнi мшрооргашзми були каталазонегативними факультативними анаеро-бами. Подiбно до ентерококiв, вони росли на середовищах, що мютять 6,5% №С1, але не росли при 45°С. Росли в молоцi з 0,1% мети-леновим синiм без редукци. Розкладали рiзно-манiтнi вуглеводи з утворенням кислоти, але не газу. На пiдставi даних, наведених у роботах [5, 10], нами було тдсумовано у таблицi власти-востi видiлених видiв аерококiв асимшювати вуглеводи, !хне вiдношення до основних диференцiальних тестiв та !х щентифшащя.
Необхiдно вiдзначити, що при шфекщях сечовивiдних шляхiв найчастiше видiлялися А. игтае i А.urinaehominis, що вщповщае даним лiтератури [5, 11]. Характерною особливютю А. viridans е поява кольорово! реакцi! при !х зростанш на спецiальному iндикаторному середовище Ця властивiсть використовувалася нами при !х iдентифiкацi!. На фотографi! представлен культури А. viridans, посiянi у виглядi бляшок на спецiальне середовище.
09/ Том XIV/1
13
Таблиця 2
Розподш pi3BHx вид1в аерококчв на пiдставi здатностi асимшювати вуглеводи i Тхие вщношення до основних диференц1альни\ тест1в
A. christensenil A. sanguinicola A. urinae A. urinaeequi A. urinaehominis A. viridans
Лактоза - - - вар. - +
Мальтоза - + - + + +
Маттол - - + вар. - вар.
Рибоза - - вар. + вар.
Сахароза - + + + + +
Трегалоза - + - + - +
Р-глюкуронидаза - + + - + вар.
Кисла пироглю- тамшова - + +
ариломидаза
Лейцин- -арилам^даза + + - - -
Аргiнин-гiдролаза - + - - - -
Гвдролз гiппурату вар. + + - + +
Гiдролiз ескулiну - + - - + вар.
Юльюсть вид1в 6 5 45 0 30 15
аерококш
Ця властивiсть характерна саме для Aero-coccus viridans, що окиснюють молочну кислоту. Iншi грампозитивнi каталазонегативш мшро-органiзми в меньшому ступеш мають цю здатнiсть, окиснюючи вщновлений нiкотинамiд-динуклеотид.
Положення про iдентифiкацiю аерокоюв, представленi в цьому роздiлi, вщбивають дос-тупну iнформацiю, у цей час вщносно нечасто iзольовуваних грам-позитивних коюв, якi е факультативними анаеробами. Додатковi таксо-номiчнi дослiдження клшичних iзолятiв можуть змiнити схеми щентифшаци, представленi тут. Хоча морфолопя й забарвлення за Грамом (яи найкраще вiзуалiзуються в бульйонних культурах) дають суб'ективну штерпретащю, це вико-ристовуеться як головний пункт ршення в iдентифiкацi! двох категорiй: грампозитивна морфолопя, подiбна до стрептококiв, що пред-ставляе коки в парах i ланцюжках; i стафшо-кокова морфолопя, що складаеться з кокоподiб-них клiтин (звичайно бiльше сферично! форми), розташованих парами, кластерами або тетрадами.
На додаток до перерахованих ознак аерококи ростуть слабко або не ростуть, коли культи-вуються в анаеробнш атмосферi [9]. Це можна перевiрити iнкубацiею двох культур на чашках iз кров'яним агаром в анаеробнш й аеробнш атмосфер^ порiвнюючи рiст пiсля 24 - 48 h.
Aerococcus viridans й G. haemolysans чутливi до пенiцилiну й ванкомiцину i мають низький рiвень стiйкостi до амiноглiкозидiв.
Зони забарвлення навколо бляшок росту аерококiв
Buu-Hoi i колеги [8] вщзначили, що, незва-жаючи на те, що A. viridans природно стшю до макролiдiв, тетрациктну i хлорамфенiколу, iнодi спостерiгалася стшюсть до цих агентiв. A. urinae був описаний як чутливий до пенiцилiну й ванкомiцину, але стшкий до сульфонамiдiв i
нетилмщину, мае негативний PYR i позитивний LAP-тест, на вщмшу вiд A. viridans [6]. 1нфор-мацiя з гетерогенно! природи роду Aerococcus може бути знайдена в дослщженш Bosley [12]. Мiкробiологи повиннi радитися iз клiнiцистами в оцiнцi значення цих нечасто iзольовуваних органiзмiв [11].
ВИСНОВКИ
1. Грампозитивш коки, обговорюваш тут, можуть з'явитися в клшчних культурах як контамшанти або частина резидентно! флори, !хня iдентифiкацiя робиться, коли !хня iзоляцiя клiнiчно iстотна (тобто iзолюються неодно-
разово, у чистш культурi або зi звичайно сте-рильних).
2. Роль описаних мiкроорганiзмiв у виник-неннi шфекци сечовивщних шляхiв не може бути завжди причиною хвороби, а може залежити вiд величини контамшацп мiкроорганiзмiв у сеч^ починаючи з 104 - 105 КУО/мл .
3. Потрiбно пам'ятати, що щ бактери е опортушстами; iзоляцiя вiд iмунокомпетентного пащента, можливо, не мае того ж самого значення, як iзоляцiя вщ iмуноскомпрометованого хазя!на.
СПИСОК Л
1. А-бактерин в лечении и профилактике гнойно-воспалительных процессов: Монографш / Г.Н.Кре-менчуцкий, С.А.Рыженко, А.Ю.Вольнянский и др.-Днепропетровск: Пороги, 2000.- 150 с.
2. Государственная фармакопея СССР.- 10-е изд.- М.: Медицина, 1968.- 1079 с.
3. Об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам: Приказ № 250 МЗ СССР от 13.03.1975.-М., 1975.- 14 с.
4. Пат. 80892 Укра!на. Споаб визначення оксидно! активносп м1крооргашзм1в/ Г.М.Кременчуцький, Д.О.Степанський, Л.В.Х1лько (Укра!на).- № 200600328; заявл. 13.01.2006; Опубл. 12.11.2007, Бюл. № 18.
5. Aerococcus urinaehominis sp. nov., isolated from human urinea/ Lawson P.A., Falsen J.E., Ohlen M., Collins M. D. // International J. Systematic Evolutionary Microbiology.-2001.-Vol. 51.-P. 683-686.
6. Aguirre, M., Collins M.D. Phylogenetic analysis of some Aerococcus-like organisms from urinary tract infections: description of Aerococcus urinae sp. nov.// J. Gen. Microbiol.- 1992.-Vol. 138.-P.401-405.
7. Bascomb S., Manafi M. Use of Enzyme Tests in Characterization and Identification of Aerobic and Facultative Anaerobic Gram-Positive Cocci// Clin. Microb. Reviews.- 1998.- Vol. 11, N 2.- P. 318-340.
8. Buu-Hoi A., Le Bouguenec C., Horaud T. Genetic basis of antibiotic resistance in Aerococcus viridans// Antimicrob. Agents Chemother.- 1989.-Vol. 33.-P.529-534
9. Colman G. Aerococcus-like organisms isolated from human infections // J. Clin. Pathol. -1967.-Vol. 20.-P.294-297.
10. Facklam, R. R., Washington J. A. Streptococcus and related catalase-negative gram-positive cocci // Manual of Clinical Microbiology / Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D. et al.- 5th ed.- Washington, 1991.- Vol. 2.- P. 238-257.
11. Facklam R., Elliott J.A. Identification, classification, and clinical relevance of catalase-negative, Grampositive cocci, excluding the streptococci and enterococci // Clin. Microbiol. Rev.- 1995.-N 8.-P. 479-495.
12. Phenotypic characterization, cellular fatty acid composition, and DNA relatedness of aerococci and comparison to related genera / Bosley, G.S., Wallace P.L., Moss C.W. et al. // J. Clin. Microbiol. -1990.-Vol 28.-P.416-421.
13. Phenotypic Description and Antimicrobial Susceptibilities of Aerococcus sanguinicola Isolates from Human Clinical Samples / Facklam R., Lovgren M., Shewmaker P., Tyrrell G. // J. Clinical Microbiology.-2003.-Vol. 41, N 6.-P.2587-2592.
14. Schuur P.M., Kasteren M.E., Sabbe L. Urinary tract infections with Aerococcus urinae in the south of The Netherlands// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.-1997.- Vol.16, N 12. -Р.871-875.
15. The low G + C Gram-positive Bacteria / Bergey's Manual of Systematic Bacteriology George M. Garrity.-2-nd Edition.- New York : Editor-in- Chief Springer, 2006.- Vol. 3- P. 167-194.
09/ Том XIV/1
15
