CC BY
67
УДК 579. 869.1- 092.7: 616. 993-078 © С.М. Омарова, Р.И. Исаева, 2011
С.М. Омарова1, Р.И. Исаева2
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ LISTERIA MONOCYTOGENES, ВЫДЕЛЕННЫХ НА НОВЫХ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ЛИСТЕРИОЗА
БЕРЕМЕННЫХ И НОВОРОЖДЕННЫХ
1НПО «Питательные среды» филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ, г. Махачкала 2ГОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России,
г. Махачкала
Изучение оптимальных условий для роста и размножения листерий, в сочетании с оптимальными концентрациями элементов питания, дает возможность получить сбалансированный вариант среды, что особенно важно для сред выделения. Одним из основных оценочных показателей качества разрабатываемых питательных сред является сохранение стабильности биологических свойств культур, выращенных на этих питательных средах. Для этого изучают культурально-морфологические, биохимические, серологические, фаголизабельные, гемолитические и другие показатели выращенных культур. Известно, что образование факторов патогенности листерий зависит от внешних условий. При выращивании in vitro на исследуемых питательных средах на уровень продукции факторов патогенности влияет состав среды культивирования.
Ключевые слова: питательная среда, культура бактерий, рост, размножение листерий, стабильность сохранения, биологические свойства, выделение, культивирование.
S.M. Omarova, R.I. Isaeva
THE BIOLOGICAL PROPERTIES OF LISTERIA MONOCYTOGENES STRAINS RECEIVED ON THE BASE OF NEW HOME-PRODUCED SELECTIVE NUTRITIVE MEDIA FROM THE CLINICAL MATERIAL IN LISTERIA DIAGNOSTICS OF PREGNANT WOMEN AND NEW-BORNS
The investigation of optimal conditions for growth and reproduction listeria by combination with optimal concentrations of nutritive elements, gave the opportunity to take balanced variant of medium especially important for medium selections. One of the basic estimated indicators of quality cultivated nutritive medium is the keeping of stability of biological culture properties, selected on this nutritive medium. For this purpose there were studied cultural-morphologic, biochemical, serologic, hemolytic and other indicators of selected cultures. The formation of factors of listeria pathogenecity depends on environmental conditions. In the selection in vitro on studying nutritive medium on the composition of cultivated medium influence the level of production of pathogenecity factors.
Key words: nutritive medium, bacteria culture, growth, listeria reproduction, keeping stability, biological characteristics, selection, cultivation.
Введение. В современных условиях на фоне успешной борьбы с инфекционными заболеваниями значимость микробного фактора в патологии человека не только не снижается, но и проявляет тенденцию к росту [11, 12, 14]. На передний план выдвигаются новые, относительно недавно открытые, малоизученные инфекции. К ним относится и листериоз. Наибольшую опасность заболевание представляет для беременных женщин, новорожденных, лиц с пониженной иммунологической реактивностью, а также больных, подвергающихся гемодиализу и химиотерапии [5, 6, 13, 14, 15].
Снижение уровня клеточного иммунитета во время беременности, особенно в поздние сроки, обусловливает повышение восприимчивости к листериозной инфекции у беременных, вызывая выкидыши, мертворождение, пороки развития плода и т. д. Достоверных сведений об истинной распространенности листериозной инфекции среди беременных и новорожденных нет, а число выявленных случаев невелико. Однако согласно данным ряда исследователей смертность при перинатальном и неонатальном листериозе достигает 30-50%, в том числе при внутрибольничных вспышках в роддомах [6, 14, 15, 16].
Возрастание этиологической роли листерий в структуре инфекционной патологии человека диктует необходимость совершенствования качества диагностики, профилактики и санитарно-эпидемиологического надзора этой инфекции, требует усовершенствования существующих и создания новых, применяемых для этих целей иммунобиологических препаратов, необходимых для реализации современных схем выделения и идентификации Listeria monocytogenes в соответствии с международными стандартами [10, 13].
При конструировании питательных сред следует учитывать все факторы, которые, так или иначе, оказывают влияние на рост и размножение микроорганизмов. Разнообразие в питательных потребностях и физико-химических условиях роста (рН, температура, ионная сила и др.) у различных видов микроорганизмов исключает возможность создания универсальной питательной среды. Поэтому в каждом конкретном случае необходим выбор оптимального состава питательной среды, удовлетворяющей физиологическим
потребностям изучаемого микроорганизма и не загруженной балластными веществами органического и неорганического происхождения. Важную роль при этом играет подбор наиболее полного набора необходимых питательных веществ. К таковым относятся различные продукты гидролиза белкового сырья, которые могли бы быть полноценной питательной основой сред, в том числе и для листерий.
Коммерческие питательные среды, изготовленные на основе различных белковых гидролизатов с добавлением ростостимулирующих факторов, должны обеспечивать оптимальные условия для удовлетворения физиологических потребностей микроорганизмов, что позволяет сохранять в процессе культивирования стабильность их морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств.
Материалы и методы. В исследованиях изучены биологические свойства 26 клинических штаммов, выделенных из патологического материала при обследовании беременных, рожениц и родильниц с подозрением на листериозную инфекцию.
В качестве сред для выделения использованы отечественные и зарубежные питательные среды: ПАЛКАМ и Оксфорд агар фирмы Bio-Rad, а также питательные среды для выделения листерий и микротестсистемы (МТС-5Л и МТС-12Л) для биохимической идентификации выделенных штаммов (ФГУП «НПО «Микроген» НПО «Питательные среды», г. Махачкала).
В работе использовали физико-химические и микробиологические методы в соответствии с МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», а также Инструкции по применению производителя на коммерческие питательные среды и микротестсистемы. Контроль качества основ и образцов питательных сред по физико-химическим показателям осуществляли в соответствии с действующими нормативными документами ФС 42-3874-99 и требованиями Государственной фармакопеи, XI изд. [1,с. 113], рН экспериментальных образцов сред определяли с помощью универсального ионометра ЭВ-74 (ЗИП, г. Гомель).
Изучение специфической активности питательных сред проводили путем определения следующих характеристик: чувствительности среды, скорости роста, дифференцирующих свойств, ингибирующих свойств и показателя сохранения стабильности основных биологических свойств среды. Учет результатов и подсчет колоний производили визуально через 18, 24, 36 и 48 ч инкубации посевов при температуре (37 ± 1)°С.
Реакцию агглютинации на стекле, РНИФ, РПГА, ИФА и ПЦР выполняли по общепринятым методикам согласно инструкции производителя тестов. Для ПЦР исследований использовали амплификатор «Терцик», ЗАО НПФ ДНК-Технология (М., 2002).
Забор и посев исследуемого материала проводили по приказу МЗ СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».
Результаты исследований и их обсуждение. Известно, что окружающая среда, в том числе и питательная среда, действует на микроорганизм посредством физиологических раздражителей, к которым микроорганизм должен приспосабливаться в ходе своего развития. К этим раздражителям бактерий можно отнести физико-химические изменения параметров культивирования, таких как температура, рН среды и энергетические источники. Также большое значение для оптимального роста микроорганизма имеет сбалансированность элементов питания в составе среды [1, 2, 7, 8, 9].
Изучение оптимальных условий для роста и размножения листерий, в сочетании с оптимальными концентрациями элементов питания, дает возможность получить сбалансированный вариант среды, что особенно важно для сред выделения.
В связи с этим, нами проведено ряд исследований по изучению влияния указанных факторов на интенсивность роста и сохранение типичности основных биологических характеристик свежевыделенных штаммов листерий (тинкториальные свойства, форма и размер колоний, культуральные свойства штаммов).
Проанализировав литературные данные, мы установили, что листерии растут на простых питательных средах, способны к размножению в широком диапазоне температуры (4° С-45° С), рН (5,0-9,0) и влажности, в присутствии (20%) NaCL и 15% СО2. Высокая метаболическая пластичность листерий обуславливает возможность перехода их от сапрофитной фазы к паразитической и наоборот. Для сохранения вирулентных свойств листерий необходимы оптимальные условия культивирования, что особенно важно для накопления структурно и физиологически полноценной биомассы.
Известно, что существует ряд физических и химических факторов, влияющих на условия культивирования бактерий. Реакции со стороны последних на эти факторы могут быть как количественными (снижение интенсивности роста и др.), так и качественными (изменение морфологии бактерий и др.).
Согласно методическим рекомендациям ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича одним из основных оценочных показателей качества разрабатываемых питательных сред является сохранение стабильности биологических свойств культур, выращенных на этих питательных средах. Для этого изучают культурально-морфологические, биохимические, серологические, фаголизабельные, гемолитические и другие показатели выращенных культур.
Известно, что образование факторов патогенности листерий зависит от внешних условий. При выращивании in vitro на исследуемых питательных средах на уровень продукции факторов патогенности влияет состав среды культивирования [3, 4, 15].
Учитывая вышеизложенное, проведены исследования сохранения стабильности биологических свойств L. monocytogenes на модели 26 свежевыделенных штаммов, изолированных из клинического материала от обследованных с акушерско-гинекологической патологией.
Данные, полученные на этапах исследований показали, что протестированные клинические штаммы, выращенные на новых отечественных селективных средах для выделения листерий (САЛ-1 и САЛ-2), сохраняли свои культурально-морфологические и тинкториальные свойства: грамположительные мелкие палочки, неподвижные при инкубации в температурном режиме (37±1)° С, но обладавшие подвижностью в случае выращивания их при температуре (23±1)° С. Характер роста - мелкие колонии диаметром до 1,8 мм, блестящие, серого цвета, окруженные ореолом темно-коричневого цвета.
Серологические свойства в реакции агглютинации не стекле с групповыми сыворотками проявлялись у выделенных штаммов четко, не менее чем на «+++» плюса.
В работе были изучены биохимические свойства штаммов листерий, выращенных на экспериментально-производственных сериях разработанных сред САЛ-1 и САЛ-2, с использованием микротест-систем (МТС) - МТС-5Л и МТС-12Л. Штаммы листерий, пассированные на разработанных средах для выделения, сохраняли характерные ферментативные свойства культуры. Изучение ферментации углеводов показало, что культуры сохраняли основные биохимические свойства, ферментируя глюкозу, маннозу, рамнозу, эскулин, не ферментируя маннит, ксилозу, лактозу, арабинозу.
Следующим этапом исследования было изучение продукции штаммами листерий наиболее важных факторов патогенности - гемолизина и лецитиназы. Определение В-гемолитической активности листерий является одним из ключевых признаков при идентификации вирулентных штаммов. Для выявления В-гемолиза использовали чашки с сухим питательным агаром, с добавлением 5% крови. Чашку Петри делили на 8 секторов, в которые делали посевы штрихом исследуемых листерий, после процесса культивирования на разработанных средах. В качестве контрольного посева использовали листерии, обладающие В-гемолитической активностью -
L. monocytogenes, Listeria ivanovii, а в качестве отрицательного контроля - Listeria innocua. Посевы просматривали после 24-48 ч инкубирования при температуре (37±1)° С. Культуры L. monocytogenes образовывали узкие зоны гемолиза. Продукцию гемолизина изучали в опытах при культивировании свежевыделенных штаммов
L. monocytogenes в соответствующих жидких средах с последующим титрованием бесклеточных центрифугатов. В эксперименте установлено, что изоляция культур на разработанных средах для выделения, Палкам-агар и Оксфорд-агаре практически не влияла на степень экспрессии гемолизина - надосадочные жидкости изучаемой культуры, полученные с указанных сред, вызывали гемолиз эритроцитов в разведении 1:16 - 1:32, 1:64.
Определение лецитиназной активности культур L. monocytogenes, выращенных на разработанных селективных средах для выделения листерий, проводили путем культивирования на питательной среде для определения лецитиназной активности. Через (18±2) ч инкубации посевов отмечали четко выраженную индукцию лецитиназной активности - в виде плотной зоны помутнения вокруг колоний исследуемых штаммов.
Изучение сохранения выделенными штаммами L. monocytogenes вирулентных свойств проводили путем внутрибрюшного и внутривенного заражения мышей. Показано, что независимо от среды выращивания инфицирующего штамма - динамика гибели животных по дням, а также конечный результат исследования, практически идентичны. Так, LD-50 для штаммов L. monocytogenes (n=26) при внутрибрюшном заражении с использованием разработанной среды для выделения листерий САЛ-1 составляла 3,2-106±0,3 м.к., с использование среды для выделения САЛ-2 - 2,4-106±0,3 м.к, а с триптиказо-соевого агара (ТСА) -3,0-106±0,25 м.к. При внутривенном инфицировании мышей эти величины составляли соответственно 4,0-10 ±0,2м.к.; 3,5 105±0,3 м.к.; 3,0105±0,3 м.к.
При постановке кератоконъюнктивальной пробы на конъюнктиву глаза морской свинки наносили 2 капли испытуемой бульонной культуры, в дозе 102-103 мк/л клинических штаммов, выращенных на разработанных нами средах. Через 24-48 часа у морской свинки развивался гнойный кератоконъюнктивит, что подтверждало наличие и сохранение вирулентных свойств у выделенных штаммов в процессе культивирования в разработанных средах. Из гнойного отделяемого конъюнктивального мешка высевали типичную идентичную исходной по культуральным и биохимическим свойствам культуру L. monocytogenes.
Таким образом, клинические штаммы L. monocytogenes, выделенные на разработанных селективных питательных средах стабильно сохраняли вирулентные свойства культуры в процессе культивирования.
Одним из важных родовых признаков листерий является каталазная активность. Культуры, выращенные на разработанных средах для выделения листерий по наличию каталазы, определяемой непосредственно на чашке, не различались между собой.
В качестве показателя сохранения стабильности биологических свойств выращенных культур листерий изучали плазмидные профили ДНК L. monocytogenes. Известно, что генотипические и фенотипические характеристики бактериальных штаммов определяются наличием как хромосомной, так и внехромосомной (в частности, плазмидной) ДНК. Хотя стабильность сохранения внехромосомной ДНК может не зависеть от качества сред, используемых для культивирования бактерий, однако, в некоторых случаях использование
разных сред влияло на характеристику плазмидного состава исследованных штаммов [8]. С целью исследования влияния роста культуры на разработанных питательных средах на характеристику плазмидного состава штаммов листерий использован метод анализа плазмид в отношении безплазмидных культур листерий 7973, 4в, а также плазмидсодержащего клинического изолята L. monocytogenes 204. Выделение внехромосомной ДНК осуществляли путем лизиса бактериальной массы лизоцимом в щелочном растворе в присутствии SDS, деградации белковых компонентов с помощью фенола и хлороформа с последующим осаждением ДНК в этиловом спирте. При анализе образцов ДНК выделенных штаммов с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле, выявлено у изолята 204, выращенного на разработанной среде для выделения и ТСА стабильное сохранение плазмиды молекулярной массой 30 МД. Штаммы 7973 и 4в не содержали плазмидной ДНК. Таким образом, результаты исследования плазмидного состава штаммов листерий свидетельствуют, что разработанные среды для выделения листерий не влияют на состав плазмид у этих бактерий.
Далее была исследована чувствительность штаммов L. monocytogenes, выращенных на указанных средах, к специфичным бактериофагам. В экспериментах использованы два бактериофага - Л-2А, лизирующий культуры серотипа 1 и Л-4А - активной в отношении серотипа 4. Фаговые препараты получали путем размножения исходных бактериофагов на чувствительных культурах-хозяевах (штамм L. monocytogenes 9-127 1-го серовара для Л-2А и штамм 9-72 второго (четвертого по международной схеме) серовара для Л-4а. Фаги и штаммы-хозяева были получены из НИИ ветеринарии, вирусологии и микробиологии (г. Покров). Титр бактериофагов достигал 5 ■ 108-109 БОЕ/мл. Чувствительность тест культур к указанным бактериофагам определяли капельным методом с исследованием 16-18 часовой культуры, выращенной при 370С. Количество посевного материала определяли появлением легкой опалесценции в пробирке с бульоном. Учет проводили через 16-24 ч. На месте нанесения листериозного бактериофага появлялась зона лизиса.
Установлено, что культуры, выращенные на разработанных средах, также как и на ТСА, сохраняли чувствительность к фагам и с одинаковой высокой эффективностью лизировались в разведении 10-3-10-5 для L^ и 10"3-10"5 для L^.
Выводы. Разработанные селективные среды для выделения и культивирования листерий обладают высокой чувствительностью и специфичностью в отношении роста возбудителя листериоза, а также обеспечивают стабильное сохранение их вирулентных свойств. Все выделенные из клинического материала от женщин с отягощенным акушерским анамнезом культуры L. monocytogenes, выявлены с использованием разработанных питательных сред. Из исследуемого материала выделены грамположительные палочки, каталазоположительные, подвижные при (23±1)° С, неподвижные при температуре плюс 37° С; утилизирующие эскулин, ферментирующие с образованием кислоты рамнозу и маннозу и не ферментирующие маннит, ксилозу и арабинозу; формирующие зону В - гемолиза на 5% кровяном агаре, проявляющие лецитиназную активность в присутствии активированного угля и желточной эмульсии.
Принадлежность 26 изолятов к виду L. monocytogenes подтверждена молекулярно-биологическим методом в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифическими праймерами в 98-100%, в 96% -бактериологическим методом, и в 68% серологическим методом (РПГА).
Таким образом, разработанные среды для селективного выделения листерий обеспечивают стабильное сохранение их основных биологических свойств, а также некоторых генетических характеристик (плазмидный профиль) изучаемых культур.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баснакьян И. А. Стресс у бактерий // Медицина. - М., 2003. - 160 с.
2. Блинкова Л.П., Горобец О.Б., Мельникова В.А. Физиологические и биохимические свойства микроорганизмов / Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: Медицина, 2004. -576 с.
3. Диденко Л.В., Ермолова С.А., Константинова Н.Д. [и др.]. Ультраструктурное иммуноцитохимическое изучение Listeria monocytogenes с различным уровнем продукции факторов патогенности // Молекул.генет., микробиол. и вирусол. - 1988. - № 4. - C.18-22.
4. Ермолаева С.А., Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes // Журнал микробиологии. - 2001. - № 3. - C. 106-110.
5. Зайцева, Е.А., Сомов Г.П. Микробиологическая характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае // Журнал микробиологии. - 2006. -№ 2. - С. 3-6.
6. Зайцева Е.А. Глазырина Т.А., Сомов Г.П. Ускоренный метод дифференциации бактерий рода Listeria, // Клиническая лабораторная диагностика. - 2009. - № 6. - С. 46-47.
7. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М.: Медицина, 1978. - C. 351-352.
8. Маракуша Б.И., Дарвиш К., Тартаковский И.С. Характеристика штаммов Listeria monocytogenes, с помощью пульс-электрофореза // Журнал микробиологии. - 1996. - № 3. - C. 60-64.
9. Мельникова В. А., Скаженик В.Ю. Основы приготовления питательных сред. / Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / под. ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: Медицина, 2004. - 576 с.
10. Омарова С.М., Ахмедова Э.М., Муртазалиева П.М. Питательные среды для изучения биологических свойств листерий // Журнал микробиологии. - 2007. - № 3. - С. 95-97.
11. Онищенко Г.Г. Контроль за инфекционными заболеваниями - стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке // Журнал эпидемиологии и инфекционных болезней. - 2002. -№ 6. - С. 4-16.
12. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Актуальные направления совершенствования профилактики инфекционных болезней // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2000. - № 1. - С. 4-8.
13. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: Роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика - М.: «Медицина для всех», 2002. - 198 с.
14. Черкасский Б.Л. Пищевые зоонозы людей в России // Международный симпозиум «Пищевые зоонозы». - М., 1995. - С. 37-41.
15. Bhunia A.K. Antibodies to Listeria monocytogenes // Crit. Rev. Microbiol. - 2008. - Vol. 23. - P. 77107.
16. Kaufmann S.H.E. immunity to intracellular bacteria // Annu. Rev. Immunol. - 1993. - Vol. 11. -P. 129-163.
Омарова Салидат Магомедовна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией «Листериоза» НПО «Питательные среды» филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ., Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Леваневского, 24, тел/факс: 8(8722) 67-05-75, е-mail: [email protected]
Исаева Роза Изитдиновна, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Ленина, 1, тел/факс: 8(928) 536-25-11.
