CC BY
72
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, № 4
УДК 579.62:579.869.1.083.18
ПОДХОДЫ К КЛАССИФИКАЦИИ ИЗОЛЯТОВ Listeria monocytogenes ПО ВИРУЛЕНТНОСТИ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫ1Х ЖИВОТНЫ1Х
И.Ю. ЕГОРОВА
Патогенность листериозных культур принято определять качественно при постановке кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках. Этим методом штаммы можно разделить на две основные группы — патогенные и непатогенные, что, в свою очередь, не позволяет проводить внутривидовое типирование патогена, необходимое для установления источника инфекции и путей ее распространения, а также оценку эпидемической значимости изолятов, выделяемых из объектов внешней среды и пищевой продукции. Целью представляемой работы было изучение патогенности различных культур Listeria monocytogenes и разработка подходов к созданию системы классификации изолятов листерий по вирулентности для аутбредных белых мышей. Обнаружено, что сезоны года, состав и вид питательных сред не оказывают существенного влияния на показатели вирулентности для использованных лабораторных животных. При этом установлено, что наиболее объективным показателем для проведения внутривидового типирования изо-лятов L. monocytogenes служит LD50. На основе анализа результатов определения LD50 для белых аутбредных мышей у 30 культур L. monocytogenes разработана классификация изолятов лис-терий по их вирулентности. С использованием предложенной классификации показана неоднородность вида L. monocytogenes по проявлению вирулентных свойств в отношении белых аутбредных мышей. Разработанные подходы к оценке вирулентности культур L. monocytogenes позволили провести дифференциацию изолятов листерий по патогенности.
Ключевые слова: Listeria monocytogenes, белые мыши, вирулентность, LD50.
Keywords: Listeria monocytogenes, white mice, virulence, LD50.
Как известно, при возникновении любого заболевания большую роль играет вирулентность возбудителя, которую следует рассматривать как фенотипический признак, проявляющийся в способности инфекционного агента вызывать поражение клеток человека или животного. Она служит индивидуальным показателем, отражающим степень проявления патогенности как качественной характеристики микроорганизма и может изменяться под влиянием как экологических факторов, так и естественного состояния внутренней среды в организме хозяина. Вирулентные свойства бактериального штамма зависят от выработки определенных токсических веществ, на что, в свою очередь, влияет способ заражения патогеном, условия его жизнедеятельности при проникновении в макроорганизм или при культивировании в специфических питательных средах, а также от физиологического и иммунологического статуса хозяина, подвергшегося заражению (1).
Классически патогенность листериозных культур принято определять качественным методом — постановкой кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках (2). Это дает возможность разделить культуры на две основные группы (патогенные и непатогенные), но не позволяет провести внутривидовое типирование, необходимое для установления источника инфекции и путей ее распространения, а также оценку эпидемической значимости изолятов, выделяемых из объектов внешней среды и пищевой продукции.
Для этих целей в большинстве случаев используют величину LD100 и LD50 для лабораторных животных. Сравнением этих показателей для различных штаммов устанавливают степень их сходства, эпидемическую и эпизоотическую опасность. Наиболее эффективны такие подходы при внутривидовом типировании возбудителей особо опасных болезней животных и
человека. Например, для классификации и проведения внутривидового типирования возбудителя сибирской язвы по показателям вирулентности для лабораторных животных предложены три схемы — И.Н. Преснова, Г.И. Романова, Э.Н. Шляхова и Е.В. Груз (3-5). К сожалению, подобные схемы классификации при изучении биологии изолятов L. monocytogenes в настоящее время отсутствуют. В отечественной литературе имеются лишь отрывочные сведения об определении показателей вирулентности рефе-ренс-культур и некоторых полевых изолятов листерий (2, 6-9). При этом все авторы отмечают неоднородность проявления вирулентных свойств лис-терий для лабораторных животных.
Целью представляемой работы было изучение патогенности различных культур Listeria monocytogenes и разработка подходов к созданию системы классификации изолятов листерий по их вирулентности для лабораторных животных.
Материалы. Использовали 30 штаммов и изолятов L. monocytogenes, выделенных из разнообразных источников и на различных географических территориях в разное время.
Патогенность культур определяли постановкой кератоконъюнкти-вальной пробы на морских свинках. Для этого на конъюнктиву глаза животного наносили 1-2 капли бактериальной суспензии (109 м.т./см3), которую готовили с использованием оптического стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва). За морскими свинками наблюдали в течение 10 сут. Патогенными признавали культуры, которые вызывали формирование гнойного кератоконъюнктивита в течение 2-5 сут после инокуляции возбудителя.
Вирулентность оценивали вычислением показателей LD100 и LD50 в биопробах на аутбредных белых мышах. Для заражения использовали бактериальную агаровую культуру в экспоненциальной фазе роста, из которой готовили 5-кратные серийные разведения на физиологическом растворе. Мышей объединяли в 5 групп (по 6 гол.) по принципу аналогов. Животным каждой группы вводили внутрибрюшинно препараты возбудителя (0,50±0,05 см3, титры 1*109, 2*108, 4*107, 8*106 и 1,6*106 м.т.).
Для получения достоверной информации о показателях вирулентности определяли содержание жизнеспособных клеток в первой заражающей дозе высевом серийных разведений на агаризованные питательные среды с вычислением по формуле:
С X n + X n+1 1 IQ n
~ 1,1 ' V ' ’
где С — число жизнеспособных клеток в 1 см3 бактериальной суспензии; Xn — среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при высеве из разведения 10-n; Xn + 1 — среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при высеве из разведения 10-(n + !); 1,1 — постоянный коэффициент; V — объем высеянной бактериальной суспензии; 10n — разведение бактериальной суспензии, используемое при определении числа жизнеспособных клеток.
За показатель LD100 принимали минимальную из испытанных доз, вызывающую гибель 100 % взятых в опыт животных. Величину LD50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (10).
Результаты. Перед разработкой подходов к классификации листерий по вирулентности для лабораторных животных оценивали патогенные свойства штаммов/изолятов листерий общепринятым способом —
пробой Антона. Из 30 изучаемых штаммов/изолятов 29 вызывали формирование гнойного кератоконъюнктивита у морских свинок на 2-4-е сут после инокуляции патогена. При этом два штамма вызывали гибель морских свинок на 8-10-е сут после постановки кератоконъюнктивальной пробы. Подобный феномен также наблюдали Р.В. Гребенюк с соавт. (6), изучавшие патогенность изолятов листерий, выделенных от диких животных и членистоногих.
Согласно данным литературы, наиболее доступной и удобной моделью для определения вирулентности листерий считается белая мышь. Установлено, что белые мыши с живой массой менее 18 г при заражении летальными дозами интрацеребрально и внутрибрюшинно погибают в 100 % случаев, при внутривенном и подкожном заражении — в 75 % случаев (2). Мы для оценки степени патогенности листерий использовали аутбредных белых мышей с живой массой 14-16 г. Показатели вирулентности определяли на животных обоих полов.
Известно, что вирулентность одного и того же штамма микроорганизма может варьировать в зависимости от условий получения культуры, метода заражения, массы тела животного, сезона года и других факторов (11). Поэтому на первом этапе мы изучили влияния состава питательных сред и сезонов года на показатели LDjqq и LD50 для белых аутбредных мышей. Опыты проводили с использованием референс-штамма L. monocytogenes № 766 (I серогруппа). Бактериальную массу листерий получали с использованием твердых (триптон-соевый и дрожжевой триптон-соевый агары) и жидких (сердечно-мозговой бульон) питательных сред. Определение показателей LD100 и LD50 проводили в зимний и весенне-летний периоды (табл. 1).
1. Показатели LDjqq и LD50 референс-штамма Listeria monocytogenes № 766 (I серогруппа) для аутбредных белых мышей в зависимости от состава питательных сред и сезона года
Питательная среда Производитель Сезон года Вирулентность для белых мышей, м.т./гол.
LD100 1 LD50
СМБ «Difco» (США) Зима 4,00* 108 3,58*107
СМБ «Merk» (Германия) Зима > 3,75*108 1,97*107
СМБ «Merk» (Германия) Весна > 5,65*108 2,97*107
ТСА «HiMedia» (Индия) Зима > 5,75*108 3,03 *107
ДТСА «HiMedia» (Индия) Весна 3,24* 108 4,97*107
Примечание. СМБ — сердечно-мозговой бульон, ТСА — триптон-соевый агар, ДТСА — дрожжевой
триптон-соевый агар; м.т./гол. — микробных тел в расчете на 1 голову.
Полученные данные свидетельствуют о том, что состав питательной среды и сезон года не оказывали существенного влияния на вирулентность листерий для аутбредных белых мышей с живой массой 14-16 г — значения ЬБюо и ЬБзо соответствовали одному числовому порядку. Однако необходимо отметить, что в некоторых случаях, определяя показатель ЬБюо (как и в дальнейшем, когда устанавливали вирулентность полевых изолятов листерий), наблюдали выживание 1-2 особей в группах животных, зараженных максимальными дозами возбудителя, при гибели 100 % мышей, инфицированных меньшими дозами. Это согласуется с результатами экспериментов И.А. Бакулова с соавт. (2), показавшими, что иногда часть зараженных летальными дозами лабораторных животных выживает. По мнению авторов, это связано с индивидуальной устойчивостью, а также половой принадлежностью особей. Так, 93 % самцов морских свинок оказались устойчивыми к заражению возбудителем листериоза.
Анализ имеющихся в специальной литературе публикаций подтверждает, что в настоящее время чаще всего применяется значение ЬБзо,
тогда как ЬБдоо практически не используется. Для определения величины ЬБзо требуется меньшее число животных, а учитываемые показатели, подвергнутые статистической обработке, более точны (12). В настоящем исследовании при создании схемы классификации изолятов листерий по вирулентности для аутбредных белых мышей в дальнейшем использовали только показатель ЬБзо, позволяющий оперировать объективными данными. Для получения достоверной информации определяли верхние и нижние границы доверительного интервала, в котором с вероятностью 95 % находится действительная величина ЬБ5о. Значения ЬБ5о/тах и ЬБ5о/тт для некоторых полевых изолятов представлены в таблице 2.
2. Показатели LD50 у некоторых штаммов/изолятов Listeria monocytogenes для аутбредных белыгх мышей
Условное обозначение Источник и год выделения Показатель LD50, м.т./гол.
штамма/изолята LD^n/max LD50/min
«А» Пастбищный клещ, 1952 Не титруется3 Не титруется
61-06 Фекалии кабана, 2оо6 3,59х106 5,20* 105
69-06 Лещ, 2ооб 2,32* 107 4,63* 106
71-06 Густера, 2оо6 2,82х107 5,51* 106
76-06 Головной мозг овцы, 2оо6 1,82* 107 3,64* 106
134-08 Грунт подкормочных площадок, 2оо8 2,52*107 4,30* 106
139-08 Фекалии кабана, 2оо8 2,18*107 4,35* 106
243-09 Фекалии пятнистого оленя, 2оо9 2,67*106 5,34* 105
311-07 Окунь, 2оо7 6,14*106 1,23* 106
431-09 Фекалии пятнистого оленя, 2оо9 2,16* 107 2,67* 106
434-09 Фекалии кабана, 2оо9 1,23 *106 1,78* 105
488-09 Фекалии пятнистого оленя, 2оо9 5,00* 107 8,52* 106
633-09 Фекалии кабана, 2оо6 3,00* 107 4,35* 106
699-09 Фекалии пятнистого оленя, 2оо9 9,48*106 1,37* 106
39-12 Кровь сердца аборт-плода КРС, 2о 12 1,16*107 1,69* 106
Референс-шгамм № 634 (II серогруппа) Головной мозг овцы, 1978 1,35 *108 2,69* 107
Референс-шгамм № 766 (I серогруппа) Труп свиньи, 1955 6,64* 107 1,33*107
12б Человек 2,30* 106 2,00* 106
138б Человек 3,20* 106 2,95 *105
Костюченкоб Человек 2,30* 105 2,00* 105
Нелюбоваб Человек 5,60* 106 5,35* 106
Примечание. КРС — крупный рогатый скот, а — показатель ЬБюо выше 1о9 м.т./гол.; б — изоляты,
полученные от больных людей, показатели ЬБ5о определены Б.И. Маракушей, К. Дарвишем и И.С. Тарта-ковским (1996; НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва).
Установлено, что изучаемые культуры отличались друг от друга по показателю LD50, хотя для большинства из них LD5Q/min и LD50/max находились в пределах 106-107 м.т./гол. На основе анализа результатов определения LD50 у 30 культур L. monocytogenes была предложена схема дифференциации изолятов листерий по их вирулентности для белых аутбредных мышей.
Как оказалось, в зависимости от величины LD50/min и LD50/max изоляты разделяются на пять групп, которые условно можно обозначить как высоковирулентные штаммы (LD50/min и LD50/max в пределах 104106 м.т./гол.), вирулентные (LD50/min и LD50/max — 106-107 м.т./гол.), умеренно вирулентные (LD50/min и LD50/max — 107-108 м.т./гол.), слабовирулентные (LD50/min и LD50/max — 108-109 м.т./гол.) и авирулентные, у которых LD50 не титруется (LD100 выше 109 м.т./гол.).
На основании разработанной нами схемы классификации изолятов L. monocytogenes по показателю LD50 для белых мышей были оценены вирулентные свойства у 30 полевых изолятов L. monocytogenes, выделенных из различных источников. Установлено, что изоляты, полученные от восприимчивых особей и диких животных-листерионосителей, относились, как правило, к группе высоковирулентных и вирулентных. В частности, изолят № 39-12, который вызвал в 2012 году в Нижегородской области вспышку листериоза среди поголовья крупного рогатого скота, сопровож-
давшуюся абортами, вошел в группу вирулентных. Примеры дифференциации некоторых культур листерий представлены в таблице 3.
3. Дифференциация некоторых культур Listeria monocytogenes по степени патогенности в соответствии с предлагаемой классификацией
Условное обозначение штамма/изолята | LD50/min и LD50/max, КОЕ/гол. | Оценка вирулентности
№ 61-06 105-106 Высоковирулентный
№ 69-06 106-107 Вирулентный
№ 39-12 106-107 Вирулентный
Референс-штамм № 634 (II серогруппа) 107-108 Умеренно вирулентный
«А» Не титруется Авирулентный
Принадлежность некоторых штаммов L. monocytogenes, обнаруженных у представителей дикой фауны, к группам высоковирулентных и вирулентных культур, к которым относятся и клинически значимые изоляты листерий, выделенные от людей с различной патологией, позволяет оценить их как эпизоотически и эпидемически значимые. При наличии определенных факторов (иммунодефицитные состояния животных и человека, суровые и голодные зимы, стресс, беременность и т.п.) изоляты из этих групп могут вызвать вспышки листериозной инфекции не только среди животных, но также у человека.
Таким образом, разработанные нами подходы к оценке вирулентности культур Listeria monocytogenes позволяют проводить их дифференциацию по патогенности и могут быть использованы для характеристики эпизоотической и эпидемической значимости изолятов, выделяемых от животных-листерионосителей и из объектов внешней среды. Это, в свою очередь, позволит своевременно корректировать проводимые противоэпи-зоотические мероприятия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Фрейдлин И.С. и др. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 1994.
2. Бакулов И.А., Васильев Д.А., Колбасов Д.В., Кольпикова Т.И., Селянин о в Ю.О., Егорова И.Ю. Листерии и листериоз. Ульяновск, 2008.
3. Преснов И.Н. Изменчивость Bacillus anthracis в природных условиях. Ветеринария, 1966, 7: 25-29.
4. Романов Г.И. Изучение вирулентных свойств сибиреязвенных штаммов. Мат. IX пленарного заседания межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой «Вопросы эффективности противосибиреязвенных мероприятий». М., 1974: 124-125.
5. Ш ляхов Э.Н., Груз Е.В. Титрация LD50 как метод определения вирулентности сибиреязвенных бацилл. Мат. X пленарного заседания межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой «Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР». М., 1978: 97-99.
6. Гребенюк Р.В., Чиров П.А., Кадышева А.М. Роль диких животных и кровососущих членистоногих в эпизоотологии листериоза. Фрунзе, 1972.
7. Маракуша Б.И., Дарвиш К., Тартаковский И.С. Характеристика штаммов Listeria monocytogenes, выделенных в России, и их типирование с помощью пульс-электрофореза. ЖМЭИ, 1996, 3: 60-64.
8. Е ф и м о ч к и н а Н.Р. Эмерджентные бактериальные патогены в пищевой микробиологии. М., 2008.
9. Зайцева Е.А. Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes. Докт. дис. М., 2010.
10. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.
11. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В., Старицин Н.А., Померанцев А.П., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. Микробиологическая диагностика сибирской язвы. М., 1999.
12. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литу сов Н.В., Харечко А.Т., Ва-
сильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М., 1999.
APPROACH TO CLASSIFICATION OF Listeria monocytogenes ISOLATES ON THEIR VIRULENCE FOR THE EXPERIMENTAL ANIMALS
I.Yu. Egorova
A pathogenicity of Listeria isolates is usually determined in the qualitative kerato-conjunctival test on guinea pigs. That test allows to subdivided the strains into two main groups, i.e. pathogenic and non-pathogenic, but not to carry out an intraspecific typing of the pathogen, which is necessary for establishing the source of infection and the ways of its expansion, and also for the evaluation of epidemiological significance of isolates from the environment and food products. In our study, the pathogenicity of different Listeria monocytogenes cultures was investigated in test with outbred white mice, and the approach to Listeria classification is proposed on the base of the virulence manifested after an intraperitoneal injection of different bacterial culture. It is shown that the seasons, as well as the composition and type of media, used for bacteria cultivation, did not affect significantly the virulence of the isolates for laboratory animals. The LD100 and LD50 were estimated, and LD50 was found to be the most reliable index for intraspecific typing of L. monocytogenes isolates. The LD50 for white outbred mice was estimated in 30 cultures of L. monocytogenes. According to the LD50/min and LD50/max, all isolates were divided into five groups, which can be designated as a highly virulent strains (LD50/min and LD50/max within 104 to 106 colony-forming unit per animal), virulent strains (LD50/min and LD50/max of 106 to 107 CFU per animal), the strains of moderate virulence (LD50/min and LD50/max of 107-108 CFU per animal) and low virulence (LD50/min and LD50/max within 108-109 CFU per animal), and the avirulent ones, which LD50 has not been titrated (LD100 more then 109 CFU per animal).
Всероссийский НИИ животноводства предлагает следующие издания:
Фомичев Ю.П., Хрипякова Е.Н., Гуденко Н.Д. Методический практикум по контролю качества молока и молочных продуктов. М., 2013, 236 с.
Амерханов Х.А., П е р в о в Н.Г., Гуденко Н.Д. Краткий справочник по мясному скотоводству. М., 2013, 100 с.
Сельцов В.И., Сермягин А.А., Сивкин Н.В. Совершенствование племенной работы и генеалогической структуры симментальской породы отечественной и импортной селекции. М.,
2013, 72 с.
Сельцов В.И., М о л ч а н о в а Н.В., К а л и е в с к а я Г.Ф. и др. Руководство по селекци-
онно-племенной работе в молочных стадах. М., 2013, 96 с.
Эрнст Л.К. Фенотипические особенности трансгенных свиней разных поколений при интеграции гена соматолиберина человека. М., 2012, 108 с.
Шихов И.Я. ДНК-РНК в формировании признаков продуктивности у сельскохозяйственных животных. М., 2012, 180 с.
Ерохин А.И., Карасев Е.А., Ерохин С.А. Интенсификация воспроизводства овец. М.,
2012, 256 с.
Амерханов Х.А., Абилов А.И., Ескин Г.В., Виноградов В.Н. и др. Альбом по искусственному осеменению крупного рогатого скота. М., 2011, 172 с.
Костромицкий В.Н., Стрекозов Н.И., Чомаев А.М. и др. Технология управления
молочным комплексом. М., 2011, 176 с.
Кононов В.П., Черных В.Я. Биотехника репродукции в молочном скотоводстве. М.,
2009, 365 с.
Эрнст Л.К., С а м о х и н В.Т., Виноградов В.Н. и др. Проблемы долголетнего использования высокопродуктивных коров. М., 2008, 206 с.
Тозлиян К.М., Григорьев Ю.Н., О с ад чая О.Ю. Селекционная и технологическая модернизация стад коров интенсивного молочного типа. М., 2008, 212 с.
Издания высылаются по почте.
Контакты и информация: 142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы, ВИЖ, Отдел научно-информационного обеспечения, анализа и международного сотрудничества, факс 8 (4967) 65-15-97; http://vij.ru/nashi-izdaniya/elektronnie-versii.html, [email protected]
ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Росселъхозакадемии,
601120 Владимирская обл., Петушинский р-н, г. Покров, e-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 5 марта 2013 года
Summary
