CC BY
55
№ 1-2,1995
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 1-2, 1995
43
имея син-ков. Наря-белковых шидами и роды. Эти ;нораство-щержания :м количе-
I тепловой з низкомо-пинов, что ИЯМИ бел-,1 идут при ния темпе-зоживания
жов сопро-:уммарного иеолитиче-тракта ш
Таблица 2
ри действии ин+трипсин
56,38
68,68
72,10
66,42
62,47
43,92
IX, исследуе-■ки, включая гвуют усиле-1, так и сум-[аиболее ин-■рипсин: ата-^шенных при го время как 18,55%.
I в полевых и протеолиза ферментами 1зной уборке, и белков как а для семян, ях при 45°С. их обезвожи-естественных !ЫХ скоростей рыхления” и I, доступ про-ним гидроли-:лковых моле-1 повышение
температуры сушки семян сопровождается, по-ви-димому, также агрегацией белковых молекул, о которой можно судить по накоплению щелочерастворимых белков и увеличению азота плотного остатка, хотя атакуемость ферментами таких агрегатов снижается. Но такие белки будут более ’’рыхлыми”, чем те, которые формируются в условиях медленного удаления влаги при дозревании семян на материнском растении. Поэтому атакуемость комплексом ферментов пепсин + трипсин белков из дозревавших на материнском растении семян на 6,09% меньше, чем у высушенных при 90°С (при протеолизе трипсином). Величина ата-куемости белков пепсином изменяется в сравнительно узких пределах.
Изменения, происходящие в структуре белков, подтверждаются также исследованием вискози-метрических свойств белковых растворов (табл. 3).
Таблица 3
Одно- Однофазная
фаз- Дозре- Двух- уборка + сушка при
Условия пос- ная вание фаз- t, °С
леуборочной уборка на ная
обработки (конт- рас- уборка
роль) тении 45 60 90
Вязкость t),
мПа-с 1,18 1,65 2,03 2,13 1,81 1.69
Из таблицы видно, что вязкость растворов глобулина из семян двухфазной уборки превышает этот показатель при дозревании в полевых условиях на материнском растении, но уступает семенам, высушенным при 45°С. Такое изменение вязкости подтверждает, что молекулы белков семян, высушенных в лабораторных условиях, более ’’рыхлые”, чем дозревавших на растении, и тем более, убранных однофазным способом. Максимальному
’’разрыхлению” белковых тел способствует тепловая сушка свежеубранных семян при 45°С.
ВЫВОДЫ
1. Послеуборочная обработка свежеубранных подсолнечных семян способствует ’’разрыхлению” белковых глобул, о чем свидетельствуют изменения вязкости и атакуемости их протеолитически-ми ферментами желудочно-кишечного тракта.
2. Сравнительное исследование условий послеуборочной обработки семян высокомасличного подсолнечника олеинового типа Первенец показало, что наиболее благоприятными по атакуемости ферментами пепсином и трипсином белкового комплекса являются мягкие условия сушки при 45°С. Изменение массовой доли основного запасного белка семян подсолнечника — глобулина — наблюдается в небольших пределах, а степень протеолиза ферментами желудочно-кишечного тракта значительно возрастает.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лобанов В.Г. Исследование локализации и состава липидов-в тканях подсолнечных семян при созревании, послеуборочной обработке и хранении в связи с условиями их технологической переработки: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Краснодар, 1975. — 29 с.
2. Щербаков В.Г. Биохимия и товароведение масличного сырья. 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Агропромиздат, 1991.
— 304 с.
3. Шмыгля Е.В. Совершенствование технологии переработки семян высокоолеиновых гибридов подсолнечника: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. — С.-Пб., 1992. — 20 с.
4. Ермаков А.И. Методы биохимических исследований растений. — Л.: Колос, 1972. — 456 с.
5. Покровский А.А., Ертанов И.Д. Атакуемость белков пищевых продуктов протеолитическими ферментами in vitro / / Вопросы питания. — 1965. — № 3. — С. 33.
6. Руководство по методам исследования, технохимическому контролю и учету производства в масло-жировой промышленности /Под ред. В.П. Ржехина, А.Г. Сергеева. Т. 1, кн. 2. — Л.: Наука, 1967. — 1053 с.
Кафедра биохимии и технической микробиологии
Поступила 20.08.9-1
637.523.36:66.098
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ. ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА
Э.Г. РОЗАНЦЕВ, О.Н. БЕЛЯЦКАЯ,
Л.И. БУЛАТНИКОВА, Л.В. БЫКОВА,
Е.И. СИМБИРЕВА, Э.А. КОЗЛОВА
Московская государственная академия прикладной биотехнологии
Преимущества использования в пищевой биотехнологии иммобилизованных ферментов, получаемых путем их закрепления на полимерных матрицах, известны и очевидны [1]. В процессе иммобилизации нередко повышается стабильность фермента по отношению к термическому и другим деструктивным воздействиям пищевых сред, открываются возможности изменения его специфичности, регулирования скорости реакции и повышения выхода готового продукта.
Для иммобилизации нативных белков в качестве носителей применяют синтетические и природные высокомолекулярные соединения ВМС. Одним из
широко используемых полимеров является поливиниловый спирт ПВС, что обусловлено комплексом специфических свойств: наличием большого числа гидроксильных групп, гидрофильностью, жиростойкостью, высокими прочностными характеристиками пленок на его основе и др. Для прочного связывания белка с полимером обычно применяют токсичные химические реагенты, присутствие которых нежелательно в полимерных материалах, контактирующих с пищевыми продуктами. По этой причине для иммобилизации ферментов на ПВС был использован разработанный нами [2, 3] способ криомодификации полимера, позволяющий осуществлять взаимодействие ПВС с требуемыми соединениями без дополнительных кросссшивающих реагентов. Суть данного способа — в периодическом воздействии низких температур (ниже температуры фазового перехода растворителя) на растворы полимера. Благодаря этому в
I
системе развиваются криолитические процессы, приводящие к образованию активных парамагнитных центров — свободных радикалов и ион-ради-калов с сильнолокализованными неспаренными электронами, которые способны взаимодействовать с макромолекулами белка, вводимыми в раствор, и, в общем случае, приводить к образованию ковалентных связей между ПВС — матрицей и молекулами иммобилизуемых веществ.
Объектами исследования служил: ПВС 16/1 (ГОСТ 10779-78); протеолитические ферменты животного происхождения — пепсин говяжий пищевой ”НТ” (ТУ 491161-85); продукт микробного синтеза — протосубтилин ГХ-10, (ТУ 59-12-129-344-2-73).
Ферменты вносили в 12%-ные водные растворы ПВС в количестве 0,5-5,0 мас.% от массы полимера при различных значениях pH, формировали пленки поливом на стекло и подвергали замораживанию при оптимальных режимах, разработанных ранее [2, 4]. Степень иммобилизации фермента на полимерной матрице оценивали путем определения разницы величины активности фермента в водном экстракте из пленки до и после проведения данного процесса. Протеолитическую активность фермента находили стандартным методом Кунитца !5], который основан на спектрофотометрическом определении количества аминокислоты тирозина, образующейся в результате ферментативного гидролиза казеина.
Показано, что пленки ПВС после криообработки не растворяются в воде, а лишь ограниченно набухают, в то время как пленки, полученные при комнатной температуре, легко переходят в раствор. Содержание гель-фракции в полимере составляет —70%.
Незначительная миграция фермента из пленки в воду свидетельствует о связывании белка с полимерной матрицей, причем степень иммобилизации — 80-85%. Для определения влияния иммобилизации на активность фермента исследовали гидролиз казеина (рис. 1) в присутствии интакт-ного и иммобилизованного на пленке фермента.
Рис. 1.
Из анализа кинетических кривых »/ — свободный, 2*— иммобилизованный пепсин) следует, что на начальных стадиях процесса скорость гидролиза в присутствии иммобилизованного фермента несколько ниже, затем скорости реакции выравниваются, т.е. иммобилизация практически не влияет на активность фермента. Кроме того, в процессе иммобилизации повышается термоустойчивость фермента и расширяется диапазон pH среды и температур (рис. 2), в котором фермент проявляет высокую гидролитическую активность, что является следствием изменений конфигурации ковалентно связанного белка и характера внутримолекулярных конформационных переходов.
Рис. 2
Внедрение фермента в ПВС приводит к некоторому изменению молекулярной и надмолекулярной структуры полимера. Как показывают электронно-микроскопические данные, фибриллярная структура, характерная для исходного ПВС, претерпевает изменения: при введении в полимерную систему фермента наблюдается уменьшение надмолекулярных образований и некоторое их разупо-рядочение.
Анализ ИК-спектров полученных нами пленок подтверждает изменения в их структуре, вызванные влиянием связанного фермента, о чем свидетельствует небольшое уменьшение интенсивности полосы 1144 см1, ответственной за кристаллич-
ность ПВС (табл. 1). Таблица І
1144 см-1
Состав пленки 11 "
850 см 1
ПВС контроль 1,5
ПВС + 0,5% пепсина 1.2
ПВС + 5% пепсина 1,0
Влияние белка на упорядоченность вторичной структуры ПВС определяли измерением индекса синдиотактичности путем нахождения процентного содержания синдиотактических диад по соотно-
шению глощеня наблюдаї таксичнс при низк ка мало і Сопостав цировані см и г ///Г-Фурь выводу -і ПВС в рй калов, ге;
Иммо^ цей отш ченных п| материал оценки I ских про ставлялос ролиза ря сыворота* крови, К' существе! пример, і хорошо р творах, а напротив,! дах. Опы^ иммобили фер (pH 2 белковый при 37°С
Белок
Фибрин
Фибрин
Альбумин
Альбумин
Казеин
Казеин
Коллаген
Коллаген
Эластин
Эластин
Анализ ков в прис ного пепси динительнс пепсином н
151-2,1995
- свобод-гдует, что идролиза «ента не-[равнива-ie влияет процессе шчивость среды и [роявляет 'О являет-ковален-(ИМОЛеку-
к
%
ot;C
■ к некото-олекуляр-ют элект-шллярная ЛВС, пре-лимерную дение над-их разупо-
ми пленок е, вызван-чем свиде-нсивности ристаллич-
Таблица 1
)
2
вторичной 5м индекса процентно-I по соотно-
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 1-2, 1995
шению интегральных интенсивностей полос поглощения при частотах 916 и 850 см1. При этом наблюдается небольшое (10%) изменение синдио-таксичности для пленок ЛВС, сформированных при низких температурах, причем связывание белка мало влияет на величину измеряемого индекса. Сопоставление Я/С-спектров пленок ЛВС, модифицированных ферментом, в диапазонах 2920 и 1420 см' и 1669—1670 см1, исследованных методами ИК-Фурье спектроскопии и МНПВО, приводит к выводу о ковалентном связывании фермента с ЛВС в результате рекомбинации свободных радикалов, генерируемых в ходе криолиза.
Иммобилизация ферментов полимерной матрицей открывает возможности использования полученных пленок в качестве биологически активных материалов БАМ в пищевой биотехнологии. Для оценки влияния БАМ на протекание биохимических процессов в биологических объектах представлялось интересным исследовать кинетику гидролиза ряда белков животного происхождения — сывороточного альбумина крови, фибрина плазмы крови, казеина, коллагена и эластина, которые существенно отличаются по своим свойствам: например, глобулярные белки альбумин и казеин хорошо растворяются в воде и подкисленных растворах, а фибриллярные белки фибрин и коллаген, напротив, плохо растворимы в аналогичных средах. Опыты проводили путем внесения пленок с иммобилизованным пепсином в глициновый буфер (pH 2,2), в котором предварительно находился белковый субстрат, а инкубацию осуществляли при 37°С.
Таблица 2
Белок Состояние фермента Концентрация тирозина, мкг/мл
время гидролиза, ч
1 2 3 4
Фибрин Иммобилизованный 16,5 37,0 42,5 46,5
Фибрин Свободный 32,0 65,0 68,0 69,0
Альбумин Иммобилизованный 26,0 58,0 60,0 63.0
Альбумин Свободный 4,0 13,5 27,5 42,0
Казеин Иммобилизованный 9,5 22,0 34,0 46,5
Казеин Свободный 17,0 30,0 40,2 52,7
Коллаген Иммобилизованный 0 0 0 0
Коллаген Свободный 0 0 0 0
Эластин Иммобилизованный 0 1,0 4 2,0 2,5
Эластин Свободный 0 2,0 3,0 5,6
Анализ результатов гидролиза различных бел-
ков в присутствии свободного и иммобилизованного пепсина (табл. 2) показывает, что белок соединительной ткани — коллаген не гидролизуется пепсином ни в свободной, ни в иммобилизованной
45
формах, на растворимую фракцию эластина воздействие пепсина также выражено незначительно. Однако эти результаты нельзя считать однозначными, т.е, они могут быть вызваны несовершенством выбранного метода определения тирозина, поскольку содержание последнего в соединительнотканных белках весьма незначительно и составляет от 0,2 до 0,02%.
Полученные результаты опытов можно объяснить также необычным составом этих белков: треть аминокислотного состава, например, коллагена, представлена глицином, на долю пролина с окси-Пролином приходится 21%, а на долю аланина — 11%. Кроме того, в состав коллагена входит необычная аминокислота — оксилизин. Еще более специфическими особенностями обладают эластины. Остальные же белки (фибрин, альбумин и казеин) подвергаются гидролизу нормально и с достаточно высокой скоростью. Гидролиз белков под действием иммобилизованного пепсина протекает с меньшей скоростью, чем в случае свободного фермента, что, по-видимому, связано с меньшей доступностью активных центров иммобилизованных ферментов в отличие от молекул пепсина, находящихся на поверхности пленок, контактирующих с субстратом. Некоторое снижение активности иммобилизованного пепсина объясняется, вероятно, и частичной конформационной перестройкой вблизи активного центра фермента под влиянием матрицы ЛВС.
Поскольку мышечная ткань и кровь убойных животных являются ценным сырьем, используемым для получения пищевых продуктов и лечебных препаратов, мы исследовали действие иммобилизованного пепсина ка эти белковые субстраты.
Отсюда следует, что скорость и глубина гидролиза биологических тканей в присутствии иммобилизованного пепсина меньше, чем для свободного фермента, что так же, как и для очищенных белко^в, вероятно, объясняется причинами, указанными выше. Кроме того, в состав мышечной ткани и крови входит множество сопутствующих веществ, которые вызывают экранирование активного центра иммобилизованного фермента.
Свойства БАМ влиять на гидролиз белков могут быть на практике использованы для ускорения ’’созревания мяса” за счет размягчения мышечных волокон. Одним из показателей ’’созревания мяса” является степень его переваривания in vitro ферментами желудочно-кишечного тракта, в частности, пепсином и трипсином.
В связи с этим мы исследовали влияние иммобилизованного пепсина на процесс созревания мяса путем инкубации фарша в контакте с иммобилизованным пепсином в течение суток при +4°С. Степень созрев^йия мяса оценивалась по нарастанию в нем концентрации тирозина по методу Покровского [6]. Результаты опытов представлены на рис. 3.
й'яи-.(,тк
Рис. 3
Исходя из Полученных нами данных, можно сделать вывод, что скорость переваривания мяса, созревшего в пленке из ПВС с иммобилизованным пепсином (кривая <3), выше в 1,6 раза, чем в созревшем без пленки мясе (кривая 2), и в 3,1 раза выше, чем в контрольном образце (кривая /).
Значительнее ускорение переваривания мяса, упакованного при созревании в пленку с иммобилизованным пепсином, объясняется дополнительным протеолизом белков мяса иммобилизованным ферментом. Это подтверждается и накоплением тирозина по истечении 3 ч контакта. При этом степень переваривания составляла для контроль-
ного образца 17,7 мкг/мл, для мяса, созревшего без пленки, — 37,3, и в пленке — 42,5 мкг/мл.
Таким образом, упаковка фарша в пленку на основе ПВС с иммобилизовашшм пепсином может ускорить срок созревания мяса в 1,5-2 раза/Это, в свою очередь, снизит энергозатраты на холодильное хранение фарша, а в итоге — себестоимость готового продукта.
ВЫВОДЫ
Изучено влияние БАМ на основе поливинилового спирта на протекание биохимических процессов в биологических объектах белках животного происхождения, мышечной ткани и крови. Установлено ускорение протеолиза под действием иммобилизованного фермента. Показано, что БАМ может быть использован для ускорения созревания мяса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии.
— М.: Мир. — 1989. — 1. — ‘238 с.
2. Беляцкая' О.Н. и др. Регулирование структуры жесткоцепных полимеров в процессе криолиза // Высокомолек. соед. — 1982. — 25 А, — С. 517-523
3. Беляцкая О.Н. и др. Криомодификация жесткоцепных' полимеров // Высокомолек. соед. — 1983. — 25 Б. — № 8. — С. 614-617.
4. Розанцев Э.Г. Модифицирование поливинилового спирта ферментами / / Пластмассы. — 1993. — №4. — С.8-10.
5. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии. — М.: Медицина. — 1969. — 119 с.
6. Покровский А.А., Ертанов И.Н. Атакуемость белков пищевых продуктов протеолитическими ферментами / / Вопросы питания. — 1965. — Л» 3. — С. 38-40.
Кафедра биохимии, пищевой химии и технологии высокомолекулярных соединений
Поступила 05.11.91
І! £. ЧКР
г!:;1
" ■'і ВПП Ц ї ї 'Г''і1!
Хлебо] Федерац ше 5000 годно бо, ления хл ляет 10СН 30-35% по общеі потребнй лись ста ления н строител бинатов] малой №
Однак ми пред! их рукої уровне, ! гократнс того же подразде нородны ев произ получен] технолої] НИИ реж| Опера] свойств ся. Реж| ния уста ных харі параметр рабатыв^ ции, а т] ведется I ми, коте ность и нужден нию про] Призй стройки і появлен| существі сырья о водствен рует фаь способе^ стройка непосре; способов дукции оптимая
