CC BY
172
УДК 615.322:582.736.3(470.62/.67)
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА АСТРАГАЛА ЭСПАРЦЕТНОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В ПРЕДКАВКАЗЬЕ
© Н.Н. Гужва
Пятигорская государственная фармацевтическая академия, пр. Калинина, 11, Пятигорск, Ставропольский край, 357532 (Россия) E-mail: nio@helios.ru
В надземной части астрагала эспарцетного, произрастающего в Предкавказье, обнаружены флавоноиды, фенолкар-боновые кислоты, кумарины, тритерпеновые сапонины даммаранового ряда. Для их обнаружения были проведены качественные реакции с использованием специфических реактивов. Выделение индивидуальных веществ проводили с использованием колоночной хроматографии на полиамиде и силикагеле. Структуру выделенных соединений доказывали данными элементного анализа, УФ- и ИК-спектроскопией, результатами изучения продуктов кислотного, щелочного и ферментативного гидролизов, а также сравнением с достоверными образцами свидетелей.
Ключевые слова: флавоноиды, оксикоричные кислоты, кумарины, тритерпеновые сапонины, УФ-, ИК-, ПМР-спектроскопия, кислотный гидролиз, щелочное плавление, элементный анализ, бумажная хроматография, гликозид.
Введение
Лекарственные растения содержат биологически активные вещества (БАВ) с широким спектром фармакологического действия. Эти вещества участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, входят в состав ферментов, благотворно влияют на обменные процессы, происходящие в организме. Они способны усиливать неспецифические защитные реакции, т.е. играть роль биологических стимуляторов, повышающих уровень жизнедеятельности всего организма [1].
В настоящее время учеными широко проводится работа по изучению и внедрению в официнальную медицину растений, содержащих широкий спектр биологически активных веществ, а также растений, уже используемых в народной медицине. К таким перспективным растениям относятся растения рода астрагал, в частности астрагал эспарцетный, который используется в сельском хозяйстве как кормовое растение и как медонос и, следовательно, имеет достаточную сырьевую базу [2].
Цель наших исследований - фитохимическое изучение астрагала эспарцетного, произрастающего в Предкавказье, для дальнейшего его использования в официнальной медицине и ветеринарии.
Экспериментальная часть
Сырье (надземная часть) астрагала эспарцетного (Astragalus onobrychis L. относится к семейству Fabaceae, секции Onobrychium, подроду Cercidothrix Bge) было собрано в окрестностях города Пятигорска, на полях агрофирмы «Пятигорье» во время цветения (конец мая - начало июня 2006 г). Образец был определен кандидатом фармацевтических наук, ассистентом кафедры ботаники С.Ф. Джумырко. Гербарные образцы хранятся на кафедре ботаники в Пятигорской государственной фармацевтической академии.
При предварительном исследовании спиртового извлечения на содержание основных групп биологически активных веществ из 10 г надземной части астрагала эспарцетного (Astragalus onobrychium Bunge сем. Fabaceae) экстрагировали 50% этанолом, извлечение отфильтровывали и проводили качественные реакции на основные биологически активные вещества:
- на флавоноиды - цианидиновая проба, реакция с 10% спиртовым раствором гидроксида натрия, с 1% спиртовым раствором хлорида железа (III) [3];
- на коричные кислоты - реакция с реактивами Паули, Гепфнера, с 3% спиртовым раствором хлорида железа (III) [4];
- на кумарины - реакция азосочетания со свежеприготовленным раствором диазотированной сульфокислоты, свежеприготовленным раствором диазотированного п-нитроанилина, реакция со щелочью [5];
- на тритерпеновые сапонины - реакция пенообразования, реакция с концентрированной серной кислотой, концентрированной серной кислотой и уксусным ангидридом [6].
Было установлено наличие фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, кумаринов, тритерпеновых сапонинов.
Для получения биологически активных веществ 2 кг измельченной в соответствии с требованиями ГФ XI надземной части астрагала, собранной в фазу цветения, экстрагировали этанолом различной концентрации: 30, 50, 80 и 90%. Кратность экстракции равна 3, время экстракции - по 60 мин, соотношение «сырье - экстрагент»
- 1 : 10. Температура экстракции - 60-65 °С. Выход составил до 95%. Затем экстрагент отгоняли, а получаемые водные извлечения объединяли, оставляли при +4 °С на двое суток. Выпавший осадок хлорофилла и других сопутствующих веществ отфильтровывали, и извлечение дополнительно очищали от липофильных веществ, используя пентан, гептан, а затем сгущали под вакуумом (разрежение 2,6-104Н/м2) [7].
Для разделения БАВ из сгущенного извлечения нами была использована избирательная экстракция «жидкость - жидкость» различными растворителями: хлороформом, этилацетатом, бутилацетатом, бутано-лом [8].
Идентификация флавоноидов и коричных кислот. Этилацетатное и бутилацетатное извлечения сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и затем отгоняли растворители. После отгона растворителей их объединяли. Сумму полифенольных соединений осаждали 3-5-кратным объемом «сухого» хлороформа, при этом выпадал осадок желтого цвета, который отфильтровывали на стеклянном фильтре №3 и высушивали при температуре 45-50 °С в вакуум-сушильном шкафу. Сумма полифенольных соединений представляет собой порошок желтого цвета, легко растворимый в метаноле, этаноле, ацетоне, не растворим в хлороформе.
Для подтверждения наличия флавоноидов и оксикоричных кислот полученный порошок (0,1 г) растворили в 50% этаноле и исследовали методом одно- и двумерной хроматографии на наличие флавоноидов и коричных кислот с использованием бумажной (БХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ) [8].
Для проведения БХ использовали бумагу ЕЫ-6, ЕЫ-П, ЕЫ-12 Ленинградская марки С и М. Система растворителей для флавоноидов: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 2) (БУВ), 15% уксусная кислота; для оксикоричных кислот - 2% уксусная кислота, БУВ. Хроматограммы высушивали и просматривали в видимом и УФ-свете. После высушивания обнаружили 12 пятен, их отмечали, а затем обрабатывали парами аммиака; 5% раствором алюминия хлорида в этаноле и 10% раствором гидроксида калия в метаноле. Окраска пятен до обработки парами концентрированного раствора аммиака перешла от желтой до темнокоричневой. После обработки интенсивность увеличилась, а при обработке 5% раствором хлорида алюминия окраска изменилась от желтой до желто-зеленой; при обработке 10% раствором гидроксида калия - от желтой до оранжевой. По результатам проведенных качественных реакций 8 соединений были отнесены к флавоноидам, которые можно отнести как к агликонам, так и к гликозидам. При проведении цианидиновой реакции до гидролиза суммы флавоноидов образуется красное (малиновое) окрашивание, которое частично переходит в октанол, что говорит о наличии как агликонов, так и гликозидов. При взаимодействии с реактивом Херхаммера положительная реакция была для веществ А5, А8, А10. Для веществ А6, А7, А9, А11, А12 она стала положительной лишь только после гидролиза. Это указывает на то, что агликоны имеют флавоноло-вую природу [8]. Данные анализа представлены в таблице 1.
При обработке пятен специфическими для коричных кислот реактивами Гепфнера, Паули, Шмитда на хроматограммах были обнаружены 4 оксикоричных кислоты. Данные представлены в таблице 2.
Для выделения и идентификации отдельных фенольных соединений применяли разделение их суммы на колонке с полиамидным сорбентом или препаративное разделение хроматографическое на бумаге в нескольких системах растворителей с последующей дробной кристаллизацией выделенных соединений. Полученную сумму полифенольных соединений (25,0 г) наносили на колонку с полиамидным сорбентом, активированным 2% раствором хлороводородной кислоты. Экстрагировали последовательно водой и этанолом с повышением концентрации последнего. Колонку просматривали в УФ-свете, наблюдали четкие зоны разделения соединений на сорбенте, собирали отдельные фракции. Процесс элюирования контролировали хроматографией на бумаге в системах БУВ (4 : 1 : 5) и 15% уксусная кислота. Одинаковые фракции объединяли, растворитель полностью отгоняли, вещества перекристаллизовывали из метанола и этанола [8].
Таблица 1. Качественные исследования флавоноидов на бумажных хроматограммах со специфическими реактивами
Вещество Окраска пятен
До обработки После обработки в УФ-свете
В видимом свете Концентри- 5% А1С13 в С2Н5ОН 10% КОН в СН3ОН Реактив Херхаммера
В УФ-свете рованный раствор КН до гидролиза после гидролиза
А5 бледно-желтая желтая желто-зеленая ярко-желтая желтая + +
А6 бледно-желтая коричневая желто-зеленая желто-зеленая оранжевая - +
А7 бледно-желтая коричневая желтая желто-зеленая оранжевая - +
А8 бледно-желтая желто-зеленая желтая желто-зеленая ярко-желтая + +
А9 бледно-желтая коричневая желтая желто-зеленая оранжевая - +
А10 бледно-желтая желто-зеленая желтая желто-зеленая ярко-желтая + +
Ап темно-желтая желтая желто-зеленая желтая желто-оранжевая - +
А12 темно-желтая желтая желто-зеленая желтая желто-оранжевая - +
Таблица 2. Качественные исследования оксикоричных кислот на бумажных хроматограммах со специфическими реактивами
Окраска пятен при действии
Вещество УФ-свет УФ-свет и Ж4ОН 0,5 н КОН в СН3ОН Реактив Гепфнера Реактив Паули 3% FeCl3 в С2Н5ОН Реактив Mиллона
А1 светло- усиление красно- красно- коричневая серо-зеленая желтая
голубая окраски коричневая коричневая
окраска
А2 голубая зеленая красная желто- желто- зеленая -
коричневая коричневая
A3 голубовато- темно- зеленовато- слабо-желтая красноватая желто- красная
фиолетовая фиолетовая желтая оранжевая
А4 слабо- сине- желтая желто- желто- оранжево- -
голубая фиолетовая коричневая коричневая зеленая
Вещества анализировали после высушивания в вакуум-эксикаторе (1,3^ 104 Н/м2) при температуре 115 °C над Р2О5 в течение 12-14 ч. УФ-спектры выделенных индивидуальных веществ сняты на спектрометрах СФ-46, СФ-56 в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве растворителя использовали метанол и 95% этанол. Температуру плавления веществ определяли на блоке Кофлера [8]. ИК-спектры соединений сняты в таблетках бромида калия на спектрофотометрах UR-20 «Specord» (с призмами NaCl и NaF в области 8003600 см-1, концентрация вещества 0,5%) [8].
Удельное вращение гликозидов флавоноидов определяли на колориметре круговом «модель CM» в кюветах с рабочей длиной 0,5 дм. nMP-спектры измеряли на спектрометре ZHP-60 с рабочей частотой 60 мгц, с использованием растворителей ,3MCO, пиридина. В качестве внутреннего стандарта применяли тетраме-тилсилан (TMC). Химические сдвиги определены в м. д. [8].
С целью установления качественного состава агликонов, которыми представлены флавоноидные глико-зиды, проводили кислотный гидролиз 1-10% H2SO4, 5% HCl, щелочное плавление с кристаллическим све-жеплавленным КОН. Для доказательства (определения количества свободных гидроксильных групп) вещества подвергали ацетилированию свежеперегнанным уксусным ангидридом в присутствии натрия ацетата и метилированию диметилсульфатом в присутствии безводного калия карбоната, и определяли температуру плавления и снимали УФ-спектры. Для доказательства гликозидной связи проводили ферментативный гидролиз с использованием ферментного препарата из гриба Aspergillus oryzae и р-глюкозидазой [8].
При сравнении хроматографической подвижности достоверных образцов свидетелей и пятен из флаво-ноидов были обнаружены: кверцетин, кверцетин-3-рутинозид (рутин), кверцетин-3-O-p-D-галактозид (гипе-розид), кемпферол, кемпферол-3-глюкозид (астрагалин), кемпферол-3-O-рутинозид, изорамнетин, изорам-нетин-3-глюкозид.
Из фенолкарбоновых кислот на хроматограммах с достоверными образцами свидетелей были обнаружены: кофейная кислота, хлорогеновая кислота, 3-п-кумароилхинная кислота, п-кумаровая кислота.
Доказательство структуры выделенных соединений проводили в соответствии с порядком выделения.
Вещество Аі - вещество желтого цвета, т. пл. 194-196 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Х^, нм) 217, 234, 299 пл, 235 нм, (СН3СОО№, Х^, нм) 310, 280; (СН3СОО№+Н3ВО3, Х^, нм) 320, 295, (А1С13, Х^, нм) 350, 290. (С2Н5О№, Х^, нм) 360, 240, 315пл. Элементный анализ: найдено (%): С - 60,04, Н - 5,45, вычислено (%): С - 59,67, Н - 5,02; Я - 0,83 (система I), 0,28 (система III). ИК-спектр (КВг, и, см-1): 3400, 3235, 2975 (ОН), 1647, 1630 (>С=О), 1607, 1540 (Аг), 880, 860 (замещенный бензол). Ацетилпроизводное имеет температуру 183-187 °С. Щелочное плавление дает протокатеховую кислоту с температурой плавления 201203 °С. Температура плавления полученного вещества соответствует температуре плавления кофейной кислоты. Также не наблюдается депрессии температуры плавления. Сравнивая полученные данные с литературными, вещество Аі идентифицировали как кофейную кислоту.
Вещество А2. С16Н18О9, т. пл. 203-206 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Х^, нм) 325, 300, 246. (СН3СОО№, Хтах, нм) 330, 248; (СН3СОО№+Н3ВО3, Хтах, нм) 350, 330, 255. (А1С13, Хтах, нм) 360, 315, 240. (С2Н5О№, Хтах, нм) 380, 260. Элементный анализ: найдено (%): С - 53,87, Н - 5,01. Вычислено (%): С - 54,52, Н - 5,08. Я - 0,63 (система I), 0,66 (система III). ИК-спектр (КВг, и, см-1) 2970, 2900, 2780 (ОН), 1740-1710 (сложноэфирная группировка), 1660, 1625(>С=О), 1605-1550 (Аг), 840 (замещенный бензол). Щелочной гидролиз приводит к образованию кофейной кислоты (т. пл. 194-196 °С) и Б-хинной кислоты (т. пл. 182-184 °С). На хроматограмме смешанная проба вещества А2 и хлорогеновой кислоты дает одно пятно, также не наблюдается депрессии температуры плавления вещества А2 и хлорогеновой кислоты. Данное вещество идентифицировано как хлорогеновая кислота.
Вещество А3. С9Н8О3, т. пл. 213-215 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Хтах, нм) 310, 299, 228. (СН3СОО№, Хтах, нм) 301, 221; (СН3СОО№+Н3ВО3, Хтах, нм) 331, 233. (А1С13, Хтах, нм) 323, 235. ^НзОШ, Хтах, нм) 321, 273. Элементный анализ: найдено (%): С - 65,01, Н - 4,22. Вычислено (%): С - 65,85, Н - 4,88. Яг
- 0,40 (система I), 0,50 (система III). ИК-спектр (КВг, и, см-1) 3150, 2950, (ОН), 1665, 1625(>С=О), 1605-1580 (Аг), 840 (замещенный бензол). Щелочное плавление приводит к образованию бензойной кислоты (т. пл. 210-212 °С). На хроматограмме смешанная проба вещества А3 и я-кумаровой кислоты дает одно пятно, также не наблюдается депрессии температуры плавления вещества А3 и я-кумаровой кислоты. Данное вещество идентифицировано как я-кумаровая кислота.
Вещество А4. С16Н8О8, т. пл. 242-243 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Хтах, нм) 312, 252.
(СН3СОО№, Хтах, нм) 315, 255; (СН3СОО№+Н3ВО3, Хтах, нм) 337, 271. (А1С13, Хтах, нм) 342, 252. ^НзОШ, Хтах, нм) 347, 269. Элементный анализ: найдено (%): С - 56,49, Н - 5,21. Вычислено (%): С - 56,80, Н - 5,32.
- 0,58 (система I), 0,69 (система III). ИК-спектр (КВг, и, см-1) 3250, 2900 (ОН), 1735-1690 (сложноэфирная группировка), 1695 (>С=О), 1605, 1595, 1565 (Аг), 860 (замещенный бензол). Щелочной гидролиз приводит к образованию я-кумаровой кислоты (т. пл. 213-215 °С) и Б-хинной кислоты (т. пл. 182-184 °С). На хроматограмме смешанная проба вещества А4 и 3-я-кумароилхинной кислоты дает одно пятно, также не наблюдается депрессии температуры плавления вещества А4 и 3-я-кумароилхинной кислоты. Данное вещество идентифицировано как 3-я-кумароилхинная кислота.
Вещество А5. С15Н10О7, т. пл. 310-312 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Хтах, нм) 372, 264, 256 нм; (СН3СОО№, Хтах, нм) 384, 374; (СН3СОО№+Н3ВО3, Хтах, нм) 390, 259. (А1С13, Хтах, нм) 458, 252; (А1С13-НС1, Хтах, нм) 430, 271 (С2Н5О№, Хтах, нм) 333, 270. Элементный анализ: найдено (%): С - 59,36, Н - 2,83. Вычислено (%): С - 59,61, Н - 3,33. Я - 0,64 (система I), 0,04 (система II). ИК-спектр (КВг, и, см-1) 3380, 3300(ОН), 1665(>С=О), 1615, 1565, 1515 (Аг), 815, 840 (я-замещение в кольце «В»). При щелочном плавлении образуются флороглюцин, протокатеховая кислота (т. пл. 201-203 °С). Ацетилирование дает вещество с т. пл. 196197 °С. Метилирование дает вещество с т. пл. 152-153 °С. Не наблюдалось депрессии температуры плавления вещества А5 и достоверного образца кверцетина. Вещество идентифицировали как 3,5,7,3'4'-пентаоксифлавон (кверцетин).
Вещество А6. С21Н30О16, т. пл. 190-192 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Хтах, нм) 256, 264пл, 355 нм; (СН3СОО№, Хтах, нм) 391, 273; (СН3СОО№+Н3ВО3, Хтах, нм) 270, 362. (А1С13, Хтах, нм) 416, 276; (А1С13-НС1, Хтах, нм) 394, 272 (С2Н5О№, Хтах, нм) 411, 274. Элементный анализ: найдено (%): С - 53,10, Н - 5,20. Вычислено (%): С - 53,11, Н - 4,92. Яг - 0.45 (система I), 0,51 (система II). ИК-спектр (КВг, и, см-1) 3595, 3400 (ОН), 1660 (>С=О), 1605, 1575, 1510 (Аг), 1085, 1062, 1025, 980, 900 (сахарный компонент), 815, 840 (я-замещение в кольце «В»). При жестком кислотном гидролизе 10% Н28О4 образуются кверцетин и рутиноза (т. пл. 187-188 °С). При кислотном гидролизе 1% Н28О4 (ступенчатый гидролиз) образуются кверцетин (т. пл. 312-313 °С), Б-глюкоза, Ь-рамноза, что было подтверждено БХ с достоверными образцами свидете-
лей. Ферментативный гидролиз дал кверцетин, D-глюкозу и L-рамнозу. Идентифицировано как рутин (кверцетин-3 -рутинозид).
Вещество А7. С21Н20О12, т. пл. 232-234 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, нм) 361, 257, 265пл нм;
(CH3COONa, Xmax, нм) 380, 275; (CH3C00Na+H3B03, Xmax, нм) 377, 263. (AlCl3, Xmax, нм) 438, 305, 276; (AlCl3-HCl, Xmax, нм) 405, 299, 276 (C2H5ONa, Xmax, нм) 409, 273. Элементный анализ: найдено (%): С - 54,30, Н - 4,50. Вычислено (%): С - 54,31, Н - 4,31. [а]20= -69,2° (с, 0,1, МеОН), Rf - 0,35 (система I), 0,57 (система II). ИК-спектр (KBr, и, см-1) 3300 (ОН), 1658 (>С=О), 1607, 1565, 1505, 1445(Ar), 1085, 1055, 1030, 925, 890 (сахарный компонент), 835, 815 (и-замещение в кольце «В»). Кислотный гидролиз вещества (1% H2SO4) дает агликон кверцетин (т. пл. 312-313 °С) и D-галактозу, которые идентифицированы вышеописанным методом. Ферментативный гидролиз дал кверцетин и D-галактозу. Сравнивая полученные данные с литературными, вещество А7 определили как кверцетин-3-О-Р-Э-галактопиранозид (гиперозид).
Вещество А8. Ci5Hi006, т. пл. 273-275 °С (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Xmax, нм) 368, 267 нм; (CH3COONa, Xmax, нм) 380, 273; (СН3СООNa+Н3ВО3, Xmax, нм) 365, 267. (AlCl3, Xmax, нм) 425, 274; (AlCl3-HCl, Xmax, нм) 425, 273; (С2Н5ОNa, Xmax, нм) 408, 276. Элементный анализ: найдено (%) С - 62,48, Н - 3,25. Вычислено (%) С - 62,58, Н - 3,48. Rf - 0,82 (система I), 0,08 (система II). ИК-спектр (KBr, и, см-1) 3340 (ОН), 1660 (>С=О), 1615, 1570, 1515 (Ar), 810, 840 (и-замещение в кольце «В»). При щелочном плавлении образуется флороглюцин и и-оксибензойная кислота (т. пл. 210-212 °С). На основании полученных данных и данных литературы вещество А8 идентифицировали как 3,5,7,4'-тетраоксифлавон (кемпферол).
Вещество А9. С21Н20Оц, т. пл. 178-180 °C (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Xmax, нм) 357, 255, 326 нм; (СН3СОО№, Xmax, нм) 380, 275; (СН3СОО№+Н3ВО3, Xmax, нм) 349, 267. (AlCl3, Xmax, нм) 397, 275; (AlCb-На, Xmax, нм) 387, 275; (С2Н5О№, Xmax, нм) 401, 275. Элементный анализ: найдено (%) С - 56,43, Н - 4,12. Вычислено (%) С - 56,25, Н - 4,46. [a]20D= -56° (с 0,1; ДМФА), Rf - 0,72 (система I), 0,43 (система II). ИК-спектр (KBr, и,см-1) 3425, 3180 (ОН), 1665 (>С=О), 1610, 1575, 1510, 1455(Ar), 1095, 1055, 1030, 902, 885 (сахарный компонент), 815, 835 (и-замещение в кольце «В»). При кислотном (1% Н28О4) и ферментативном (Aspergillus oryzae) гидролизе образуется кемпферол и D-глюкоза, что было доказано БХ с использованием достоверных образцов свидетелей. На основании полученных данных вещество А9 идентифицировали как кемп-ферол-3-глюкопиранозид (астрагалин).
Вещество Аю. С16Н12О7, т. пл. 306-307 °C (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Xmax, нм) 371, 265, 254 нм; (СН3СОО№, Xmax, нм) 380, 274; (СН3СОО№+Н3ВО3, Xmax, нм) 372, 254. (AlCl3, Xmax, нм) 430, 267; (AlCb-На, Xmax, нм) 428, 267; (С2Н5О№, Xmax, нм) 420, 270. Элементный анализ: найдено (%) С - 60,96, Н - 4,10. Вычислено (%) С - 60,76, Н - 3,80. [a]20D= -56° (с 0,1; ДМФА), Rf - 0,53 (система I), 0,47 (система II). ИК-спектр (KBr, и,см-1) 3455 (ОН), 2895 (-ОСН3), 1658 (>С=О), 1605, 1565, 1505 (Ar), 810, 835 (и-замещение в кольце «В»). На основании полученных данных вещество AJ0 идентифицировали как 3,5,7,4'-тетраокси-3'-метокси-флавон (изорамнетин)
Вещество Ап, С22Н22О12, т. пл. 170-172 °C (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Xmax, нм) 351, 253 нм;
(СН3СОО№, Xmax, нм) 367, 256; (СН3СООNa+Н3ВО3, Xmax, нм) 365, 254. (AlCl3, Xmax, нм) 405, 275 ; (AlCb-На, Xmax, нм) 401, 268 ; (С2Н5О№, Xmax, нм) 420, 276. Элементный анализ: найдено (%) С - 55,09, Н - 4,56. Вычислено (%) С - 55,23, Н - 4,60. [a]20D= -68,2° (с 0,33; СН3ОН), Rf - 0,47 (система I), 0,53 (система II). ИК-спектр (KBr, и,см-1) 3455 (ОН), 2895 (-ОСН3), 1658 (>С=О), 1605, 1565, 1505 (Ar), 1095, 1055, 1030, 902, 885 (сахарный компонент) 817, 845 (и-замещение в кольце «В»). При кислотном гидролизе 1% Н28О4 (ступенчатый гидролиз) образуется изорамнетин (т. пл. 305-307 °C) и D-глюкоза, что было подтверждено БХ с достоверными образцами свидетелей. Ферментативный гидролиз дал изорамнетин, D-глюкозу. На основании полученных данных вещество Ап идентифицировали как изорамнетин-3-глюкозид.
Вещество Ai2. С28Н32О16-2Н2О, т. пл. 180-182 °C (из СН3ОН), УФ-спектр (С2Н5ОН, Xmax, нм) 358, 256 нм; (СН3СОО№, Xmax, нм) 366 , 256; (СН3СОО№+Н3ВО3, Xmax, нм) 358, 268. (AlCl3, Xmax, нм) 400, 275; (AlCb-На, Xmax, нм) 399, 267 ; (С2Н5О№, Xmax, нм) 422, 275. Элементный анализ: найдено (%) С - 51,02, Н - 5,43. Вычислено (%) С - 50,90, Н - 5,50. Rf - 0,60 (система I), 0,57 (система II). ИК-спектр (KBr, и, см-1) 3450, 3200 (ОН), 2930 (-ОСН3), 1660 (>С=О), 1605, 1565 (Ar), 1090, 1050, 980, 890 (сахарный компонент), 812, 840 (и-замещение в кольце «В»). При кислотном гидролизе 1% Н28О4 (ступенчатый гидролиз) образуется изорамнетин (т. пл. 305-307 °C), D-глюкоза, L-рамноза, что было подтверждено БХ с достоверными образцами свидетелей. Ферментативный гидролиз дал изорамнетин, D-глюкозу и L-рамнозу. На основании полученных данных вещество AJ2 идентифицировали как изорамнетин-3-рутинозид.
Идентификация кумаринов. Для обнаружения кумаринов на пластинках хлороформную фракцию наносили на пластины «8Пи1Ы», а затем помещали в хроматографическую камеру в системы растворителей: этилацетат - бензол (1 : 2). Хроматограммы просматривали после высушивания в УФ-свете, обработав их свежеприготовленным диазореактивом, и по окраске получившихся пятен и при анализе в сравнении с достоверными образцами свидетелей кумаринов были обнаружены кумарин, умбеллиферон, скополетин, скополин, скимин.
Маточный раствор после осаждения флавоноидов «сухим» хлороформом объединили с хлороформным извлечением из надземной части данного астрагала. Хлороформ отгоняли, осадок сушили в вакуум-сушильном шкафу. 0,01 г растворяли в этаноле, и с этим раствором проводили качественные реакции. Разделение суммы кумаринов на индивидуальные вещества проводили, используя колоночную хроматографию с силикагелем. Элюирование проводили такими системами, как бензол - этилацетат (2 : 1), хлороформ -бензол (1 : 1). Полученные элюаты наносили на пластины Б11иРо1, а затем хроматографировали в системе бензол - этилацетат (2 : 1). Хроматограмму высушивали, обрабатывали диазореактивом и одинаковые элюа-ты объединяли, затем отгоняли растворители, перекристаллизовывали из метанола. Для доказательства структуры выделенных соединений использовали УФ- и ИК-спектроскопию, определяли температуру плавления, проводили кислотный гидролиз, определяли растворимость в растворителях различной природы [9].
Вещество К1 - бесцветные кристаллы С9Н6О2 (из СН30Н) т. пл. 67-68 °С (из СН30Н), УФ-спектр (С2Н5ОН, Хтах, нм) 275, 311; (СН3С00Ыа, Хтах, нм) 280, 318. ИК-спектр (КВг, и, см-1) 1625, 1560, 1520, 1480 (Аг), 1715, 1730 (>С=О), при сравнении с достоверным образцом кумарина не наблюдалось депрессии температуры плавления. Вещество идентифицировали как кумарин.
Вещество К2. С9Н6О3, белые игольчатые кристаллы, т. пл. 231-233 °С (из СН30Н). Яг 0,33 (система I),
0,88 (система 2). УФ-спектр (С2Н50Н, Хтах, нм) 256, 325. При добавлении натрия ацетата наблюдается бато-хромный сдвиг длинноволновой полосы (240, 378 нм). ИК-спектр (КВг, и, см-1) 1616-1575 (Аг), 3300 (-ОН), 1718, (>С=О). На основании данных хроматографического анализа, температуры плавления, УФ- и ИК-спектральным характеристикам, отсутствию депрессии, температуры плавления смешанной пробы со стандартным образцом вещество К2 было охарактеризовано как 7-гидроксикумарин - умбеллиферон.
Вещество К3. СюН8О4, белый кристаллический порошок с красноватым оттенком, т. пл. 204-206 °С (из СН30Н). 0,56 (система I), 0,38 (система 2). В УФ-спектре вещества имеются максимумы поглощения 256,
300, 315, 340 нм, если добавить натрия ацетат, то наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы (240, 378 нм). В ИК-спектре (см-1) наблюдаются полосы поглощения при 1708 (>С=О), 3300-3350 (-ОН), 2930, 2845(-ОСН3).
При сравнении данных хроматографического анализа, температуры плавления, по УФ- и ИК-спектральным характеристикам, отсутствию депрессии температуры плавления смешанной пробы со стандартным образцом вещество К3 было охарактеризовано как 7-гидрокси-6-метоксикумарин - скополетин.
Вещество К4 - белые игольчатые кристаллы с т. пл. 215-219 °С (из СН30Н), растворяется в воде, метаноле, этаноле. [а]2°в -84,5°. В УФ-свете флуоресцирует ярко-голубым цветом, усиливающимся после обработки щелочью. УФ-спектр: (С2Н50Н, Хтах, нм) 250, 315 нм. ИК-спектр (см-1): 3100 (ОН), 1725 (>С=О), 1610 (Аг), 1580, 1520, 1460, 1095, 1055, 1030, 902, 885 (сахарный компонент). При кислотном гидролизе образуется агликон с т. пл. 230-231 °С, имеющий на бумажной хроматограмме такую же подвижность, как и достоверный образец умбеллиферона. Хорошо растворим в этаноле, ацетоне, в этиловом эфире, не растворим в воде. УФ-спектр: (С2Н50Н, Хтах, нм) 255, 324 нм. ИК-спектр агликона полностью идентичен таковому ум-беллиферона. В углеводной части кислотного гидролизата бумажной хроматографией в системе н-бутанол -вода - пиридин (6 : 4 : 3) обнаружили глюкозу; проявитель - кислотный фталат анилина (т. 100-105 °С). Сопоставляя полученные нами данные с литературными, приходим к выводу о том, что вещество К4 представляет собой 7в-глюкозид-умбеллиферона, или скимин.
Вещество К5 - белые тонкие кристаллы-призмы с т. пл. 212-215 °С (из СН30Н), растворяющиеся в воде, метаноле и этаноле. В УФ-свете флуоресцирует ярко-голубым цветом. УФ-спектр: (С2Н50Н, Хтах, нм) 285, 310 нм. После кислотного гидролиза выделили агликон в виде белых игольчатых кристаллов. Агликон на бумажной хроматограмме проявляется на уровне достоверного образца скополетина; с т. пл. 201-203 °С, депрессии температуры плавления не показывает. УФ-спектр: (С2Н50Н, Хтах, нм) 300, 345 нм. В ИК-спектре (см-1) отмечены полосы поглощения, характерные для скополетина: 1708 (>С=О), 3300-3350 см-1 (-ОН), 2930, 2845 (-ОСН3) и 1095, 1055, 1030, 902, 885 (сахарный компонент). В сахарной части гидролизата с ис-
пользованием БХ установили наличие глюкозы - проявитель - свежеприготовленный кислотный анилин-фталат (т. 100-105 °С). Сопоставляя полученные нами данные с литературными, приходим к выводу о том, что вещество К5 - 7в-глюкозид-скополетина, или скополин.
Обсуждение результатов
При сопоставлении полученных данных качественного анализа веществ Аь А2, А3, А4 (табл. 2) по интенсивности и цвету окраски на хроматограммах с данными литературы можно предположить, что вещества являются оксикоричными кислотами. Окраска вещества А1 соответствует окраске кофейной кислоты, А2 - хлорогеновой, А3 - я-кумаровой, А4 - 3-п-кумароилхинной кислотам. После трехкратной кристаллизации из метанольно-водных растворов вещества имели температуру плавления: А1 - 194-196 °С; А2 - 203-206 °С; А3 - 213-215 °С; А4 - 242-243 °С.
Спектр поглощения в УФ-области веществ снимали в этаноле в присутствии ионизирующих и комплексообразующих добавок. При добавлении к спиртовому раствору вещества А1 плавленого ацетата натрия наблюдается гипсохромный сдвиг: I - ДХ-15; II - ДХ-10, и у вещества А3 также наблюдается гипсохромный сдвиг: I - ДХ-9; II - ДХ-7, а у вещества А2 и А4 отмечен незначительный батохромный сдвиг, что, вероятно, обусловлено в веществах А1 и А3 ионизацией свободной карбоксильной группы, сопряженной с ароматической системой, а у веществ А2, А4 карбоксильная группа не свободна.
Под влиянием этилата натрия наблюдается батохромный сдвиг максимума первой полосы вследствие ионизации свободных фенольных гидроксилов: А1 - ДХ+35; А2 - I - ДХ+55; А3 - ДХ+11; А4 - I - ДХ+37. Также можно сказать, что у соединений Аь А2, А4 больше гидроксильных групп, чем у А3. Обнаружение о-диоксигруппировки (по отношению ОН-групп друг к другу) проводили в присутствии хлористого алюминия. В соединениях Аь А2 наблюдается батохромный сдвиг, больше, чем у соединений А3, А4. При этом отмечается, что в этих соединениях появляются три интенсивных полосы поглощения (А1 - 360, 290, 240 нм; А2 - 360, 315, 240 нм), обусловленных образованием сопряженного алюминиевого комплекса по о-диокси-группировке. В спектре веществ А3, А4 наблюдается меньший батохромный сдвиг. В присутствии борной кислоты и ацетата натрия наблюдается незначительный гипсохромный сдвиг (I - ДХ-5), что обусловлено реакцией солеобразования по карбоксильной группе с ацетатом натрия, в результате чего уменьшается сопряжение борного комплекса по о-диоксигруппировке с карбонилом. В веществах А2, А3, А4 наблюдается батохромный сдвиг.
Для определения количества гидроксильных групп провели ацетилирование и метилирование, и определили их температуру плавления. Сравнивая полученные данные с данными литературы, определили, что они совпали с данными ацетокси- и метоксипроизводными кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, п-кумаровой и 3-п-кумароилхинной. Анализируя продукты щелочного плавления, были обнаружены: протокатеховая кислота (А1), протокатеховая и хинная кислоты (А2), я-оксибензойная кислота (А3), я-окси-бензойная и хинная кислоты, физико-химические константы которых были доказаны с помощью сравнения температур плавления, УФ- и ИК-спектроскопии и качественных реакций. В ИК-спектре обнаружены характерные группы (ОН) от 3400 до 2780, (>С=О) от 1695 до 1625 см-1, (Аг) 1625-1520 см-1, (сложноэфирная группа) для веществ А2, А4 1740-1790 см-1, что соответсвует ИК-спектрам кофейной, хлорогеновой, я-кумаровой и 3-п-кумароилхинной кислот. В ПМР-спектре соединения А2 обнаружены протоны кофейной кислоты: мультиплет в 3Н с центром при 5=6,85 м.д. (ароматические протоны 2, 5 и 6) и два дуплета винильных протонов при 5=6,04 и 7,42, находящиеся в транс-положении (I - 16 Гц). Для алифатических протонов характерны следующие сигналы: Н-4 двойной дуплет при 5=4,22 м.д. (I - 8,5 Гц; I - 3 Гц), Н-4 квартет при 4,67 м.д. (I - 3 Гц), Н-5 триплет дуплетов при 6,08 м.д. шириной 23 Гц (I - 9 Гц, I - 5Гц). Мультиплет 5=2,42-2,92 м.д. интенсивностью 4-Н, отвечает протонам С2 и С6 хинной кислоты.
В ПМР-спектре пентаацетата присутствуют сигналы пяти ацетильных групп: синглеты 5=2,30 (6Н), 2,01 (3Н), 2,11 (3Н) и 2,15 (3Н) м.д. В спектре отмечен также явно выраженный двойной дуплет оксиального протона Н-4 (5=5,14 м.д., 10,4 Гц), что свидетельствует о сохранении конформации хинной кислоты.
При проведении цианидиновой реакции вещества окрашиваются и имеют окраску от малиновой до оранжевой. При добавлении октанола вещества А5, А8 и Ацз перешли в органическую фазу, из этого следует, что эти вещества являются агликонами, а вещества А6, А7, А9, Ап и А12 - гликозидами.
Полученные вещества А5, А8 и Аю перекристаллизовывали из водного метанола или этанола. При проведении качественных реакций на хроматограммах (табл. 1) с хлоридом алюминия и гидроксидом
натрия возникает желто-зеленое или желтое окрашивание; с раствором хлорного железа - темно-зеленое окрашивание; с диазотированной сульфониловой кислотой - оранжевое, что соответствует литературным данным по окраске флавонолов с данными реактивами.
Температура плавления веществ составила: А5 - 310-312 °С; А8 - 273-275 °С; А10 - 306-307 °С. Поглощение в УФ-области: А5 - 372, 264, 256 нм; А8 - 368, 267 нм; А10 - 371, 265 нм указывает на флавоно-ловую структуру соединений.
В УФ-области спектра А5, наличие характерного батохромного сдвига первой полосы поглощения с ацетатом натрия на 12 нм указывает на наличие свободной оксигруппировки при С-7 и на 18 нм при добавлении ацетата натрия с борной кислотой указывает на свободные о-диоксигруппировки при С-3' и С-4' в боковом фенильном радикале. Батохромный сдвиг на 86 нм при добавлении хлорида алюминия и сохранение устойчивости комплекса при добавлении хлористоводородной кислоты с незначительным уменьшением сдвига на 58 нм указывает на свободные оксигруппы при С-3 и С-5.
В УФ-спектре А8 наличие характерного батохромного сдвига первой полосы поглощения с ацетатом натрия на 12 нм говорит о наличии свободной оксигруппировки при С-7, и при добавлении ацетата натрия с борной кислотой сдвиг первой полосы составляет - 3 нм, что указывает на присутствие одной свободной оксигруппировки при С-4' в боковом фенильном радикале. Батохромный сдвиг на 57 нм при добавлении алюминия хлорида и сохранение устойчивости комплекса при добавлении хлористоводородной кислоты указывает на свободные оксигруппы при С-3 и С-5.
Наличие характерного батохромного сдвига первой полосы поглощения вещества Аі0 с ацетатом натрия на 9 нм говорит о наличии свободной оксигруппировки при С-7, и при добавлении ацетата натрия с борной кислотой сдвиг первой полосы составляет 1 нм, что свидетельствует о присутствии одной свободной оксигруп-пировки при С-4' в боковом фенильном радикале и замещении или отсутствии в 3'-положении. Батохромный сдвиг на 59 нм при добавлении алюминия хлорида и практическое сохранение устойчивости комплекса при добавлении хлористоводородной кислоты (57 нм) указывает на свободные оксигруппы при С-3 и С-5.
Продукты щелочного гидролиза извлекали эфиром при подкислении 20% хлористоводородной кислотой, эфирные извлечения промывали водой, а затем высушивали над безводным сульфатом натрия, а затем упаривали до сухого остатка. Остаток растворяли в этаноле и хроматографировали с достоверными «свидетелями»: я-оксибензойной, протокатеховой, ванилиновой кислотами и флороглюцином. Хроматограммы после высушивания проявляли 0,1% раствором диазотированной сульфониловой кислоты и 10% метанольным раствором щелочи. Продукты гидролиза вещества А5 окрасились в оранжево-красный цвет, что соответствовало окраске флороглюцина и протокатеховой кислоты. Продукты гидролиза вещества А8 окрасились в оранжево-красный - оранжево-желтый цвета, что соответствовало окраске флороглюцина и я-окси-бензойной кислоты. Продукты гидролиза вещества Аі0 окрасились в оранжево-красный - оранжевый цвета, что соответствовало окраске флороглюцина и ванилиновой кислоты. В ИК-спектре полосы поглощения соответствуют ОН-группе 3455-3340; (>С=О) 1658-1655; (Аг) 1615-1605, 1515-1505 см-1. Вещество Аі0 имеет полосу поглощения 2895 см-1, что соответствует ОСН3 группе. В ПМР спектре данных соединений наблюдаются сигналы протонов 5=5,0-8,0 мд., характерные для протонов хромонового цикла и бензольного кольца. Сопоставляя полученные нами данные щелочной деструкции с данными литературы, мы определили, что вещество А5 является кверцетином, вещество А8 - кемпферолом, вещество Аі0 - изорамнетином.
Гликозиды - вещества А6, А7, А9, Ап и Аі2. Температура плавления веществ составила: А6 - 190-192 °С; А7 - 232-234 °С; А9 - 178-180 °С; А„ - 170-172 °С и А12 - 180-182 °С. Поглощение в УФ-области А6, А7, А9, Ац и Аі2 в интервале 250-270 и 350-390 нм и плечо у А6 - 264 и у А7 - 265 нм, и частота валентных колебаний >С=О-группы в ИК-спектре вещества: А6 - 1658; А7 - 1658; А9 - 1660; Ап - 1665 и Аі2 - 1660, указывают на флавоновую структуру соединения. Наличие «плеча» свидетельствует о присутствии в боковом фенольном радикале свободной о-оксигруппировки. Комплексообразование с диагностическими добавками указывает на наличие свободных оксигрупп в положениях: для вещества А6 и А7 в положениях 5, 7, 3', 4'; для вещества А9 - 5, 7, 4', для вещества Ап и Аі2 - 5, 7, 4'. Кислотный гидролиз веществ А6, А7, А9, Ац, Аі2 дал агликон и гликозидную часть, агликон для веществ А6, А7 был идентифицирован как кверцетин. У вещества А9 агликон был идентифицирован как кемпферол; у веществ Ац и Аі2 агликон - изорамнетин. Глико-зидная часть у веществ А6 и Аі2 - рутиноза, у А7 - галактоза, а у А9 и Ац - глюкоза. Физико-химические параметры данных веществ были доказаны с помощью качественных реакций, УФ-спектроскопии, бумажной хроматографии, сравнением температуры плавления с достоверными образцами. Ферментативный гид-
ролиз (Р-гидролаза) привел к образованию агликонов: кверцетина, кемпферола и изорамнетина, и сахаров: рутинозы, галактозы, глюкозы. При снятии ИК-спектров после гидролизов (кислотного и ферментативного) обнаружены полосы поглощения в интервале 1085-1025 см-1 (валентные колебания пиранозного цикла сахара) 925-969 см-1 (асимметрические колебания пиранозного цикла), 890-870 см-1 (Р-конфигурация глико-зидной связи). Ацетилирование и метилирование приводит к образованию ацетокси- и метоксипроизводных, что подтверждает отсутствие батохромии и гипсохромии в УФ-спектрах при добавлении специфических реактивов.
На основании полученных данных можно заключить, что вещество А6 - рутин (кверцетин-3-рутинозид), А7 - гиперозид (кверцетин-3-0-Р-Б-галактопиранозид), А9 - астрагалин (кемпферол-3-глюкопиранозид), Ап
- изорамнетин-3-глюкозид, А12 - изорамнетин-3-рутинозид. В ПМР-спектрах полученных соединений два дублета (5=6,28 и 6,50 м. д.; I = 2,61 Гц) соответствуют двум протонам при С6 и С8 кольца «А». Боковое фе-нильное кольцо «В» пара-замещенное, о чем свидетельствуют два дублета (5=6,98 и 8,11 м.д.). Константа I = 9,0 Гц отвечает взаимодействию протонов при С2 и Сз' и при С5' и С6', находящихся в орто-положении по отношению друг к другу. Сигнал при 5=12,68 м.д. принадлежит протону 5-ОН группы. Широкий синглет (ширина 60 Гц) с центром при 5=9,83 м.д. обусловливается протонами 4'-ОН и 7-ОН групп. Сигналы при 5=4,20-5,82 м.д. относятся к протонам гликозидного заместителя для веществ А6, А7, А9, Ап, А12. Углеводная часть имеет 5=3,1—3,8 м.д.
Индивидуальные вещества кумариновой природы выделили из хлороформной фракции на колонке с силикагелем. При непродолжительном действии горячей разбавленной натриевой щелочи данные вещества медленно образуют желтые растворы. При последующем подкислении щелочных растворов вещества регенерируются в прежнее состояние. При длительном нагревании веществ с разбавленными спиртовыми растворами натриевой щелочи происходит изменение окраски раствора от желтой до коричневой. При растворении выделенных веществ в концентрированных растворах щелочи и последующем их подкислении выпали осадки. Под действием солей диазония на вещества в слабощелочной среде (углекислый калий или натрий) образуются соединения, окрашивающие растворы в коричнево-красный и вишневый цвета. Вещества флюоресцируют на хроматограммах до обработки 10% раствором КОН синим, голубым, ярко-голубым цветом. После обработки хроматограмм интенсивность усиливается. В УФ-спектре имеются максимумы поглощения в абсолютном этаноле и при добавления натрия ацетата, соответствующие УФ-спектру оксикумаринов. В УФ-спектре окси-кумаринов представлена широкая полоса с максимумом около 320 нм, обусловленная конъюгацией карбони-лолактона с ароматическим ядром, более узкую в области 250-255 нм, которая может отсутствовать, и с минимумом при 260-265 нм. В ИК-спектрах веществ обнаружены полосы поглощения при 1708 (>С=О), 3300-3345 (-ОН), 2930-2840 (ОСН3), 1620-1570 и 1550-1470 (Аг) см1. При гидролизе веществ К4 и К5 образуются соответственно умбеллиферон и скополетин, и глюкоза. На основании полученных данных и данных литературы вещества представляют собой: К1 - кумарин, К2 - умбеллиферон, К3 - скополетин, К4 - 7в-глюкозид умбелли-ферона, или скимин, и К5 - 7в-глюкозид-скополетина, (скополин).
Выделение и доказательство структуры сапонинов будет нами описано в следующем сообщении.
Выводы
В надземной части астрагала эспарцетного обнаружены флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины.
Данные биологически активные вещества из астрагала эспарцетного, произрастающего в Предкавказье, нами выделены впервые. Учитывая достаточно большое содержание БАВ, астрагал эспарцетный может быть использован в медицине и ветеринарии для создания лекарственных препаратов.
Список литературы
1. Фоменко М.Г., Фоменко Г.Ф. Фитотерапия хронических заболеваний. Ростов-на-Дону, 2000. 175 с.
2. Гужва Н.Н. Фенольные соединения растений рода астрагал и их биологическая активность // Деп. в ВИНИТИ
№3249-В-99. РЖ 04, Биология №9 №00.09-04.06.36.
3. Клышев Л. К. Бандюкова В.А. Алюкина Л.С. Флавоноиды растений. Алма-Ата, 1978. 219 с.
4. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растения, их эфиры и гликозиды // Химия природных соединений. 1983. №3.
С. 263-273.
5. Терентьева С.В. Разработка эффективного противосудорожного средства из чертополоха курчавого: автореф. дис. ... канд. фарм. наук, Пермь, 2000. 27 с.
6. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. M., 1984. 162 с.
7. Гужва H.H, Домунян A.M. Разработка технологии сухого экстракта астрагала эспарцетного // Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров. Пятигорск, 1999 С. 45.
8. Гужва H.H. Теоретическое и экспериментальное обоснование применения растений рода астрагала для получения медицинских и ветеринарных препаратов: дис. ... канд. фарм. наук, Пятигорск, 1990. 209 с.
9. Гужва Н.Н., Джумырко С.Ф., Колпак A.M., Анисимова В.П. Кумарины, фенолкарбоновые кислоты A. cicer // Химия природных соединений. 1992. №6. С. 714.
Поступило в редакцию 24 апреля 2009 г.
