CC BY
184
УДК 615.322:582.736.31.012:547.814:543
ФЛАВОНОИДЫ АСТРАГАЛА КОРОТКОПЛОДНОГ О ASTRAGALUS BRACHYCARPUS M. B. FL
В надземной части астрагала короткоплодного (A. brachycarpusM. B. Fl) хромато-спектрофотометрическими методами исследован качественный состав и количественное содержание флавоноидов.
Были идентифицированы изорамнетин, кверцетин, кемпферол, изорамнетин—3—о—|3—D-глюкопиранозид и изорамнетин-3-р^-галактопира-нозид, кемпферол-3-глюкопиранозид (астрагалин) (М3); изорамнетин—3—о— р- D-глюкопиранозил—6—о—|3—L-рамнопиранозид, кверцетин —3—о—|3—D-глю-копиранозил-6-о-|3^-рамнопиранозид (рутин), кверцетин—3—о—|3^-галактопи-ранозил—6—|3—L-рамнопиранозид, кемпферол—3—о—|3—D-галактопиранозил-2-о-р-Ь-арабопиранозид. Структуру выделенных соединений доказывали с использованием УФ, ИК-спектроскопии, дифференциальной ИК-спектроскопии, изучением продуктов щелочного, кислотного и ферментативного гидролиза. Количественное содержание флавоноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье составило 3,3%.
Ключевые слова: астрагал короткоплодный, флавоноиды, гидролиз, количественное определение, дифференциальная УФ-спектроскопия, ИК-спектроскопия.
Растения рода Астрагал широко используются в народной медицине при заболеваниях почек, крови, как противовоспалительные средства, влияющие на иммунную систему. Так, в наро д-ной медицине из астрагалов 16 уже используются, однако в официальной медицине разрешены к применению только 2 астрагала — а. шерстистоцветковый (A.dasyanthusРаll.) для настоев и отваров и а. серпоплодный (A.falcatusLam) — для получения субстанций [1,2].
Известно, что в последние годы повысился интерес к лекарственным препаратам растительного происхождения [3]. Препараты из лекарственных растений особенно ценны при лечении хронических заболеваний, когда больные нуждаются в длительном приеме лекарств. Их преимущество перед синтетическими лекарствами, как известно, состоит в том, что они редко вызывают побочные реакции организма, почти не токсичны, хорошо переносятся больными независимо от возраста, применяются с профилактической целью и для длительных курсов лечения [4].
Цель нашего исследования — определение качественного состава и количественного содержания флавоноидов в надземной части астрагала короткоплодного, для дальнейшего выявления наиболее перспективных видов данного рода по содержанию биологически активных веществ.
Материалы и методы. Астрагал короткоплодный (AstragalusbrachycarpusM. B. Fl) семейства бобовых (Fabaceae) — многолетнее травянистое растение от 15 до 40 см высотой. Прижатое, серо-пушистое, листья из 10-15 пар, продолговато-эллиптических тупых листочков около 10 мм длины. Кисти негустые, сначала яйцевидно-продолговатые, позже рыхлые, вытягивающиеся, длиннее листьев, приподнимающиеся, редко прямые. Чашечка прижатая, черно-пушистая, зубцы шиловидные в 3-4 раза короче трубочки. Цветки грязно-фиолетово-пурпурные, 15-18 мм длины. Боб прямой, прижато-пушистый к основанию, слегка вздутый, 13-14 мм длины (с носиком), около 5 мм ширины. Произрастает в Предкавказье, Армении, обычно до среднего горного пояса на сухих травянистых и щебнистых местах. Географический тип: иберийский [5].
Исследование проводили в 2011 и 2012 годах. Надземную часть астрагала A. Brachycarpus заготавливали в окрестностях города Пятигорска (гора Машук, юго-восточный склон) в июне месяце, в период цветения.
Сырье (1,0 кг) измельченное до 3-5 мм исчерпывающе экстрагировали 70% этанолом до отрицательной реакции на флавоноиды. Полученное извлечение сгущали до 1/3 объема, отогнав этанол под вакуумом и оставляли в холодильнике на 48 часов, выпавшую липофильную часть отфильтровывали и промывали на фильтре горячей водой и последовательно обрабатывали гекса-ном, хлороформом, этилацетатом, бутилацетатом, н-бутанолом. Выделенные извлечения концентрировали, а затем разделяли с использованием одно- и двухмерной хроматографии на бумаге
Н.Н. ГУЖВА Т.Т. ЛИХОТА З.Н. БОГАТЫРЕВА
Пятигорская государственная
академия
e-mail:
(БХ) (марки «М» и «С» Санкт-Петербургской фабрики №2 имени Володарского, FN-11 (Германия)) и тонкослойной хроматографии на пластинах (Silufol-254 (Kavalier), MerckKGaAKieselgel 60 F254 и «Сорбфил» аналитические на полимерной и алюминиевой подложке ЗАО «Сорбполимер» (Краснодар, Россия)), в следующих системах растворителей: 1) 2 н 15% уксусная кислота; 2) БУВ (4:1:2); 3) хлороформ — уксусная кислота (3:2); 4) н-гексан — бензол — метанол (5:4:1) [6,7].
Хроматограммы просматривали в видимом и УФ свете до и после обработки концентрированным раствором аммиака и различными ионизирующими реактивами.
Для выделения и идентификации индивидуальных флавоноидов применяли разделение их на колонке с полиамидным сорбентом или препаративное разделение хроматографическое на бумаге в нескольких системах растворителей с последующей дробной кристаллизацией выделенных соединений. Полученную сумму фенольных соединений (по 25,0 г) растворяли в 30 мл безводного этанола и смешивали с 250,0 г полиамидного сорбента, который затем сушили при температуре 30-350С до удаления запаха этанола. Сорбент с адсорбированной в нем суммой фенольных соединений из исследуемого астрагала короткоплодного наносили на подготовленную колонку полиамидного сорбента (L=140 см, d = 3 см), активированного 2% раствором хлороводородной кислоты. Элюировали последовательно водой и этанолом различной концентрации. Колонку просматривали в УФ-свете, наблюдали четкие зоны разделения соединений на сорбенте. Процесс элюирования контролировали хроматографией на бумаге. Собирали отдельные фракции. Отгоняли растворитель досуха, вещества перекристаллизовывали из метанола и этанола [7].
Вещества высушивали в вакуум-сушильном шкафу при температуре 400С в вакууме 0,01 мм. рт. ст.
Структуру выделенных соединений доказывали с использованием данных УФ- и ИК- спектроскопии, результатов кислотного, щелочного и ферментативного гидролизов.
УФ-спектры измеряли на спектрофотометре СФ-56, «Specord-Vis» в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве растворителя использовали 95% этанол и метанол.
ИК-спектры измеряли в вазелиновом масле и в таблетках калия бромида на «UR-20», «Specord-Vis» (с призмами NaCl и NaF в области 800-3600 см-1, концентрация вещества 0,5%). Удельное вращение гликозидов флавоноидов определяли на колориметре круговом «модель СМ» в кюветах с рабочей длиной 0,5 дм.
Щелочной гидролиз. 10 мг исследуемого вещества растворяли в 10 мл 40% раствора гидро-ксида калия и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2х часов. Реакционную смесь подкисляли 20% хлористоводородной кислотой до рН 4-6, а продукты гидролиза извлекали этиловым эфиром 3 раза порциями по 10 мл. Эфирные извлечения промывали водой и высушивали безводным сульфатом натрия. Эфир упаривали досуха, остаток растворяли в 0,5 мл этанола и хромато-графировали в 15% уксусной кислоте в присутствии «свидетелей».
Для установления состава изучаемых веществ был проведен количественный кислотный гидролиз: навеску вещества растворяли в 50% метаноле, содержащем 5% серной кислоты и гидро-лизовали на кипящей водяной бане в течение 2х часов. Полноту гидролиза контролировали хро-матографированием реакционной смеси в системе «1». По окончанию гидролиза смесь разбавляли водой и пропускали через слой полиамидного сорбента. Вымывание углеводного остатка проводили водой, а агликоны количественно десорбировали 95% этанолом. Этанол отгоняли, остаток высушивали до постоянной массы при температуре 100-1100С и взвешивали.
Исследование углеводного состава. Углеводы, образующиеся в результате гидролиза фла-воноидных гликозидов, анализировали методом хроматографии на бумаге в системе растворителей: А)н-бутанол— пиридин -вода (6 : 4 : 3), Б) н-бутанол—ацетон—вода(2 : 7 : 1), В) н-бутанол— бензол—пиридин—вода (5 : 1 : 3 : 3), Г) н-бутанол—уксусная кислота—вода (4 : 1 : 2), Д) этилацетат— уксусная кислота-вода (9 : 2 : 2),.
Детектирование углеводных компонентов проводили бутанольным раствором анилинфта-лата с последующим прогреванием хроматограмм в сушильном шкафу при 1050С до проявления пятен. Идентификацию проводили с использованием аутентичных образцов углеводов.
Ферментативный гидролиз. Энзиматический гидролиз исследуемых монозидов проводили ферментным препаратом из гриба Aspergillusoryzae и эмульсином. Для этого 3 мг вещества растворяли в 1 мл 10% этанола при нагревании; к охлажденному до 300С раствору добавляли 3 мл раствора фермента и оставляли в термостате при температуре 360С на 24 часа. После гидролиза фермент осаждали добавлением 95% спирта и кипячением в течении 30 минут раствора, осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали до 1 мл и исследовали хроматографией на бумаге.
В результате исследования было установлено отщепление углеводных компонентов у всех изучаемых гликозидов. На основании изучения полученных хроматограмм сахарный компонент гликозидов М1 и М3 идентифицировали с D-глюкозой, а агликон у М1 представлен изорамнетином.
Количественное определение. Содержание флавоноидов в сырье определяли методом дифференциальной УФ-спектрофотометрии [6]. Определение основано на способности флавоноидов образовывать окрашенный комплекс со спиртовым раствором хлорида алюминия, который вызывает батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения и при этом дает основной максимум поглощения при А=412 нм. Аналогичный максимум поглощения при А=410 нм отмечен для комплекса раствора рутина, используемого нами в качестве стандартного образца. Применение в качестве раствора сравнения испытуемого экстракта без комплексообразователя позволяет исключить влияние сопутствующих веществ. Содержание флавоноидов составляет 3,3% (среднее из 6 определений). Статистическую обработку полученных результатов проводили по ГФ [8]
Обсуждение результатов. В результате разделения на колонке были получены вещества, относящиеся к агликонам, монозидам и биозидам флавоноидов.
Одним из этапов наших исследований стали агликоны (табл. 1), которые нами названы Al, A2 и A3. Изучаемые вещества дают положительную цианидиновую реакцию, которая характеризует их флавоноидную природу, а переход оранжево-красного окрашивания (пигмента) в слой окта-нола свидетельствует о принадлежности исследуемого вещества к агликонам.
Таблица 1
Качественный анализ агликонов цветными реакциями на бумаге
Соединение Cистема Окраска пятен
А В В видимом свете В УФ- свете NH3 в УФ- свете ACl3 5% эта-нольный раствор в УФ-свете КОН метаноль-ный раствор в УФ-свете FeCl3 этаноль-ный раствор в УФ-свете ZrO(NO3)2 2% метанольный раствор в УФ-свете
Rf Rf
А1 0,04 0,64 Бледно-желтая желтая Желто-зеленая Ярко-желтая Желтая Темно-зеленая желтая
А2 0,47 0,53 Бледно-желтая Желто-зеленая Желтая Желто-зеленая Ярко-желтая Темно-зеленая желтая
A3 0,08 0,82 Бледно-желтая Желто-зеленая Желтая Желто-зеленая Ярко-желтая Темно-зеленая желтая
Агликоновый характер веществ подтвердился также величиной молекулярных масс и элементным составом.
Темно-зеленое окрашивание с хлоридом железа (III), и желтое с раствором хлорокиси циркония, сохраняющееся после добавления раствора лимонной кислоты, обнаруживает оксигруппу в 3 положении у всех веществ.
Растворы вещества А1 в отличие от других веществ восстанавливают аммиачный раствор нитрата серебра, вероятно, за счет о-диоксигруппировки, которая обнаруживается также по образованию осадка с ацетатом свинца.
В ИК-спектрах отмечены максимумы полос при 3500-3200 см-1 (ОН-группа), 1670 — 1650 см-1 (С=О гамма-пирона), 1520 см-1 (СН-ароматических циклов), 840 см-1(пара замещение в бензольном кольце).
В веществе А2 отмечен максимум полос поглощения при частоте 2945, что определяет наличие метоксильной группы.
Помимо качественных реакций на отдельные оксигруппы, положение фенольных гидро-ксилов обнаруживали по данным УФ-спектроскопии, применяя ионизирующие и комплексообра-зующие диагностирующие реагенты. В УФ-спектрах соединений соотношение интенсивностей I и II полос поглощения является характерным для флавоноидов (табл. 2).
Таблица 2
Спектральные характеристики в УФ-области агликонов
Соеди- Полосы 2 •Ю-5 мол. р-р Положение максимума поглощения, нм
нение Погло- в этаноле ZrOCl2 ZrOCl2 + CH3COONa CH3COONa ACl3 ACl3+HCl C2H5ONa
щения лим.к-та +H3BO3
А1 I 372 460 90 430 60 384 +12 390 +18 458 +86 430 +58 333 -39
264
II 256 275 20 255 0 374 +18 259 +3 272 +16 271 +15 270 +14
А2 I 371 460 90 380 +9 372 +1 430 +59 428 +57 420 +49
265 420 50
II 254 268 13 274 +20 254 0 267 +13 267 +13 270 +16
A3 I 368 457 90 415 48 380 +12 365 -3 425 +57 425 +57 408 +40
II 267 280 15 280 15 273 +6 267 0 274 +7 274 +6 276 +9
Батохромный сдвиг максимума 1 полосы в веществах А1, А2, А3 на 90 нм под воздействием хлорокиси циркония и на 40-60 нм при добавлении хлорокиси циркония и лимонной кислоты указывает на оксигруппу в 3 положении.
7 оксигруппа обнаруживалась в веществах А1, А2, А3 по батохромному сдвигу максимума 1 полосы в веществах А1, А2, А3 на 15-40 нм под ионизирующим воздействием натрия ацетата; оксигруппа в 4' положении обнаруживалась во всех исследуемых веществах по батохромному сдвигу на 33-49 нм под влиянием этилата натрия. В веществе А1 выявлена 3', 4' диоксигруппировка по сдвигу длинноволновой полосы на 18 нм под влиянием борной кислоты и ацетата натрия. Это же по д-тверждается и результатами исследования комплексов изучаемых веществ с алюминия хлоридом, алюминия хлоридом в присутствии хлористоводородной кислоты. Известно, что алюминия хлорид с флавонами и флавонолами, содержащими гидроксильные группы в 3 и 5 положениях, образует в кислой среде устойчивый комплекс и малостойкий с веществами, содержащий о-диоксигруппу.
Следовательно, в веществе А1 имеются свободные оксигруппы в 3,5,7,3',4' положениях, А2, А3 — в 3,5,7,4' положениях.
Учитывая данные ИК-спектров (табл. 3), нами было проведено дезметилирование указанных веществ йодистоводородной кислотой в среде жидкого фенола и уксусного ангидрида. При исследовании в УФ-области продуктов дезметилирования с применением диагностирующих реагентов было установлено наличие дополнительных оксигрупп в положении 3'.
Таблица 3
Соединение Полосы поглощения в ИК области, V см-1
С=О -ОН С=С ароматического кольца ОСН3
А1 1665 3300,3380 1615,1565,1515 -
А2 1658 3455 1605, 1565, 1505 2895
А3 1660 3340 1615, 1570, 1510 -
Положение свободных оксигрупп подтверждено также получением при щелочной деструкции фенола, идентифицированного с флороглюцином, свидетельствующего о флороглюцино-вой структуре кольца А и фенолкарбоновых кислот: п-оксибензойной А3; протокатеховой А1, ванилиновой А2.
Выход агликона вещества А1 равен 65,51% (среднее из 6 определений), выход агликона вещества А2 равен 69,48% (среднее из 6 определений).
Сопоставляя результаты собственных исследований: значения в различных системах, качественные реакции, физико-химические свойства, температура плавления веществ, продуктов щелочного расщепления, а также результаты УФ- и ИК-спектроскопии с литературными данными, касающимися кверцетина, изорамнетина, кемпферола, можно предположить, что выделенное вещество А1 это 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавон (кверцетин), А2 — 3,5,7,4'-тетраокси-3'-метоксифлавон (изорамнетин), А3 — 3,5,7,4'-тетраоксифлавон (кемпферол).
Следующим этапом нашей работы явилось изучение монозидов.
Изучаемые вещества дают положительную цианидиновую реакцию по Брианту, что свидетельствует об их флавоноидной природе, а факт неперехода красно-оранжевого пигмента в слой октанола свидетельствует о принадлежности исследуемого вещества к гликозидам, что находит подтверждение в реакции восстановления жидкости Фелинга после предварительного их гидролиза. Со спиртовым раствором хлорного железа изучаемые гликозиды образуют темно-зеленое окрашивание (табл. 4); отрицательная реакция с 2% метанольным раствором хлорокиси циркония и лимонной кислоты подтверждает наличие свободной оксигруппы в 5 положении.
Таблица 4
Качественный анализ монозидов цветными реакциями на бумаге_
Соединение Система Окраска пятен
А В В видимом свете В УФ- свете ЫН3 в УФ- свете А1С13 5% эта-нольный раствор в УФ-свете КОН мета-нольный раствор в УФ-свете БеС13 эта-нольный раствор в УФ-свете
ЯГ ЯГ
М1 0,55 0,62 Темно-желтая Желтая Желто-зеленая Желтая Желто-оранжевая Темно-зеленая
М2 0,52 0,65 Темно-желтая желтая Желто-зеленая Желтая Желто-оранжевая -
М3 0,43 0,72 Бледно-желтая Коричневая Желтая Желто-зеленая Оранжевая -
Реакция Вильсона — одна из специфических на флавоноиды — давала положительный результат. Исследуемые вещества не восстанавливают аммиачного раствора нитрата серебра, что указывает на отсутствие о-диоксигруппировки в В-кольце.
При хроматографировании на бумаге с достоверными образцами гликозидов в различных системах растворителей, полное совпадение по окраске пятен до и после проявления, а также значением наблюдалось у вещества М1 с изорамнетин-3-р-Б-глюкоииранозидом, у вещества М2 с изорамнетин-3-р-Б-галактоииранозидом и вещества М3 с кемпферол-3-р-Б-глюкопиранозидом.
При спектральном исследовании в УФ-области (табл. 5) с применением комплексообра-зующих и ионизирующих реактивов обнаружили свободные оксигруппы в 5,7,4' — положениях (М1 и М2, ); и в 5,4' — положении (вещество М3). Батохромия циркониевых комплексов на 40-46 нм по сравнению со значительно большей батохромией — 90 нм, наблюдающейся в их агликонах, указывает, что углеводный компонент находится у С-3. При подкислении циркониевых комплексов лимонной кислотой наблюдалось восстановление исходного спектра веществ.
Таблица 5
_Спектральные характеристики в УФ-области монозидов_
Соединение
М1
Полосы поглощения
М2
МЗ"
2 •Ю-5 мол. р-р в этаноле
I
351 253
348
252
349 267
7ГОС12
400 255
45 о
416
270
402 256
40
7
46
7ГОС12 + Лим.к-та
Положение максимума поглощения, нм
355 255
380 270
355 255
СН3С00Ыа
383 275
СН3СООЫа +Н3ВО3
+34 +8
365 254
+8
363 250
+6
349 267
А1С13
397 275
+48 +8
А1С13+ НС1
С2Н50Ш
387
275
+38 +8
401
275
+ 52 +8
1
1
0
В результате проведенного кислотного и ферментативного гидролиза получены продукты, которые выделены препаративно и на основании физико-химических свойств, а также хромато-графического сравнения с известными образцами идентифицированы как О-глюкоза и 3,5,7,4'-тетраокси-З'-метоксифлавон (изорамнетин); О-галактоза и изорамнетин, О-глюкоза и 3,5,7,4'-тетраоксифлавон (кемпферол). Количественный кислотный гидролиз дает основание полагать, что исходные вещества являются монозидами. Легкое отщепление углеводного компонента в результате кислотного гидролиза указывает на то, что данный компонент не ацилирован и находится в 3 положении. Подтверждением этому служат отрицательные результаты, полученные при щелочном гидролизе. Факт отщепления ферментом гриба AspergillusoryzaeD-глюкозы в веществах М1 и МЗ; Б-галактозы в веществе М2 дает основание предположить наличие р-гликозидной связи в изучаемых соединениях (табл. 6).
Таблица 6
Результаты хроматографического исследования углеводного компонента монозидов
Система растворителей Значение ЯГ
Исследуемых сахаров «свидетелей»
М1 М2 МЗ арабиноза галактоза глюкоза
А 0,19 0,17 0,19 0,24 0,17 0,19
Б 0,15 0,13 0,16 0,21 0,13 0,16
В 0,12 0,11 0,12 0,21 0,11 0,12
Г 0,16 0,14 0,16 0,22 0,14 0,16
Д 0,48-0,50 0,47 0,50 0,55 0,47 0,50
Окраска пятен Темно- Темно- Темно- красноватая Темно- Темно-
после проявления коричневая коричневая коричневая коричневая коричневая
анилинфталатом
Спектральные исследования в ИК-области методом дифференциального анализа (спектрограммы) показали наличие полосы, характерной для карбонила гамма-пиронового кольца (1660), сопряженных двойных связей (1595, 1578), фенольных гидроксилов (3300, 3340, 3270). Наличие полосы при 890 см является определяющим фактором р-конфигурации гликозидной связи в пи-ранозидах. Полосы при 1052, 1074 и 1098 см указывают, что углеводный компонент в исследуемых гликозидах находится в пиранозной форме (табл. 7). [7]
Полосы поглощения в ИК-области монозидов
СоедиНение Полосы поглощения в ИК области, V см-1
С=О -ОН С=С ароматического кольца ОСН3 Сахарного компонента
М1 1665 3385, 3100 1610, 1560 2985 1090, 1050, 1025, 890
М2 1660 3390, 3120 1610,1565 2985 1085, 1055, 1030, 925, 890
М3 1660 3425, 3180 1610, 1575, 1510, 1455 - 1095, 1055, 1030, 902,885
Итак, на основании данных химического и спектрального исследования, вещества можно охарактеризовать как изорамнетин-3-о-р-Б-глюкопиранозид (М1) и изорамнетин-3-р-Б-галактопиранозид (М2), кемпферол-3-о-р-Б-глюкопиранозид (астрагалин) (М3).
Другие выделенные вещества представляют собой желтые микрокристаллические порошки, хорошо растворимые в 70% этаноле, метаноле, практически нерастворимы в эфире, хлорофо р-ме, бензоле, петролейном эфире, дают положительные качественнее реакции на флавоноиды. При цианидиновой реакции заметно наличие пигмента только в водном слое, что характеризует полученные вещества как гликозиды. жидкость Фелинга выделенные вещества восстанавливают после предварительного кислотного гидролиза. С 1% спиртовым раствором хлорного железа изучаемые гликозиды образуют темно-зеленое окрашивание; а с раствором основного ацетата свинца — желтый осадок. Вещества В2 и В3 окисляются на холоду аммиачным раствором нитрата серебра. С растворами щелочей образуют желто-оранжевое окрашивание, переходящее при стоянии в оранжево красное. С 2% метанольным раствором хлорокиси циркония образует желтое окрашивание, исчезающее под действием метанольного раствора лимонной кислоты, что указывает на свободную оксигруппу в 5 положении.
Одномерной и двухмерной хроматографией на бумаге в различных системах растворителей доказана индивидуальность выделенных соединений. На хроматограммах в УФ-свете все гли-козиды обнаруживаются в виде темных пятен, цвет которых изменяется при действии хлорокиси циркония с последующей обработкой влажных хроматограмм парами аммиака и становится оранжевым; (В2, В3); желто-зеленым (В4). Значения в различных системах растворителей (табл. 8) характеризуют изучаемые вещества как биозиды.
Таблица 8
Результаты хроматографического исследования биозидов
Система растворителей Значение ЯГ исследуемых биозидов
В1 В2 Рутин В3 В4
А 0,53 0,51 0,52 0,72 0,85
Б 0,75 0,74 0,74 0,80 0,84
В 0,54 0,47 0,47 0,39 0,27
Е 0,79 0,81 0,81 0,69 0,60
Ж 0,60 0,65 0,65 0,67 0,90
Д 0,57 0,55 0,55 0,70 0,82
Окраска пятен в УФ-свете Темная
Оранжево-желтая желто-зеленая
При спектральном исследовании в УФ-области обнаружены свободные оксигруппы в 5,7,4' положении (В1 и В4), 5,7,3',4' положениях (В2 и В3). Батохромное смещение максимума 1й полосы под влиянием хлорокиси циркония на 40-54 нм, которое устранялось при добавлении избытка раствора лимонной кислоты, свидетельствует о наличии углеводного заместителя у С-3 (табл. 9). Устойчивость изучаемых гликозидов к щелочному гидролизу также подтверждает ранее высказанное. Для идентификации составных компонентов выделенных веществ был проведен кислотный ступенчатый гидролиз 0,05н раствором хлороводородной кислоты в 50% этаноле. При этом агликоны в виде следов появляются уже на 3й минуте, одновременно образуются новые вещества, которые занимали на хроматограмме промежуточное положение. К концу 1 часа наблюдается значительное количество этих продуктов. Эти данные позволили сделать предположение о том, что образующиеся вещества являются моногликозидами изучаемых соединений. Для идентификации этих веществ мы выделяли их препаративно хроматографией на бумаге. При хроматографическом исследовании в присутствии «свидетелей» была установлена идентичность промежуточных веществ В1, В2 — изорамнетин-3-о-Б-глюкопиранозиду и кверцетин-3-о-Б-глюкопиранозу; промежуточных веществ В3 и В4 — кверцетин-3-о-Б-галактопиранозиду и кемпферол-3-о-Б-галактопиранозиду соответственно.
Спектральные характеристики в УФ-области биозидов
Соединение Ё . и ° Л 3 2 § § ^ й к С с 5 2^10-5 мол. р-р в этаноле Поглощение 2*10-5 мол. раствора в этаноле, нм
7ГОС12 2ГОС12+ лимонная к-та СН3СООЫа СН3<СХ№а +Н3БО3 АС13 АС13+НС1 С2Н50Ыа
Б1 I II 356 323 410 255 54 2 360 258 4 5 373 271 17 18 360 255 4 2 401 26 8 45 15 395 267 39 14 415 273 59 20
Б2 I II 358 257 403 260 45 3 359 261 1 4 383 268 25 11 279 255 21 -2 42 0 275 6 2 18 395 270 37 13 255 -2
Б3 I II 360 255 405 270 45 15 365 267 5 12 385 270 25 15 387 257 27 2 425 273 65 18 400 271 40 16 270 15
Б4 I II 355 258 395 255 4 0 -3 356 257 1 -1 370 272 15 14 355 260 0 2 393 26 8 3 8 10 355 270 0 12 370 268 15 10
Спектральные исследования в УФ-области показывают, что гликозилирование у промежуточных веществ гидролиза находится у С-3 (табл. 9).
Для определения строения биозидного заместителя в исследуемых гликозидах их подвергали также ферментативному расщеплению стереоспецифическим ферментным препаратом рам-нодиастазы, отщепляющим биозы с 1-6 порядком связи между остатками моносахаридов. Хроматографией на бумаге установлено, что гликозиды расщепляются до биозы и агликонов. Агликоны на основании физико-химических свойств, спектральных и хроматографических исследований охарактеризованы как изорамнетин, кверцетин и кемпферол.
Для установления места присоединения углеводной части к агликону в гликозиде, а также определения порядка связи сахаров в биозе часто проводят окислительную деструкцию ароматической части гликозида перекисью водорода с последующим аминолизом. Применив этот прием к изучаемым гликозидам, нами было установлено хроматографией на бумаге отщепление биоз и образование агликонов. Агликон вещества В4 хроматографическим и спектральным исследованием охарактеризовали как кемпферол. Окраска биоз на хроматограммах после проявления их специальным хромогенными реактивами показывает, что монозы в биозидах В1, В2, В3 связаны друг с другом в порядке 1-6; в биозиде В4 можно предположить в порядке 1-2.
Таблица 10
Биозиды и их физико-химические параметры
№ п/п Название вещества Брутто формула Т.пл(С°) УФ-спектры X тах (нм) Кислотный гидролиз
Агликон Сахарная часть
1 Б1 С28Н32О1№2О 180-182 266,354 Изорамнетин D-глюкоза Ь-рамноза
2 Б2 С21Н30О16 190-192 256,264, 355 Кверцетин D-глюкоза Ь-рамноза
3 Б3 С27Н30О16 193-194 255,360 Кверцетин D-галакт°за Ь-рамноза
4 Б4 С27Н30О16 184-186 255,358 Кемпферол D-галакт°за Ь-арабиноза
Исследование биозидов методами дифференциальной ИК-спектроскопии с исключением вклада моногликозидов из спектров исследуемых соединений показало, что оба сахара имеют пи-ранозную форму и |3-конфигурацию. В-конфигурация гликозидной связи между сахарами и агли-конами исследуемых биозидов подтверждается также расщеплением изучаемых гликозидов ферментным препаратом AspergШusoryzae и эмульсином.
Таким образом, исследуемые биозиды охарактеризованы как изорамнетин-3-о-р^-глюкопиранозил-6-о-р-Ь-рамнопиранозид(Б1), кверцетин — 3 — о — р — D — глюкопиранозил-6-о-р-Ь-рамнопиранозид(Б2), кверцетин-3-о-р^-галактопиранозил-6-р-Ь-рамнопиранозид(Б3), кемпферол — 3 — о — р — D — галактопиранозил — 2 — о — (3 — Ь -арабопиранозид(Б4) (табл. 10).
Литература
1. Государственный реестр лекарственных средств. — М., 1998. — 154 с.
2. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование
(Hydrangeaceae — Haloragaceae). Род Astragalus L. Л., — 1987.- С. 109-125.
3. Сравнительное исследование химического состава видов рода хвощ флоры Сибири /Н.Э. Коломиец,
Г.И. Калинкина//Химия растительного сырья. — 2010. — №1. — С.149-154.
4. Выделение флавоноидов из шелухи гречихи посевной — FagopyrumsagittatumGilib.
(Ро^опасеае)/Мягчилов А.В., Соколова Л.И.// Химия растительного сырья. — 2011. — №2. — С.123-126.
5. Гроссгейм. А.А. AstragalusL // Флора Кавказа. Т. 5. М.; Л.: Изд-во АН СССР - 1952. - С. 245-335.
6. Содержание и состав флавоноидов и фенолкарбоновых кислот Alfrediacernua (Asteraceae) /Н.В. Кува-
чева [и др.]// Растительные ресурсы, — 2011. — вып 4. — С. 105-112.
7.Биологически активные вещества астрагала эспарцетного, произрастающего в Предкавказье /Гужва
Н.Н.// Химия растительного сырья. — 2009. — №3. — С.123-132.
8. Государственная фармакопея СССР XI изд. Вып. 1: Общие методы анализа, — М., — 1987.- 336 с.
FLAVONOIDS OF ASTRAGAL SHORTyFRUITED (ASTRAGALUS BRACHYCARPUS M. B. Fl)
N.N. GUZHVA T.T. LIHOTA Z.N. BOGATIREVA
Pyatigorsk State
Pharmaceutical Academy
e-mail:
In the upground part of astragal shortyfruited (A. brachycarpus) by the chromato-spectrophotometric methods was researched qualitative composition and quantitative content of flavonoids.
There are isoramnetin, quercetin, cempferol, isoramnetin—3—0—p—D- glucopyranoside and isoramnetin—3— |3—D-galactopyranoside, cempferol-3- glucopyranoside (astragaline); isoramnetin—3—o—p-D-glucopyranosil— 6— o-|3- L -ramnopyranoside, quercetin—3—0—p—D-glucopyranosil-6-o-|-L- ramnopyranoside, quercetin—3—0—|-D-galactopyranosil —6—|—L- ramnopyranoside, cempherol—3—0—p—D-galactopyranosil-2-o-|-L- arabopyranoside was identified. Try to proving the structure of received compounds with use UV, IR-spectroscopy, differential IR-spectroscopy researching by the products alkaline melting and acidic hydrolysis. Quantitative determina- tion of flavonoids in count on the absolutely dry raw was compiled 3,3%.
Keywords: astragal shortyfruited, flavonoids, hydrolysis, quantitative de- termination, differential UV-spectroscopy.
