CC BY
35© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
А.С.Васильченко1,2, Е.А. Рогожин3, А.В. Валышев1
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ENTERO-COCCUS FAECIUM
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Оренбургский государственный университет; 3Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва
Цель. Выделить бактериоцины из метаболитов Enterococcus faecium и охарактеризовать их влияние на клетки грамположительных (Listeria monocytogenes) и грамотрицательных (Escherichia coli) бактерий. Материалы и методы. Для выделения бактериоцинов из куль-туральной среды бактерий применяли методы твердофазной экстракции, ионообменной и обращенно-фазовой хроматографии. Для характеристики массового состава полученных препаратов использовали MALDI времяпролетную масс-спектрометрию. Механизм биологического действия пептидов оценивали с использованием ДНК-тропных красителей (SYTO 9 и PI) с последующей регистрацией спектров флуоресценции. Для характеристики морфофункциональной реакции клеток-мишеней использовали атомно-силовую микроскопию (АСМ). Результаты. Из метаболитов энтерококков выделены пептидные фракции массой 1,0 — 3,0 кДа, подавляющие рост индикаторных микроорганизмов. Показано, что экзопродукты штаммов E. faecium при взаимодействии с L. monocytogenes увеличивают проницаемость мембран, что ведет в последующем к детектируемому нарушению нормальной клеточной морфологии листерий. С помощью АСМ выявлено изменение поверхности E. coli при воздействии очищенных пептидных фракций. Заключение. Проведенные исследования выявили влияние бактериоцинов энтерококков на микроорганизмы с различным типом строения клеточной стенки и подтвердили важность нарушения проницаемости бактериальных барьерных структур в механизме антимикробного действия энтероцинов.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 22—26
Ключевые слова: энтерококки, антимикробные пептиды, бактериоцины, энтероцины A.S.Vasilchenko1,2, E.A.Rogozhin3, A.V.Valyshev1
BIOLOGICAL ACTIVITY OF ANTIMICROBIAL PEPTIDES OF ENTEROCOCCUS FAECIUM
1Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg; 2Orenburg State University; 3Schemyakin and Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russia
Aim. Isolate bacteriocins from Enterococcus faecium metabolites and characterize their effect on cells of Gram positive (Listeria monocytogenes) and Gram negative (Escherichia coli) bacteria. Materials and methods. Methods of solid-phase extraction, ion-exchange and reverse-phase chromatography were applied for isolation of bacteriocins from cultural medium of bacteria. MALDI time-of-flight mass-spectrometry was used for characterization of the obtained preparations. The mechanism ofbiological effect of peptides was evaluated using DNA-tropic dyes (SYTO 9 and PI) with subsequent registration of fluorescence spectra. Atomic-force microscopy (AFM) was used for characterization of morpho-functional reaction of target cells. Results. Peptide fractions with mass of 1.0 — 3.0 kDa were isolated from enterococci metabolites, that inhibit the growth of indicator microorganisms. E. faecium strain exoproducts were shown to increase membrane permeability during interaction with L. monocytogenes, that results in subsequent detectable disturbance of normal cell morphology of listeria. Alterations of E. coli surface during the effect of purified peptide fraction was detected using AFM. Conclusion. The studies carried out have revealed the effect ofbacteriocins of enterococci on microorganisms with various types of cell wall composition and have confirmed the importance of bacterial barrier structure permeability disturbance in the mechanism of antimicrobial effect of enterocins.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 22—26
Key words: enterococci, antimicrobial peptides, bacteriocins, enterocins
ВВЕДЕНИЕ
Антимикробные пептиды энтерококков — бактериоцины — являются важной группой защитных факторов, с помощью которых бактерии данного рода обеспечивают колонизационную резистентность биотопов пищеварительного тракта [1]. Несмотря на интенсивное изучение этих пептидов, продуцируемых разными штаммами бактерий, механизмы их биологической активности требуют расшифровки.
Одним из направлений таких исследований является оценка морфо-функциональных изменений клеток микроорганизмов под действием различных биофакторов, которые можно обнаружить с помощью современных аналитических методов.
В этой связи, целью настоящей работы явилось определение влияния очищенных метаболитов энтерококков на некоторые параметры грамположительных и грамотрицатель-ных микроорганизмов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований послужили бактериоциногенные штаммы Enterococcus faecium 7 и S из коллекции лаборатории дисбиозов ИКВС УрО РАН. Антимикробные пептиды энтерококков получали при культивировании последних в бульоне Schaedler (Becton Dickinson, USA) в колбах на 250 мл с объемом среды 50 мл при температуре 37°С. Клетки из среды удаляли центрифугированием (10 000 g, 10°С, 20 мин) на центрифуге Mikro 22R (Hettich, Germany), отбирали надосадочную жидкость и пропускали ее через фильтр Millipore (USA) c диаметром пор 0,22 мкм.
Культуральную жидкость обессоливали методом ОФ-ВЭЖХ на колонке с фазой С8. Пептидную фракцию элюировали с колонки 60% растворителем Б (60% водный раствор ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте). Собранную фракцию упаривали досуха в вакуумном концентраторе (Speedvac, USA) и лиофилизировали. Полученный при осаждении осадок перерастворяли в стерильной дистиллированной воде и проверяли на наличие антимикробной активности методом диффузии в агар, нанося аликвоты (5 мкл) каждой собранной фракции на плотную питательную среду Schaedler, смешанной с клетками индикаторной культуры Listeria monocytogenes SS-BK в количестве 106 КОЕ/ мл.
При наличии антимикробной активности осадок перерастворяли в 10 мМ трис-HCl для дальнейшего разделения катионообменной хроматографией.
Катионообменную хроматографию проводили с использованием колонки Heparin HiTrap-Sepharose HP (2,5 x 5 см) (Amersham Biosciences, England). Элюирование проводили в ступенчатом градиенте NaCl (0 — 0,5 M в 10 мМ трис-HCl) в течение 120 мин при скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование поглощения проводили при длине волны 214 нм. Элюированные фракции объединяли по поглощению, обессоливали, как описано выше, упаривали досуха в вакуумном концентраторе и тестировали на наличие антимикробной активности.
Чистоту полученных препаратов и ориентировочную молекулярную массу пептидов оценивали методом MALDI времяпролетной масс-спектрометрии (Bruker Daltonics, Germany). Масс-спектры обрабатывали с помощью программного обеспечения Bruker Data Analysis. Точность измерения масс находилась на уровне 0,015%.
Для флуоресцентной окраски использовали набор LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, USA).
Бактериальные клетки осаждали при 5000 g в течении 5 мин; полученный осадок ресу-спендировали в 1 мл дистиллированной воды, после чего доводили оптическую плотность взвеси клеток L. monocytogenes SS-BK до 0,1 (OD670) и E. œli K12 до 0,05 (OD670). Бактериальные клетки инкубировали в присутствии исследуемого препарата в течении 1 ч, после чего микроорганизмы окрашивали набором красителей. Измерение спектров флуоресценции (возбуждение 4S0 нм, эмиссия 490 — 700 нм) проводили на спектрометре Солар СМ2203 (Беларусь).
Для атомно-силовой микроскопии выращенные клетки L. monocytogenes 88-BK и E. coli K 12 отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в дистиллированной воде, после чего к полученной суспензии добавляли исследуемый препарат. После инкубации в течение 1 ч клетки отмывали дистиллированной водой, в объеме 10 мкл наносили на свежий скол слюды и высушивали в течение 30 — 60 мин.
Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием атомно-силового микроскопа SMM-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия). В процессе сканирования использовали кантилеверы MSCT-AUNM («\feeco», США) с жесткостью балки 0,05 Н/м и радиусом порядка 10 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.
Расчет шероховатости поверхности бактерий проводили путем анализа АСМ-изображений клеточной поверхности фиксированной площади (500 х 500 нм).
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В процессе двухстадийной процедуры хроматографии из культуральной жидкости энтерококков были выделены пептидные фракции, обладающие антимикробными свойствами в отношении L. monocytogenes. Масс-спектрометрический анализ обессоленных тотальных пептидных экстрактов выявил набор компонентов с молекулярной массой в
пептидном диапазоне, определяющим отличием между ними было значение верхнего предела данных компонентов. Так, основное количество пиков на спектре препарата, полученного из штамма E. faecium 8, было в диапазоне 1,0 — 1,5 кДа, в то время как в препарате, полученного из штамма E. fae-cium 7, были детектированы отдельные пики до 3,0 кДа.
Анализ пептидных профилей с помощью тандемной MALDI MS выявил наличие ряда сходных компонентов (фрагментов) с массой 1,0 — 1,3 кДа, на основании чего можно сделать предположение как о частичном перекрытии спектра соединений, секре-тируемых в культуральную среду разными штаммами, так и о том, что часть из них может быть фрагментами более высокомолекулярных веществ (белков или пептидов).
Следующим этапом исследований стала оценка биологических эффектов выделенных пептидных экстрактов в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Для этого с помощью флуоресцентных красителей было определено мембраноповреждающее действие исследуемых препаратов.
По окончании инкубации популяция листерий в контрольной группе была представлена преимущественно жизнеспособными клетками (рис. 1 а), о чем свидетельствовало наличие доминирующего пика в области 525 — 550 нм, соответствующей интенсивной флуоресценции SYTO 9. Похожие результаты были зафиксированны и в случае популяции эшерихий (рис. 1 б). Внесение в реакционную смесь очищен-
Рис. 1. Спектры флуоресценции окрашенной флуоресцентными красителями бактериальной популяции L. monocytogenes 88-BK (а) и E.coli К12 (б) контрольной группы (1) и обработанной препаратами очищенных пептидных экстрактов метаболитов энтерококков (2). Ось ординат — интенсивность флуоресценции (отн.ед.); ось абсцисс — длина волны (X, нм).
Рис. 2. АСМ-изображения интактных клеток L. monocytogenes 88-BK (А) и E.coli К12 (В), обработанных очищенными пептидными экстрактами E. faecium (Б и Г, соответственно).
Шкала — 1 мкм (А, Б, В); 0,5 мкм (Г).
ного пептидного экстракта метаболитов энтерококков вело к нарушению проницаемости клеточных структур и утрате жизнеспособности листерий, что фиксировалось как увеличение интенсивности флуоресценции в красной области спектра (рис. 1 а). В то же время, аналогичное опытное воздействие на популяцию кишечной палочки не приводило к значимым изменениям проницаемости клеточных барьерных структур для красителя пропидия йодида, как следует из данных спектроскопии (рис. 1 б).
На заключительном этапе работы с помощью метода атомно-силовой микроскопии выявили особенности морфофункциональной реакции грамположительных (L. monocyto-genes 88-BK) и грамотрицательных (Escherichia coli K12) микроорганизмов на воздействие очищенных пептидных экстрактов (ОПЭ) из надосадочной жидкости культур E. faecium.
Интактные клетки листерий имели относительно гладкий рельеф поверхности (рис. 2 А), среднеквадратичная шероховатость (отклонение точек профиля от его средней линии) которой составила 1,21±0,29 нм. Рельеф клеточной поверхности эшерихий оказался более развитым (рис. 2 В) со среднеквадратичной шероховатостью 2,35±0,45 нм.
В опытной серии обработка листерий ОПЭ штамма E. faecium 7 привела к тому, что большая часть визуализированных объектов представлена клетками с выраженными признаками деструкции клеточной стенки (рис. 2 Б). Детальное исследование ультраструктуры поверхности выявило частичное разрушение клеточной стенки листерий. Среднеквадратичная шероховатость поверхности составила 4,00±0,70 нм, что значимо больше стандартных значений (P<0,05).
Морфофункциональная реакция грамотрицательных бактерий E. coli при обработке ОПЭ энтерококков сопровождалась фрагментированием наружной мембраны (рис. 2 Г). Шероховатость поверхности подобных объектов увеличилась с 2,35±0,45нм до 7,59±0,65 нм (Р<0,05).
ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее с помощью атомно-силовой микроскопии было охарактеризовано воздействие культуральной жидкости E. faecium на бактериальную популяцию L. monocytogenes [2]. Полученные при этом результаты морфофункциональной реакции бактерий оказались характерным ответом на воздействие антимикробных пептидов [4]. Продолжение работ в этом направлении было связано с исследованием особенностей биологической активности пептидной фракции, выделенной из культуральной жидкости энтерококков.
В результате проведенных исследований из метаболитов E. faecium были выделены антимикробные вещества пептидной природы с молекулярной массой 1,0 — 3,0 кДа. Результатом опытного воздействия пептидов явилось нарушение целостности барьерных структур микробных клеток, что было продемонстрировано посредством флуоресцентной спектроскопии в отношении листерий. Полученные данные согласуются с имеющимися сведениями о механизме бактерицидного действия энтероцинов, направленного на ци-топлазматическую мембрану клеток-мишеней с формированием в ней пор, что, в свою очередь, ведет к выходу внутриклеточного калия, аминокислот и других низкомолекулярных веществ [3]. Атомно-силовая микроскопия позволила обнаружить изменения кле-
точной морфологии как листерий, так и эшерихий, заключающиеся в увеличении показателя шероховатости клеточной стенки и наружной мембраны.
Проведенные исследования выявили влияние бактериоцинов энтерококков на микроорганизмы с различным типом строения клеточной стенки и подтвердили важность нарушения проницаемости бактериальных барьерных структур в механизме антимикробного действия энтероцинов.
Авторы выражают благодарность директору Центра коллективного пользования приборным оборудованием «Институт микро- и нанотехнологий» Оренбургского государственного университета Пашкевичу С.Н. за возможность проведения части экспериментальных работ с использованием приборного парка ЦКПИМНТ ОГУ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Валышев А.В. Антимикробные соединения энтерококков. Журн. микробиол. 2014, 5: 119-126.
2. Валышев А.В., Васильченко А.С. Морфологические изменения клеток листерий под действием метаболитов энтерококков кишечной микрофлоры человека. Журн. микробиол. 2014, 6: 7881.
3. Chikindas M.L., Garcia-Garcera M.J., Driessen A.J. et al. Pediocin PA-1, a bacteriocin from Pediococcus acidilactici PAC1.0, forms hydrophilic pores in the cytoplasmic membrane of target cells. Appl. Environ. Microbiol. 1993, 59 (11): 3577-3584.
4. Vasilchenko A.S., Nikiyan H.N., Deryabin D.G. Atomic force microscopy study of magainin 2 versus human platelet extract action on Escherichia coli and Bacillus cereus. J. Biol. Res.-Thessalon. 2013, 19: 3-9.
Контактная информация: Валышев А.В.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-86-97
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Т.Х.Тимохина1, О.В.Бухарин2, М.В.Николенко1, Я.И.Паромова1, Н.Б.Перунова2
РЕГУЛИРУЮЩЕЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ АССОЦИАТИВНОЙ МИКРОБИОТЫ НА РИТМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ
1Тюменская государственная медицинская академия; 2Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Изучение влияния экзометаболитов ассоциативной микробиоты на суточную динамику функциональных показателей, отражающих патогенные и персистентные свойства грибов и бактерий. Материалы и методы. Для исследования пролиферативной, адгезивной, каталазной, протеазной, фосфолипазной, гемолитической, антилизоцимной, биопленкообразующей активности были взяты клинические изоляты Candida albicans, выделенные из кишечника здоровых и больных кандидозом людей, а также клинические изоляты и музейные штаммы АТСС Staphylococcus aureus 25923, Escherichia coli 35218 и Pseudomonas aeruginosa 27853. Результаты статистически обработаны. Результаты. Выявлено, что изоляты C. albicans, выделенные от здоровых людей, индифферентны к действию бактериальных метаболитов. Хроноинфраструктура биологических свойств грибов изменялась под влиянием метаболитов микробиоты. К воздействию бактериально-грибковых метаболитов госпитальные изоляты S. aureus, E. coli и P. aeruginosa проявляли относительную стабильность физиологических свойств, в отличие от музейных штаммов. Заключение. Выявленные изменения хроноинфраструктуры биологических ритмов микроорганизмов бактериально-грибковыми метаболитами ассоциантов отражают напряженность биологической системы, которая неизбежна в процессе формирования межмикробных взаимоотношений.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 26—30
Ключевые слова: Candida 8lbicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, экзометаболиты, биологические ритмы
