CC BY
12© А.В.ВАЛЫШЕВ, А.С.ВАСИЛЬЧЕНКО, 2014
А.В.Валышев, А.С.Васильченко
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОК ЛИСТЕРИЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ МЕТАБОЛИТОВ ЭНТЕРОКОККОВ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЧЕЛОВЕКА
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Характеристика морфологических изменений клеток листерий под действием метаболитов энтерококков кишечной микрофлоры человека. Материалы и методы. Культуру бактериальных клеток Listeria monocytogenes 88-BK выращивали в присутствии продуктов жизнедеятельности энтерококков (опыт) и в их отсутствии (контроль). Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SMM-2000. Результаты. Характер морфофункциональной реакции бактериальных клеток индикаторной культуры позволяет предположить наличие катионных антимикробных пептидов с мембранолитическим механизмом действия у 30% исследованных штаммов энтерококков. Заключение. Использование атомно-силовой микроскопии позволяет детализировать механизмы антимикробной активности бактериоцинов микроорганизмов кишечной микрофлоры на бактерии-мишени в условиях близких к нативным.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 78—81
Ключевые слова: энтерококки, листерии, бактериоцины, катионные антимикробные пептиды, атомная силовая микроскопия
A.V.Valyshev, A.S.Vasilchenko
MORPHOLOGIC CHANGES IN LISTERIA CELLS UNDER THE EFFECT OF METABOLITES OF HUMAN INTESTINAL MICROFLORA ENTEROCOCCI
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Characterization of morphologic changes in listeria cells under the effect of metabolites ofhuman intestine microflora enterococci. Materials and methods. Culture of Listeria monocytogenes 88-BK cells was cultivated in the presence of enterococci waste products (experiment) or without them (control). The samples obtained were studied by atomic-force microscopy (AFM) in contact mode using scanning probe microscope SMM-2000. Results. The character of morpho-function-al reaction of indicator culture bacterial cells allows to assume the presence of cationic anti-mi-crobial peptides with membrane-lytic mechanism of action in 30% of the studied enterococci strains. Conclusion. The use of atomic-force microscopy allows to detail the mechanisms of antimicrobial activity of bacteriocins of intestine microflora microorganisms against target bacteria under close to native conditions.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 78—81
Key words: enterococci, listeria, bacteriocins, cationic anti-microbial peptides, atomic force microscopy
Антимикробные пептиды (АМП) в эволюционном смысле являются древней системой защиты хозяина от разных патогенов. Известно, что продуцентами АМП являются организмы, относящиеся к различным таксономическим группам [10]. Способность синтезировать АМП симбиотическими бактериями обеспечивает им определенное преимущество перед другими видами микроорганизмов при колонизации организма хозяина [4].
Бактерии рода Enterococcus являются продуцентами различных факторов, определяющих их антагонизм, среди которых наиболее значимыми являются антими-
кробные пептиды — бактериоцины, обладающие весьма широким спектром действия
[5].
Бактерицидное действие данных веществ может быть направлено на самые различные клеточные мишени, однако первоначальное взаимодействие АМП происходит с барьерными структурами клеток [1], при этом многие катионные антимикробные белки обладают пороформирующим действием [9]. Использование атомно-си-ловой, конфокальной и электронной трансмиссионной микроскопии позволяет выделить преимущественные мишени биологического действия и оценить характерные особенности действия исследуемых АМП [7].
Целью данной работы стало исследование морфофункционального ответа бактериальных клеток на воздействие антимикробных пептидов одного из представителей индигенной микрофлоры кишечника человека — бактерий рода Enterococcus.
В работе использовали 10 бактериоциногенных штаммов энтерококков, выделенных из фекальной микрофлоры человека [3]. Культуральную жидкость получали после посева культур микроорганизмов в бульон Schaedler (Hi-Media, Индия) и инкубации в течение 24 ч при 37°С. Клетки бактерий осаждали центрифугированием (7000 об/мин, 20 мин, 4°С), надосадочную жидкость фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Jet Biofil).
Для исследования морфофункциональных реакций микроорганизмов на воздействие метаболитов энтерококков в субингибиторных концентрациях (субМИК) использовали индикаторную культуру Listeria monocytogenes 88-BK. Для определения субМИК использовали методику последовательных двукратных разведений культу-ральной жидкости, содержащей метаболиты энтерококков, с последующей ее инокуляцией суспензией L. monocytogenes 88-BK.
Исходную культуру L. monocytogenes 88-BK, выращенную в течение 24 ч при 37°С, суспендировали в питательном бульоне, значение оптической плотности ~0,1 ед (640 нм), полученную суспензию в объеме 100 мкл добавляли в 2,5 мл бульона, содержащего различные разведения метаболитов энтерококков, и инкубировали в течение 24 ч, после чего оценивали рост визуально. Контролем служила культура клеток, выращенных в питательной среде, не содержащей исследуемые метаболиты энтерококков. Выращенные в присутствии метаболитов (опыт) и в их отсутствии (контроль) микроорганизмы L. monocytogenes 88-BK отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в дистиллированной воде, после чего в объеме 10 мкл наносили на свежий скол слюды и высушивали в течение 24 ч. Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием мульти-микроскопа SMM-2000 (ЗАО «Протон-Миэт», Россия). В процессе сканирования использовали кантилеверы MSCT-AUNM (Veeco, США) с жесткостью балки 0,05 Н/м и радиусом порядка 10 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.
Проведенная на АСМ визуализация L. monocytogenes 88-BK показала, что популяция листерий контрольной группы была представлена однородными по морфологии палочковидными клетками, расположенными преимущественно в цепочках со средними значениями длины 1,28±0,28, ширины 0,52±0,71, высоты 0,41±0,02 мкм, объема 0,23+0,01 мкм3 и Rq 1,21+0,29 нм.
Культивирование бактерий в присутствии метаболитов энтерококков в субинги-биторных концентрациях привело к различным результатам. Большинство (70%) исследованных штаммов в описанных выше условиях эксперимента существенно не изменяли морфологию листерий. Треть изученных изолятов оказывала влияние на размерные параметры тест-культуры, хотя у различных штаммов отмечен разный характер действия метаболитов.
В присутствии метаболитов E. faecium E657 в субингибиторных концентрациях большая часть листерий в популяции сохраняла морфологию, свойственную интакт-ным клеткам контрольной группы. В то же, время некоторая часть визуализированных
объектов была представлена клетками с выраженными морфологическими изменениями. Исследование ультраструктуры поверхности листерий выявило частичное разрушение пептидогликанового слоя клеточной стенки бактерий. Качественные изменения бактериальной поверхности, выраженные количественно среднеквадратичной шероховатостью (Rq), констатировали существенное изменение данного параметра (3,51+0,64; p<0,05). Схожие результаты были получены и в случае воздействия на популяцию листерий метаболитов штамма E. faecium E547.
Несколько отличные результаты были получены при изучении морфофункцио-нальной реакции клеток листерий на воздействие метаболитов другого штамма энтерококков (E. faecium E10). Так, большая часть клеток в популяции оказалась полностью или частично разрушенной. Вокруг островковых ассоциантов клеток листерий визуализировался гранулированный материал, являющийся, предположительно, фрагментами лизированных клеток.
Морфологическое изучение отдельных бактериальных клеток выявило существенно меньшие значения высоты и объема клеток после опытного воздействия (0,15+0,04 мкм и 0,13+0,03 мкм3 соответственно; p<0,05). На поверхности клеток наблюдали признаки разрушения клеточной стенки (фрагментация и провалы поверхности клеток), шероховатость поверхности подобных объектов увеличилась с 1,2+0,3 до 4,0+0,7 нм. Явление микробного антагонизма определяется синтезом различных по химической природе и механизму действия биологически активных молекул, среди которых в последнее время наибольший интерес представляют антибиотики и антимикробные пептиды. У микроорганизмов рода Enterococcus часто выявляется способность к подавлению патогенной микрофлоры, что используется при создании пробиотических препаратов [11].
Ранее было показано, что среди энтерококков широко распространен внутри- и межродовой антагонизм, причем наиболее активные штаммы относятся к менее патогенному виду E. faecium [2]. Данное обстоятельство определило дальнейшую работу, направленную на поиск и выделение непатогенных антагонистически активных штаммов, продуцирующих антимикробные пептиды. Для этого было предложено использовать метод атомно-силовой микроскопии, к числу основных достоинств которого относится возможность за короткий промежуток времени получить представление о веществе, бактерицидное действие которого направлено на нарушение проницаемости барьерных структур микробных клеток [6].
Полученные результаты показали, что среди 10 исследованных штаммов E. faecium метаболиты 3 штаммов оказывают мембраноповреждающее действие на бактериальные клетки индикаторной культуры L. monocytogenes. Разрушение клеточной стенки грамположительных микроорганизмов и выход внутриклеточного содержимого является следствием действия различных антибиотиков, однако в случае с E. faecium подобный результат является характерным механизмом действия энтероцинов [4], в частности класса IIa [8].
Характер повреждений грамположительных клеток листерий позволяет предположить, что одним из факторов антагонизма исследованных штаммов энтерококков является синтез антимикробных катионных пептидов. При этом анализ качественных и количественных изменений клеток листерий свидетельствует об определенных штаммовых особенностях в оказываемом воздействии, которое, с одной стороны, может определяться различным уровнем продукции АМП, а с другой стороны, синтезом разных по молекулярному строению бактериоцинов.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования атомно-силовой микроскопии не только для исследования механизма действия определенных факторов и веществ на бактериальные клетки, но и в качестве своеобразного инструмента скрининга штаммов-продуцентов антимикробных пептидов для последующего выделения гомогенных фракций АМП биохимическими методами.
Работа выполнена при поддержке РФФИ, проект № 13-04-97048.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреева-Ковалевская Ж.И., Солонин А.С., Синева Е.В., Терновский В.И. Пороформирующие белки и адаптация организмов к условиям окружающей среды. Усп. биол. хим. 2008, 48: 267-318.
2. Валышев А.В., Герцен Н.В. Факторы патогенности энтерококков кишечной микрофлоры человека. Журн. микробиол. 2012, 4: 41-44.
3. Валышев А.В., Герцен Н.В. Бактериоциногения энтерококков кишечной микрофлоры человека. Журн. микробиол. 2013, 5: 104-107.
4. Ермоленко Е.И. Бактериоцины энтерококков: проблемы и перспективы использования (обзор литературы). Вестн. Санкт-Петербургского унив. 2009, 11 (3): 78-93.
5. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3 (3): 238-250.
6. Fantner G.E., Barbero R.J., Gray D.S., Belcher A.M. Kinetics of antimicrobial peptide activity measured on individual bacterial cells using high-speed atomic force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2010, 5 (4): 280-285.
7. Hartmann M., Berditsch M., Hawecker J. et al. Damage of the bacterial cell envelope by antimicrobial peptides gramicidin S and PGLa as revealed by transmission and scanning electron microscopy. Antimicrob. Agents Chemother. 2010, 54 (8): 3132-3142.
8. Knoetze H., Todorov S.D., Dicks L.M. A class Ila peptide from Enterococcus mundtii inhibits bacteria associated with otitis media. Int. J. Antimicrob. Agents. 2008, 31 (3): 228-234.
9. Park C.B., Yi K.S., Matsuzaki K. et al. Structure-activity analysis ofbuforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: the proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97 (15): 8245-8250.
10. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol. Rev. 2003, 55 (1): 27-55.
11. Yermolenko E., Chernish A., Aleshina G. et al. Antagonistic activity of Enterococcus faecium L3 against different groups of pathogenic streptococci. In: Streptococci New Insights Into an Old Enemy, 2006.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Валышев Александр Владимирович, к.м.н.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-86-97
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
М.А.Ким, Э.Н.Симованьян, Э.Л.Алутина, Г.Г.Харсеева
АПОПТОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРОБОВ-АССОЦИАНТОВ ПРИ ЭПШТЕЙНА-БАРР ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону
Цель. Изучение апоптогенной активности микробов-ассоциантов при Эпштейна-Барр вирусной инфекции (ЭБВИ) на модели перитонеальных макрофагов мышей in vitro. Материалы и методы. Оценку апоптоза, индуцированного бактериями, выделенными от больных ЭБВИ, осуществляли по характерным морфологическим изменениям макрофагов в мазках, окрашенных по Май-Грюнвальду с докрашиванием по Романовскому-Гимзе. Результаты. Установлено, что апоптогенной активностью обладали все микробы-ассоцианты ЭБВИ, однако самый высокий патогенный потенциал был отмечен у Streptococcus pyogenes. Заключение. Наличие апоптогенной активности бактериальной микрофлоры, сопутствующей ЭБВИ, в отношении клеток иммунной системы может служить способом их выживания и явиться патогенетической основой для длительной персистенции в организме.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 81—85
6. ЖМЭИ 6 № 34
81
