CC BY
158
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 615
Е. И. Ермоленко1, А. Ю. Черныш2, М. Н. Берлов1, А. А. Тотолян2, А. Н. Суворов1
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭНТЕРОКОККОВ В ОТНОШЕНИИ STREPTOCOCCUS PYOGENES
1Санкт-Петербургский государственный университет, Медицинский факультет 2Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург
Стрептококки группы А (СГА) являются возбудителями ревматизма, скарлатины, рожистого воспаления, стрептодермии, некротического фасциита, менингита, сепсиса и многих других тяжелых гнойно-воспалительных заболеваний. В настоящее время СГА сохраняют чувствительность к пенициллинам, однако их использование, а при необходимости, замена на другие антибиотики, не всегда оказывается эффективной и безвредной [1, 2]. В поисках дополнительных, в ряде случаев — альтернативных методов лечения и профилактики СГА-инфекций особую актуальность приобретает изучение чувствительности стрептококков к действию пробиотиков, в состав которых чаще всего входят живые молочнокислые бактерии. К числу таких микроорганизмов можно отнести непатогенные бактерии рода Enterococcus. Выявлена способность энтерококков ингибировать рост листерий, стафилококков, лактобацилл, клостридий, энтеробактерий и псевдомонад in vitro [3, 4]. Вместе с тем данные литературы об антагонистической активности молочнокислых бактерий к стрептококкам представляют собой единичные разрозненные сообщения [5, 6]. Ранее нами было показано, что пробиотическая культура Enterococcus faecium L3 обладает неодинаковой способностью ингибировать рост стрептококков, принадлежащих к различным группам [7]. В наибольшей степени энтерококки проявляли антагонистическую активность в отношении СГА.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния пробиотических энтерококков и их метаболитов на рост различных штаммов S. pyogenes в системе in vitro.
Материалы и методы исследования. Индикаторные культуры. В качестве индикаторных культур использовали 10 штаммов S. pyogenes из коллекции отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН: штаммы серотипов М15 (AS2, AS3, AS4, AS8, AS12, AS13, AS25), М49 (AS21) и M12 (AS3), выделенные от больных с острым гломерулонефритом и скарлатиной, а также референс штамм 16/49 серотипа М4, полученный из Чешской национальной коллекции типовых культур. Штаммы стрептококков обозначены номерами от 1 до 10 соответственно. Все штаммы СГА выращивали в аэробных условиях при температуре 37 °С в бульоне Todd-Hewitt (THB, «Difco», США) или на колумбийском агаре («Himedia», Индия). К плотной питательной среде добавляли (до 10 %) предварительно
© Е. И. Ермоленко, А. Ю. Черныш, М. Н. Берлов и др., 2008
прогретую в течение 40 мин при 56 °С нормальную лошадиную сыворотку (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток, Россия). В качестве контрольных индикаторных культур использовали штаммы Listeria monocytogenes EGD и E. coli ML-35p. Все индикаторные бактерии выращивали до логарифмической фазы роста и наносили на поверхность плотной питательной среды по 10 мкл культуры, содержащей 5,5-10 6 КОЕ/мл, в жидкую питательную среду добавляли бактерии в той же концентрации с посевной дозой 2 % от объема.
Культура антагониста и его супернатант. В работе исследовали антагонистическую активность пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 («Ламинолакт», ООО «Авена», Россия), не продуцирующего перекись водорода, содержащий в геноме гены entA, entB, eniB, entI, entK, которые обеспечивают продукцию энтероцинов А и B [3, 7]. Энтерококки выращивали на среде BHI (Brain heart infusion, «Difco», США) до ранней стационарной фазы роста в аэробных условиях при температуре 37 °С.
Культуры бактерий хранили при -70 °С в жидких питательных средах, в которых они культивировались, с добавлением глицерина до 10 %.
Супернатант культуры E. faecium L3, выращенной в 2 л бульона BHI при 37 °С 6-8 ч до достижения оптической плотности 0,4 (OD 640), получали путем ее центрифугирования (3000 g 30 мин).
Получение пептидного экстракта культуры E. faecium L3. Для приготовления пептидного экстракта супернатант прогревали 15 мин при 100 °С, высаливали белковый компонент сульфатом аммония (до 70 %) при температуре +4 °С. После центрифугирования (3000 g 30 мин) к осадку добавляли 6 мл дистиллированной воды, затем осуществляли диализ против того же растворителя. В работе использовали диализные мембраны Spectra/Por MWCO 1000 (США). Содержимое диализного мешка фильтровали через мембрану Amicon PM (10 000 MW, США).
Выделение, очистка и анализ пептидных фракций E. faecium L3. Фильтрат, содержащий пептиды менее 10 ^а, концентрировали при помощи установки для лиофильной сушки (Speed Vac Concentretor CS 18, Savаnt Instruments Harvegetul 1993, США). Затем пробу фракционировали с использованием препаративного электрофореза на аппарате 491 Prep Cell (BioRad, США) в 12,5 %-ном полиакриламидном геле, содержащем 31 %-ную мочевину, в 5 %-ной уксусной кислоте. Собранные фракции высушивали по 50 мкл на приборе для вакуумной сушки. Анализ белковых фракций осуществляли при помощи SDS электрофореза [8], а также электрофореза в присутствии мочевины и уксусной кислоты [9] в 16 и 12,5 %-ном полиакриламидном геле, соответственно.
Концентрацию пептидов определяли по методу Лоури [10].
Исследование антибактериальной активности энтерококков. Антагонистическую активность культуры энтерококков и полученного из нее супернатанта по отношению к СГА исследовали методом двухслойного агара [11].
Антагонистическую активность cупернатанта и пептидного экстракта E. faecium L3 исследовали также, наблюдая за изменениями оптической плотности ( ОD 620) культур
S. pyogenes и листерий при их росте в бульоне THB с добавлением супернатанта или пептидного экстракта антагониста в различных разведениях (в 3, 9 и 27 раз) в 96-луночном плоскодонном микропланшете («Медполимер», Россия). Супернатант и экстракт стерилизовали методом фильтрации через Filtropor 0,45 цт («Sarstedt», Германия) перед добавлением в питательную среду, содержащую индикаторные бактерии.
Антагонистическую активность пептидных фракций определяли методом радиальной диффузии в агарозном геле, используя в качестве индикаторной культуры эше-рихии [12].
В статистическом анализе результатов использовали программы «Microsoft®Office Exel 97. Кроме того, статистическую обработку материала проводили по методу Стьюдента-Фишера.
Результаты исследования. Антагонистическая активность живой культуры энтерококков. В результате исследования антибактериальной активности культуры E. fae-cium L3 методом двухслойного агара были определены минимальные ингибирующие количества антагонистов (МИКА), препятствующие росту каждого из 10 штаммов S. pyogenes. Как показано на рис. 1, энтерококки проявляли неодинаковую способность ингибировать рост отдельных штаммов СГА. МИКА колебались в пределах от 0,12 до 2,2 lg КОЕ / мл. Были обнаружены штаммы, проявляющие высокую чувствительность (ЛБ1и AS2) и резистентные (AS3, AS6, AS7) к действию факторов, выделяющихся энтерококками. Значения показателей МИКА для чувствительных штаммов составляли 0,12 lg КОЕ /мл. Эти величины для устойчивых штаммов были значительно больше (р < 0,05), колебались в пределах 1-2,2 lg КОЕ /мл. В то же время средние арифметические значения показателей МИКА (1,2±0,34 lg КОЕ /мл) при исследовании антагонистической активности энтерококков к 10 штаммам СГА были больше, чем МИКА для листерий (0,48±0,12 lg КОЕ /мл, p < 0,01). Следует отметить, что один из самых чувствительных штаммов S. pyogenes (AS1) оказался восприимчивее, чем листерии, к действию антагониста (р < 0,005).
2,5
2,0
ц
_S
W
§
<
и
S
1,5
1,0
0,5
S.p. 1 S.p. 2 S.p. 3 S.p. 4 S.p. 5 S.p. 6 S.p. 7 S.p. 8 S.p. 9 S.p. 10 L.m.
Рис. 1. Антагонистическая активность E. faecium L3 по отношению к различным штаммам СГА и листериям
0
Антагонистическая активность супернатантов и экстрактов энтерококков.
Антибактериальная активность супернатанта культуры E. faecium Ь3 при исследовании методом двухслойного агара была выявлена только для чувствительного штамма ЛБ1 (данные не показаны). В то же время при наблюдении за ростом СГА в присутствии супернатанта энтерококков в жидкой питательной среде выявлен ингибирующий эффект в отношении всех индикаторных культур. На рис. 2 представлены данные, полученные при культивировании СГА в ТНВ (приведены средние арифметические значения) и листерий в присутствии супернатанта энтерококков, разбавленного в питательной среде в 3 раза.
Время инкубации, ч - •- StrA-K —▲--------L.m.-K - О StrA-L3 --------Д---L.m.-L3
Рис. 2. Влияние супернатанта E.faecium L3 на рост СГА (N=10) и листерий StrA-L3 и StrA-K — показатели роста (OD) СГА в THB, в присутствии и без добавления супернатанта культуры энтерококков, соответственно. Приведены средние значения, рассчитанные для 10 штаммов S. pyogenes. L.m.-L3 и L.m.-K показатели роста (OD) L. monocytogenes в THB, в присутствии и без добавления супернатанта культуры
энтерококков, соответственно.
Показано, что под влиянием E.faecium L3 рост культур, как листерий, так и стрептококков, существенно замедляется. Показатели оптической плотности (OD 620) начинают незначительно увеличиваться только после 2 ч инкубации (рис. 3, А). Позже, как видно на рис. 3, Б, в течение 8 ч оптическая плотность проб со стрептококками и листериями, растущими в присутствии супернатанта, практически не изменялась. В контрольных пробах этот показатель существенно увеличивался — от 0 до 0,3 и 0,25 соответственно. Аналогичные данные, однако, с менее выраженными отличиями при сравнении с контрольными пробами, были получены и при добавлении супернатанта в разведении 1:9 (не показано). В больших разведениях супернатанта рассматриваемый эффект статистически недостоверен.
При сопоставлении показателей оптической плотности различных культур СГА через 2 и 8 ч роста были выявлены штаммовые особенности. Обращало на себя внимание то, что устойчивые к действию энтерококков штаммы (по данным исследования методом двухслойного агара) оказались более резистентными и к влиянию супернатанта антагониста. Особенно ярко эта тенденция прослеживалась при сравнивании оптической плотности 8-часовых культур S. pyogenes. Следует отметить, что при более кратковременном воздействии (в течение 2 ч инкубации) в период фазы адаптации большинство штаммов СГА (за исключением AS2, AS3, AS6) продемонстрировали высокую чувствительность к действию метаболитов энтерококков. Важно, что нарастание оптической плотности у различных культур происходило по-разному не только в присутствии супернатанта E.faecium L3, но и в контрольных пробах, а также не во всех случаях коррелировало с уровнем чувствительности отдельных штаммов СГА к действию метаболитов антагониста.
Для изучения природы антибактериальной активности E. faecium L3 из супернатанта этой культуры был получен пептидный экстракт, содержащий низкомолекулярные (1-10 кДа) пептиды. При получении пептидного экстракта из супернатанта материал был сконцентрирован в 300 раз и после очистки содержал белковые соединения в количестве
0,05
0,04
о 0,03 4
О
о
0,02
0,01
5 6 7
Штаммы
й
□ Контр.
Суперн-т
10
11
□ Контр.
Суперн-т
Штаммы
Рис. 3. Оптическая плотность культур СГА (1-10) и листерии (11), культивирующихся в присутствии супернатанта Е./аваыт Ь3 и без него в течение 2 ч (А) и 8 ч (Б)
0,5 мг/мл. Пептидный экстракт (цельный и в разведениях до 9 раз), также как и супернатант этой культуры, обладал антагонистической активностью по отношению к стрептококкам и к листериям.
Антагонистическая активность пептидов, выделенных из супернатанта Е./ае-сшт Ь3. В дальнейшем было продолжено исследование метаболитов белковой природы, содержащихся в супернатанте культуры энтерококков. Путем препаративного электрофореза пептидного экстракта отобрано 80 фракций, в которых при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии мочевины (31 %) в 5 %-ной уксусной кислоте, как видно на рис. 4, удалось обнаружить пробы, содержащие пептиды, которые отличаются друг от друга по молекулярной массе и заряду.
Исследование при помощи БОБ электрофореза в полиакриламидном геле показало, что в отобранных пробах содержится несколько пептидных фракций с молекулярной массой 2-5,5 кДа (рис. 5).
0
1
2
3
4
8
9
Б
Рис. 4. Аналитический электрофорез (в присутствии уксусной кислоты и мочевины) проб, собранных в ходе препаративного электрофореза (пробы 21, 24, 27, 30, 33, 39, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64)
Рис. 5. Результаты SDS электрофореза в полиакриламидном геле проб, полученных при препаративном электрофорезе. Маркер молекулярного веса BIO RAD 161-0326 (6,625; 16,9505; 14,437; 6,512; 3,496; 1,423 кДа)
Как видно на рис. 6, методом радиальной диффузии в агарозе удалось выявить пептидные фракции (4, 9, 18, 21), обладающие способностью ингибировать рост индикаторной культуры (E. coli ML-35p).
Обсуждение результатов. В настоящей работе исследована способность энтерококков ингибировать рост СГА в жидкой и плотной питательных средах, выращивая индикаторные бактерии, в присутствии живых энтерококков, супернатанта этой культуры, а также выделенных из него низкомолекулярных пептидов.
Несмотря на то что во всех экспериментах не происходило непосредственного контакта между индикаторными бактериями и антагонистом, живые энтерококки оказывали более сильное воздействие. Возможно, это связано с конкуренцией за метаболиты, а также с уже описанной ранее стимуляцией выработки молочнокислыми бактериями антимикробных факторов в присутствии чувствительных к их действию культур [13]. Кроме того, в случае с живой культурой постоянно происходило накопление молочной
кислоты и других метаболитов, в то же время в супернатанте антимикробные субстанции могли лишь разрушаться.
Антибактериальная активность супернатанта пробиотической культуры L3, а также пептидного экстракта и его отдельных фракций проявлялась при использовании более чувствительных методов, при культивировании индикаторных культур в питательном бульоне. Пептидный экстракт, так же как и супернатант использованной культуры антагониста, ингибировал рост культур СГА и листерий в питательном бульоне. Следовательно, ведущее значение в проявлении антимикробной активности данного пробиотического штамма имела его способность продуцировать биологически активные пептиды. Ранее были выявлены
Рис. 6. Зоны подавления роста эшерихий пептидными фракциями, полученными из супернатанта E. faecium L3
бактериоциногенные свойства E. faecium L3, наличие в его геноме генов, обеспечивающих продукцию энтероцинов А и В, наиболее распространенных и хорошо изученных бакгериоцинов энтерококков [3, 6]. Нельзя исключить, что антагонистическая активность L3 в отношении СГА связана с термостабильными низкомолекулярными (с молекулярной массой 4,5 и 5,6 кДа соответственно) энтероцинами А и В, обладающими ярко выраженным антилистериозным эффектом. Известно также, что эти бактериоцины могут продуцироваться Enterococcus spp. одновременно и выступать в качестве синергистов, один из которых деполяризует цитоплазматическую мембрану бактерий, другой стимулирует порообразование [14]. Наличие в пептидном экстракте нескольких пептидных фракций с молекулярной массой от 2 до 2,5 кДа, обладающих антибактериальной активностью, позволяет предположить способность E. faecium продуцировать другие бактериоцины и бактериоциноподобные факторы.
В настоящей работе установлены статистически достоверные различия в чувствительности отдельных штаммов СГА к продуктам метаболизма энтерококков. Следует отметить, что чувствительность штаммов стрептококков к метаболитам пробиотического штамма не была связана с особенностями размножения индикаторных культур и их посевной дозой. Условия проведения экспериментов предполагали засев индикаторных культур в одинаковых количествах и фазе роста. Кроме того, при сопоставлении данных, полученных в ходе наблюдения за оптической плотностью, не выявлено корреляции между продолжительностью фазы адаптации, скоростью роста стрептококков и их чувствительностью к действию антагониста. Нельзя исключить, что выявленные штаммовые особенности СГА стрептококков, так же как различия в чувствительности листерий, клостридий, пропионибактерий, энтерококков, оральных стрептококков к действию молочнокислых бактерий, описанные другими авторами [4-6, 15], обусловлены прежде всего наличием специфических рецепторов, белков, необходимых для связывания с бактериоцинами и их транспортировки внутрь бактерий [4, 5].
Полученные результаты расширяют наши представления о проявлении антибактериальной активности энтерококков и продуктов их метаболизма в системе in vitro. Исследование ингибирующего влияния пептидных экстрактов культуры E. faecium L3 на рост СГ A дополняет уже имеющиеся сведения о спектре действия энтероцинов A и B и новых бактериоциноподобных факторов (2-2,5 кДа), свидетельствует об индивидуальной чувствительности СГА к пробиотикам и о необходимости подбора пробиотических средств для профилактики и терапии заболеваний, вызываемых S. pyogenes. Стрептококки группы А могут рассматриваться в качестве одних из самых чувствительных вариантов индикаторных бактерий для изучения активности энтероцинов.
Summary
Ermolenko E. I., Chernysh A. Yu., Berlov M. N., Totolyan A. A., Suvorov A. N. Antagonistic activity of enterococci against Streptococcus pyogenes.
The article contains the results of studying the influence of metabolites of Enterococcus faecium L3 probiotic culture on the growth of 10 strains of A streptococci (GAS) group in the liquid and solid medium. It was shown that live strain of streptococcus had maximal antagonistic activity. Low-molecular peptides were found in peptide extract made from L3 supernatants. Sensitive and resistant GAS strains were displayed.
Key words: enterococci, bacteriocin, Streptococcus pyogenes.
Литература
1. Fischetti R, NovickR. P., Ferrettti J. J. Gram-positive pathogens // ASM Press. 2002. P. 736.
2. Кондракова О. А., ЕщинаА. С., ДмитриеваН. Ф. и др. Чувствительность бета-гемолитических стрептококков к антибиотикам и альтернативным препаратам // Антибиот. и химиотер. 1998. Т 43. № 7. С. 26-30.
3. Суворов А. Н., Грабовская К. Б., Воробьева Е. И., Алехина Г. Г. Пробиотики или патогены?: Критерии выбора и оценка клинического штамма // Гастроэнтерол. 2002. Т. 4. С. 36-38.
4. MorenoM. R. F., CallewaeriR., DevreesedB. et al. Isolation and biochemical characterization of en-terocins produced by enterococci from different sources // J. Appl. Microbiol. 2003. Vol. 94. P. 214-220.
5. Chen H., Hoover D. G. Bacteriocins and their food applications // Compichens. reviews in food science and food safety. 2003. Vol. 2. P. 82-100.
6. Vuist L., Neysens P. The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions // Trends in food Science technology. 2005. Vol. 16. Issue 1-3. P. 43- 56.
7. Yermolenko E., Chernish A., Aleshina G. et al. Antagonistic activity of Enterococcus faecium L3 against different groups of pathogenic streptococci. Streptococci // New Insights Into and Old Enemy. 2006. May. P. 363-366.
8. HarwigS., Chen N., Park A., LehrerR. Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leucocytes by continuosus acid-urea-polyacrilamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol. 208. P. 382-386.
9. ShaggerH., von Jagow G. Tricine dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Ibid. 1987. Vol. 166. P. 368-379.
10. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.
11. Ермоленко Е. И., Исаков В. А., Ждан-Пушкина С. Х., Тец В. В. Количественная характеристика антагонистической активности лактобацилл // Журн. микробиол. 2004. № 5. С. 94-98.
12. Lehrer R. I., Rosenman M., Harwig S. S. et al. Ultrasensetive assays for endogenous antimicrobial polypeptides // J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173.
13. Maldsonado A., Ruiz-Barba J. L., Jimenez-DiazR. Production of plantarcin NC8 by Lactobacillus plantarum NC8 is induced in the presence of different types of Gram- positive bacteria // Arch. Microbiol. 2003. Vol. 1. P. 29-35.
14. Casaus P., Nilsen T., Cintas L. M. et al. Enterocin B, a new bacteriocin from Enterococcus faecium T136 wich can act synergistically with enterocin A // Microbiol. 1997. Vol. 143. P. 2287-2294.
15. Tompking G. R., Peavey M. A., Birchmeier K. R., Tagg J. R. Bacteriocin production and sensitivity among coaggregating noncoaggregating oral streptococci // Oral. Microbiol. Immunol. 1997. Vol. 12. № 2. P. 98-105.
Статья принята к печати 21 мая 2008 г.
