CC BY
46
2
НОМЕР
ISSN 2304-9081
Электронный журнал
On-line версия журнала на сайте
http://www.elmag.uran.ru
БЮЛЛЕТЕНЬ
ОРЕНБУРГСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА УрО РАН
2016
УЧРЕДИТЕЛИ
УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РАН ОРЕНБУРГСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 © Коллектив авторов, 2016 УДК 579.61
А.С. Василъченко1,2, Н.И. Дерябина1 ,Е.А. Рогожин3, А.В. Валышев2
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОЦИНОПОДОБНОГО ВЕЩЕСТВА, ПРОДУЦИРУЕМОГО ENTEROCOCCUS FAECIUM
1 Оренбургский государственный университет, Оренбург, Россия
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия 3 Институт биоорганической химии им. ак. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва, Россия
Цель: выделить и охарактеризовать бактериоциноподобное вещество (БПВ), продуцируемое штаммом E. faecium ИКВС 8.
Материалы и методы. В данном исследовании использовали жидкостную хроматографию низкого давления и флуоресцентную спектроскопию.
Результаты. Методом хроматографии из культуральной среды E. faecium ИКВС 8 выделено БПВ с молекулярной массой около 10-15 кДа. Методом серийных разведений установлена минимальная ингибирующая концентрация выделенного биологически активного вещества (1,56 мкг/мл).
Ключевые слова: энтерококки, бактериоцины, энтероцины, бактериоциноподобное вещество.
A.S. Vasilchenko1,2, N. I. Deryabina1, E.A. Rogozhin3, A.V. Valyshev2
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF THE BACTERIOCIN-LIKE SUBSTANCE PRODUCED BY ENTEROCOCCUS FAECIUM
1 Orenburg State University, Orenburg, Russia
2 Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis Ur RAS, Orenburg, Russia
"3
Institute of Bioorganic Chemistry named academicians M.M. Shemyakin & Yu.A. Ovchinnikov, RAS, Moscow, Russia
Objective. Isolation and characterization of the mode of action of bacteriocin-like substance (BLIS) produced by the strain E. faecium ICIS 8.
Materials and methods. A low pressure liquid chromatography and a fluorescence spec-troscopy were used in this study.
Results. Using a various methods of chromatography the BLIS produced by E. faecium ICIS 8 was purified. It was shown that the molecular weight of the BLIS is close to 10-15 kDa; the minimal inhibitory concentration of the BLIS determined against L. monocytogenes was 1,56 |g mL -1.
Keywords: enterococci, bacteriocins, enterocins, bacteriocin-like substance. Введение
Энтерококки, входящие в состав нормальной микрофлоры кишечника человека, обеспечивают колонизационную резистентность организма хозяина. Одним из механизмов антагонистической активности энтерококков явля-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 ется их способность продуцировать бактериоцины (энтероцины).
Бактериоцины - это бактериальные белки или пептиды, синтезируемые на рибосомах и обладающие антимикробным действием. Известно, что на проявление антагонистической активности энтероцинов влияют температура, электрическое поле, консистенция и состав среды, рН, присутствие Ca2+ и Mg , а также специфические феромоны. В зависимости от физико-химических свойств, аминокислотного состава, а также спектра антимикробного действия энтероцины подразделяют на 4 класса [2] .
К первому классу бактериоцинов относятся лантибиотики - низкомолекулярные катионные, гидрофобные, устойчивые к нагреванию пептиды с молекулярной массой 2-5 кДа, в составе которых присутствует аминокислота лантионин. Второй класс - это немодифицируемые пептиды с молекулярной массой до 10 кДа. Третий класс - крупные белки с молекулярной массой более 30 кДа. Четвёртый класс включает циклические пептиды с молекулярной массой 7-10 кДа, которые представляют собой полипептидную цепь, замкнутую в кольцо [1, 2].
Бактериоцины различаются по механизму своего действия на бактериальную клетку. Бактериоцины могут нарушать жизнеспособность бактериальных клеток путем образования пор в цитоплазматической мембране клетки-мишени, влиять на синтез муреинового слоя клеточной стенки или расщеплять его ферментативным путем [3].
Целью исследования явилось выделение антимикробного вещества штамма энтерококка и характеристика его биологической активности.
Материалы и методы
Объектом исследования послужил непатогенный штамм E. faecium ИКВС 8, чья антагонистическая в отношении Listeria monocytogenes была выявлена ранее [4].
Бактериоциноподобное вещество (БПВ) получали при культивировании энтерококков в бульоне Schaedler при температуре 37°С в течение 48 ч. Клетки из среды удаляли центрифугированием; культуральную жидкость концентрировали на вакуумном концентраторе. Белково-пептидные компоненты культуральной среды осаждали ацетоном, взятым в соотношении 1:7 при 4°С. Полученный осадок высушивали и перерастворяли в дистиллированной воде с последующей оценкой антимикробной активности методом диффузии в агар в отношении L. monocytogenes 88 BK.
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2
Следующим этапом выделения БПВ была одностадийная хроматография с использованием силикагельного обращенно-фазового сорбента на колонке Synchroprep RP-P C8 в условиях низкого давления. Элюцию с колонки проводили 80% водным раствором ацетонитрила в 0,01% трифторуксусной кислоте с последующей лиофилизацией. Полученное вещество перерастворяли в дистиллированной воде и проверяли на наличие антимикробной активности.
В дальнейшем БПВ очищали от примесей методом жидкостной экс-клюзионной хроматографией низкого давления на колонке BioSep-SEC-s2000 (7.8 х 300 mm) (Phenomenex, USA), интегрированной в ВЭЖХ-систему "Knauer SmartLine" (Germany). Элюирование с колонки проводили в изокра-тическом режиме 12% раствором ацетонитрила в 0,01% трифторуксусной кислоте. Полученные фракции лиофилизировали, далее перерастворяли в дистиллированной воде и проверяли на наличие антимикробной активности. Белки и пептиды - маркеры молекулярной массы (Amersham Biosciences, USA) - элюировали с колонки в тех же условиях, что и целевое вещество: бычий сывороточный альбумин (66 кДа), овальбумин (45кДа), Р-лактоглобулин (18,4 кДА), окситоцин (1,1 кДа).
Минимальную ингибирующую концентрацию выделенного бактерио-циноподобного вещества определяли методом серийных разведений [5]. Мембраноповреждающее действие выделенного БПВ оценивали методом спектрофлуориметрии с флуоресцентными красителями SYTO 9 и иодида пропидием. Регистрацию спектров флуоресценции проводили на спектроф-луориметре Флюорат-02 Панорама (Люмэкс, Санкт-Петербург). Опытная проба содержала клетки L. monocytogenes 88 BK и бактериоциноподобное вещество в минимально-ингибирующей концентрации. В отрицательный контроль были добавлены клетки L. monocytogenes 88 BK в дистиллированной воде; в положительном контроле бактерии инкубировали в 70% этиловом спирте.
Результаты и обсуждение
Методами хроматографии из культуральной среды энтерококка было выделено бактериоциноподобное вещество (БПВ), обладающее выраженной антилистериозной активностью.
При разделении методом эксклюзионной хроматографии получено 11 фракций, из которых биологической активностью обладала одна (рис. 1). Со-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 поставление времени удержания целевого вещества и различных маркерных веществ с известными молекулярными массами позволило определить приблизительную молекулярную массу БПВ. Так, выход фракции, обладающей активностью, зафиксирован на 14,98 мин, что близко к времени выхода Р-лактоглобулина (15,93 мин), молекулярная масса которого 18,4 кДа.
хЕ+З
О 5 10 15 20 25
TLms (rain)
Рис. 1. Профиль разделения обессоленного белково-пептидного препарата, полученный методом эксклюзионной хроматографии. * -биологически активная фракция.
Оценка динамики роста клеточной популяции L. monocytogenes 88 BK с внесением БПВ позволила определить ингибирующую концентрацию, составившую 1,56 мкг/мл (рис. 2).
Рис. 2. Динамика роста клеточной популяции L. monocytogenes 88 BK при воздействии бактериоциноподобного вещества E. faecium ИКВС 8.
С помощью флуоресцентных красителей был определен мембрано-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 повреждающий характер действия выделенного бактериоциноподобного вещества (рис. 3). Так, в опытной пробе детектируются клетки с нарушенной целостностью клеточных барьерных структур, о чём свидетельствует превалирование флуоресценции пропидия иодида над флуоресценцией БУТО 9.
контрольная группа опытная группа
Рис 3. Оценка целостности барьерных структур L.monocytogenes 88 ВК при воздействии бактериоциноподобного вещества. Ось ординат -соотношение интенсивности максимумов флуоресценции БУТО 9 к иодиду пропидия.
В то же время, популяция листерий в контроле была представлена преимущественно интактными клетками, о чём свидетельствует флуоресценция, главным образом, БУТО 9, проникающего через неповрежденные барьерные структуры клеток (рис. 3).
Заключение
Таким образом, с использованием хроматографических методов из культуральной среды Enterococcus faecium ИКВС 8 выделено бактериоцино-подобное вещество с молекулярной массой 10-15 кДа и установлена его минимальная ингибирующая концентрация, которая составила 1,56 мкг/мл. Использование флуоресцентных ДНК-тропных красителей (БУТО 9 и иодида пропидия) позволило установить мембрано-повреждающее действие выделенного вещества.
(Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 15-4-4-28; стипендии Президента РФ для молодых ученых -
№№ SP-943.2015.4; SP-2093.2015.4J.
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2
ЛИТЕРАТУРА
1. Ермоленко Е.И. Бактериоцины энтерококков: проблемы и перспективы использования. Вестник СПбГУ. 2009. 3: 78-93.
2. Cotter P. D., Ross R.P. What's in a name? Class distinction for bacteriocins. Nature Reviews Microbiology. 2006. 4: 1-2.
3. Snyder A.B., Worobo R.W. Chemical and genetic characterization of bacteriocins: Antimicrobial peptides for food safety. J. Sci. Food. Agric. 2014: 94: 28-44.
4. Валышев А.В., Васильченко А.С. Морфологические изменения клеток листерий под действием метаболитов энтерококков кишечной микрофлоры человека. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014. 6: 78-81.
5. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R.E.W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 2008. 3: 163-175.
Поступила 23.05.2016
(Контактная информация: Валышев Александр Владимирович - к.м.н., заведующий лабораторией дисбиозов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: 460000 г. Оренбург, ул. Пионерская, 11; тел./факс 8 (3532) 775417, email: [email protected])
LITERATURA
1. Ermolenko E.I. Bakteriociny jenterokokkov: problemy i perspektivy ispol'zovanija. Vestnik SPbGU. 2009. 3: 78-93.
2. Cotter P. D., Ross R.P. What's in a name? Class distinction for bacteriocins. Nature Reviews Microbiology. 2006. 4: 1-2.
3. Snyder A.B., Worobo R.W. Chemical and genetic characterization of bacteriocins: Antimicrobial peptides for food safety. J. Sci. Food. Agric. 2014: 94: 28-44.
4. Valyshev A.V., Vasil'chenko A.S. Morfologicheskie izmenenija kletok listerij pod dejstviem metabolitov jenterokokkov kishechnoj mikroflory cheloveka. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. 2014. 6: 78-81.
5. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R.E.W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 2008. 3: 163-175.
Образец ссылки на статью:
Васильченко А.С., Дерябина Н.И., Рогожин Е.А., Валышев А.В. Выделение и характеристика бактериоциноподобного вещества, продуцируемого Enterococcus faecium. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2016. 2: 6c. [Электронный ресурс] (URL:
http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2016-2/Articles/VAS-2016-2.pdf).
