CC BY
10
УДК 541.128:577.151.42
БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ОКИСИ УГЛЕРОДА В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ
Ф. К. Мухитова*, М. Н. Давыдова, Е. В. Каширина, Ю. Ф. Зуев, Н. Н. Вы. ю жанина
(Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, 420503, Татарстан, Россия, Казань, а/я 30)
Изучено влияние органических растворителей различной природы на ферментативную активность экстрактов клеток Б. desulfuricans В-1388. Проведено ферментативное восстановление гексена-1 в присутствии различных ПАВ в атмосфере СО/Н - буфер - октан. Показано, что на направление процесса и выход продуктов влияет природа поверхностно-активного вещества. Динамическая структура реакционной среды была охарактеризована с помощью ЯМР-1Н и ЭПР-спектроскопии.
Известно, что ферменты являются активными и высокоселективными катализаторами многих химических реакций, и их использование для целей тонкого органического синтеза весьма перспективно [1, 2]. Однако уникальные свойства ферментов сохраняются, как правило, в водном растворе, в узком диапазоне рН и температур, в то время как термодинамические условия наибольшего выхода продуктов в катализируемой реакции могут не совпадать с условиями сохранения ферментативной активности. Общим решением вопроса может служить равновесный подход, т. е. такой подход, который позволяет увеличить выход целевого продукта в термодинамически неблагоприятной реакции за счет сдвига химического равновесия. С этой целью используют водно-органические среды для перевода водонерастворимых продуктов в органическую фазу и поверхностно-активные вещества для создания условий функционирования ферментов без потери операционной активности [3]. В задачу данного исследо-
вания входило изучение ферментативного восстановления окиси углерода при катализе экстрактами клеток сульфатредуцирующих бактерий в рамках стабильной реакционной системы.
Методы исследования
В работе использовали бактерию Ве&'и1/о-У1Ьг1о desulfu-ricans В-1388 из коллекции ВКМ. Экстракты клеток получали в соответствии с методикой [4], СО-дегид-рогеназную активность экстрактов клеток определяли, как описано в [4], гидрогеназную активность регистрировали спектрофотометрически по [5]. Для определения влияния органических растворителей экстракты клеток инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с органическим растворителем, а затем определяли СО-дегидрогеназную и гидрогеназную активность. Ферментативный синтез проводили в герметично закрытых пенициллиновых флаконах, предварительно прокачанных
*Адресат для переписки.
необходимой газовой смесью, куда вводили по 5 мл реакционной смеси, состоящей из 3,5 мл буфера (рН 8,0), 0,5 мл органического растворителя, 0,5 мл соответствующего ПАВ, 0,5 мл экстракта клеток (10-15 мг белка). Реакционную смесь перед началом реакции «озвучивали» с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т (22 кГц, 30 с).
Продукты реакции анализировали методом ГЖХ по [6]. Выход продуктов реакции - углеводородов (УВ) и кислородсодержащих соединений (КС) определяли как сумму концентраций отдельных продуктов, умноженную на число атомов углерода в молекуле каждого продукта (это так называемый выход по углероду). Общий выход определяли как сумму УВ и КС.
В работе использовали органические реактивы (Serva, Швейцария и Fluka, Германия), неорганические соли для приготовления буферных растворов «х.ч.» отечественного производства.
Результаты и их обсуждение
Ранее нами было показано, что экстракты клеток Desulfovibrio desulfuricans В-1388 катализируют восстановление окиси углерода молекулярным водородом [7]. Реакция проходит при комнатной температуре в нейтральных буферных растворах. Продуктами реакции являются парафиновые углеводороды от С8 до С24, нерастворимые в воде. Выходы продуктов в этом процессе невысоки, и существенно увеличить их, изменяя физико-химические параметры (температура, давление, концентрации реагентов и пр.) не удается. Реакционная среда при этом представляет собой сложную гетерогенную двухфазную систему, где одна фаза - газ (окись углерода и водород), другая - жидкость (экстракт клеток сульфатредуцирующих бактерий в буферном растворе). В такой системе кинетика гетерогенной реакции определяется как скоростью самого ферментативного превращения, так и процессами переноса (диффузией), необходимыми для восполнения расхода реагирующих веществ и удаления из реакционной зоны продуктов реакции. При введении органического растворителя, не смешивающегося с водой, но растворяющего парафины, можно вывести продукты из сферы реакции. Необходимым условием при этом является сохранение каталитической активности ферментного комплекса. Определяющим же условием для осуществления процесса является наличие в каталитическом комплексе ферментов, специфичных к окиси углерода и водороду - СО-дегидро-геназы и гидрогеназы соответственно - и являющихся ключевыми в процессах трансформации окислов углерода. Как было показано ранее [8], используемая в экспериментах культура Desulfovibrio desulfuricans обладает мощным биохимическим потенциалом и экстракты клеток содержат активные СО-дегидрогеназу и гидрогеназы. Было изучено влияние органических растворителей разной природы, не смешивающихся с водой (хлороформ, четыреххлористый углерод, бензол, диэтиловый эфир, октан) на ферментативную активность экстрактов клеток (табл. 1). Ферментативная (гидрогеназная и СО-дегидроге-назная) активность полностью подавляется в присутствии хлороформа и четыреххлористого углерода и практически
сохраняется в присутствии октана. При проведении ферментативного синтеза в системе (СО + Н2) - буферный раствор - октан необходимым становится введение поверхностно-активных веществ, снижающих поверхностное натяжение на границах раздела фаз газ - жидкость и жидкость - жидкость. Кроме того, поверхностно-активные вещества должны стабилизировать ферментную глобулу, обеспечивая сохранность ферментативной активности. При добавлении ПАВ в концентрации более 10% образуются устойчивые эмульсии октана в воде (1:10), время жизни которых составляет несколько недель. При снижении концентрации ПАВ в среде до 0,1% по окончании реакции эмульсию можно разрушить добавлением соли (№С1) и проанализировать продукты реакции в каждой из фаз методом ГЖХ. Было установлено, что катионогенные ПАВ, содержащие галогенид-ионы в качестве противоио-нов, например цетилпиридиний бромид, необратимо инактивируют ферментный комплекс экстрактов и не могут быть использованы для стабилизации системы. Было изучено влияние различных ПАВ (табл. 2) на направление и выход ферментативного восстановления в водно-октановой среде непредельного углеводорода гексена-1 смесью СО - Н2 (1:1) и чистой окисью углерода. В присутствии диоктилсульфосукцината натрия (АОТ) как в атмосфере 100% СО, так и в атмосфере СО и водорода (1:1) происходит только димеризация гексена в додекан. При этом степень конверсии гексена составляет 20%. В присутствии ПАВ другой природы (неионогенного ПАВ) полиоксиэтиленсорбитана моноолеата (Твин-80) направление реакции становится совершенно иным. Происходит восстановительное карбонилирование гексена, а также синтезируются насыщенные углеводороды, степень конверсии гексена в этом случае существенно выше (более 40%), содержание насыщенных углеводородов, построенных, по-видимому, за счет гомологизации гексена, в продуктах реакции составляет 53,2%. Немного меньшую долю (42,2%) составляют карбонильные соединения -продукты присоединения окиси углерода по двойной связи гексена. Кроме того, происходит гидрирование гексена в гексан, доля гексана составляет 4,6%.
Направление ферментативного процесса, очевидно, зависит не только от природы, но и от строения ПАВ. Нами было показано, что в ряду аналогичных ПАВ (Tween-20, Tween-65, Tween-80, Tween-85) отличаются не только степень конверсии субстрата, но и выход продуктов. Можно
Т а б л и ц а 1
Влияние органических растворителей на ферментативную активность экстрактов клеток Б. desulfuricans шт. В-1388
Условия опыта СО-ДГ-активность, % ГГ-активность, %
Без растворителя 100 100
Хлороформ 0 0
Четыреххлористый 0 0
углерод
Бензол 90 90
Диэтиловый эфир 80 85
Октан 100 100
Т а б л и ц а 2
Общий выход и состав продуктов ферментативного восстановления гексена-1
ПАВ Степень конверсии гексена-1, % Общий выход, %
УВ КС C6H14 C12H26
AOT 20,0 — — — 100
Tween-20 42,8 47,8 50,0 2.2 —
Tween-65 42,2 49,1 46,6 4.3 —
Tween-80 40,0 53,2 42,2 4.6 —
Tween-85 42,7 63,9 31,7 4.4 —
УВ - углеводороды, КС - кислородсодержащие продукты карбонилирования гексена.
предположить, что строение и размеры углеводородного радикала в молекуле ПАВ определяют форму и подвижность ассоциатов ПАВ с органической компонентой реакционной среды, а это, в свою очередь, влияет на активность ферментного комплекса и определяет в конечном итоге направление и эффективность процесса. Динамическая структура реакционной среды на примере системы Tween-80 - октан - вода была охарактеризована с помощью физических методов (:Н ЯМР с Фурье-преобразованием импульсным градиентом магнитного поля и ЭПР). Коэффициенты самодиффузии, полученные для всех компонент реакционной среды, позволили предположить для нее следующую наиболее вероятную структурную модель. Органические компоненты смеси (гексен и октан) существуют в виде микрокапель с радиусом в не-
сколько сотен ангстрем, окруженных монослоем ПАВ (Tween-80). Эти микрокапли суспендированы в водной среде. Данные ЭПР, полученные с использованием 7-док-сил-стеариновых кислот в качестве парамагнитного зонда, не противоречат предложенной структуре реакционной среды. Спектры ЭПР имеют пятикомпонентную форму, что свидетельствует об ограниченной подвижности молекулы 7-доксил-стеариновой кислоты. Этот факт свидетельствует о плотности упаковки молекул ПАВ в монослое, окружающем микрокапли, куда встраиваются парамагнитные зонды. Дальнейшее моделирование реакционной среды для ферментативной конверсии СО будет продолжено в направлении поиска оптимальных ПАВ, органической фазы, условий проведения синтеза, а также изучения динамической структуры системы.
Данная работа была поддержана РФФИ. Проект № 99-03-32036.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гладилин А.К., Левашов А.В. // Успехи биол. химии. 1996. 36.
С. 141.
2. Klibanov A.M. // Accounts Chem. Res. 1990. 23. P. 114.
3. Хмельницкий Ю.Л., Левашов. А.В., Клячко Н.Л., Мартинек К.
// Биотехнология. 1988. 4. С. 292.
4. Тарасова Н.Б., Мухитова Ф.К., Рязанцева И.Н., Беляева М.И.
// Биохимия. 1985. 50. С. 454.
5. Кияшко С.В., Мухитова Ф.К., Рябцева О.А. // Биохимия. 1994.
59. С. 220.
6. Беляева М.И., Мухитова Ф.К., Золотухина Л.М., Багаева Т.В.,
Карпилова И.Ю. // Микробиология. 1992. 61. С. 194.
7. Lapidus A.L., Grobovenko S.Y., Mukhitova F.K., Kiyashko S.V.
// J. Mol. Cat. 1989. 56. P. 260.
8. Мухитова Ф.К., Кияшко С.В., Лапидус А.Л. // Прикл. биохим.
микробиол. 1999. 35. С. 308.
Поступила в редакцию 20.06.00
