CC BY
13
УДК 577.151
БИОКАТАЛИТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ БЕНЗАЛЬДЕГИДА Ф.К. Мухитова, Е.В. Каширина
(Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН А/Я 30, Казань 420111, Россия; e-mail: mukhitova@mail. knc. ru)
Изучены некоторые биокаталитические свойства сульфатредуцирующей бактерии Desulfovibrio desulfuricans штамм В-1388. Показано, что в анаэробных условиях в присутствии молекулярного водорода экстракты клеток D. desulfuricans катализируют трансформацию бензальдегида в бензиловый спирт и бензойную кислоту. Исследовано влияние физико-химических параметров (рН и ионная сила среды, температура, концентрации реагентов) на выход продуктов реакции. Определены оптимальные условия проведения реакции.
Получение ферментов и их использование в различных технологических областях является сегодня одной из актуальных проблем биотехнологии. Наличие широкого спектра активных ферментов у сульфатредуцирую-щих бактерий позволяет использовать культуры суль-фатредукторов, а также их клеточные экстракты в самых разнообразных процессах. В литературе имеется не так много сведений о возможности использования сульфатредуцирующих бактерий в восстановительных процессах [1, 2], особенно с участием молекулярного водорода [3].
Цель настоящей работы состояла в выяснении возможности восстановления бензальдегида молекулярным водородом при катализе экстрактами клеток Desulfo-угЪпо desulfuricans штамм В-1388.
Материалы и методы
В работе использовали сульфатредуцирующие бактерии DesulfoviЪrio desulfuricans штамм В-1388, коллекция ВКМ (или DesulfoviЪrio desulfuricans 2198, коллекция института микробиологии РАН). Бактерии выращивали на среде Постгейта В. Клетки собирали в стационарной фазе роста. Для приготовления биокатализатора отмытые клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при частоте 22 кГц (1 мин/мл) и центрифугировали при 15000§ 50 мин, в экспериментах использовали супернатантную фракцию. Содержание белка в экстракте определяли по
модифицированному методу Лоури. Водород хрома-тографической чистоты получали с помощью генератора водорода типа СГС-2.
Реакцию трансформации бензальдегида проводили в пенициллиновых флаконах (объем около 15 мл), куда вносили по 3 мл раствора бензальдегида в 0,05 М буфере трис-НС1 с заданным значением рН. Флаконы герметично закрывали, заполняли смесью водорода с аргоном нужного состава, либо чистым водородом. Реакцию начинали с введения экстракта клеток (2-5 мг белка). Флаконы встряхивали в течение 2 ч.
Продукты реакции анализировали на хроматографе "Кристаллюкс-4000" с управляющим и обрабатывающим пакетом программ Net Chrom V 1,5 методом газожидкостной хроматографии. Кислородсодержащие продукты (бензиловый спирт, бензойная кислота) разделяли на колонке из нержавеющей стали (l = 150 см, внутренний диаметр 3 мм, 10% Reoplex-400).
Температуру термостата программировали: 130° в течение 5 мин, повышение до 190° со скоростью 20°/мин, выдержка в течение 5 мин, повышение до 210° со скоростью 20°/мин.
Детектор пламенно-ионизационный. Температура испарителя 250°. Газ-носитель - азот ("ос.ч."), 30 мл/мин.
Результаты исследований и обсуждение
Химическое восстановление альдегидов в спирты, особенно в больших масштабах, осуществляется путем
каталитического гидрирования. Реакции проводят в условиях повышенного давления (70 ат, 50°) на никелевых, палладиевых или платиновых катализаторах, про-мотированных двухвалентным железом. При восстановлении бензальдегида образуется бензиловый спирт (фенилкарбинол), который так же, как и получаемые на его основе эфиры, является душистым веществом, поэтому широко применяется в парфюмерии, является компонентом пищевых эссенций, спазмолитических, косметических, противоожоговых средств и т.д. Поиск более экономичного способа получения такого практически значимого соединения представляет большой интерес.
Ферментные системы, как правило, функционируют в водных средах и чувствительны к влиянию различных внешних факторов, таких как температура, рН среды, концентрация реагентов и т.д. Мы изучали возможность восстановления бензальдегида молекулярным водородом при катализе экстрактами клеток Б. desulfu-пеат штамм В-1388, а также влияние различных условий на эффективность реакции.
Реакцию проводили в анаэробных условиях в атмосфере молекулярного водорода. В качестве контроля служили опыты без внесения клеточных экстрактов или с инертным газом (аргоном) в газовой фазе. Мы показали, что в атмосфере молекулярного водорода экстракты клеток Б. desulfuriеans катализируют трансформацию бензальдегида в бензиловый спирт и бензойную кислоту:
Трансформация бензальдегида экстрактами клеток Desulfovibrio desulfuricans шт.В-1388
рисон
Экстракты клеток, Н2
рисн2он + рисоон.
Вариант опыта Бензиловый спирт, мг/мл Бензойная кислота, мг/мл
100% Н2 2,5 5,4
100% Аг 0 7,7
0,01 г дитионита натрия, 100% Аг 1,7 0,5
по-видимому, с участием гидрогеназы, так как молекулярный водород в реакционной смеси отсутствует.
Образование бензойной кислоты можно объяснить действием альдегиддегидрогеназы, которая, как известно [4], катализирует реакции окисления альдегидной группы в карбоксильную:
альдегиддегидрогеназа
СН2СОН + КЛБ + н20 ^
СН2 - СООН + №АБН2
При замене водорода в газовой фазе на аргон бензи-ловый спирт не образуется, но увеличивается количество бензойной кислоты (таблица). Если в качестве восстановителя вместо водорода использовать дитионит натрия (Ыа^ОД то бензиловый спирт образуется, хотя и в меньшем количестве. Этот процесс не связан,
Было установлено [5], что у сульфатредуцирующих бактерий имеются альдегиддегидрогеназы. Однако в данной работе мы не ставили целью изучение участия этого фермента в трансформации бензальдегида.
Известно, что концентрация субстрата оказывает влияние на скорость ферментативной реакции при постоянной концентрации фермента, и определение концентрации молекулярного водорода, при которой выход бензилового спирта наибольший, имеет значение для увеличения эффективности процесса. Мы определили выходы продуктов реакции восстановления бензальдеги-да при трех разных значениях концентрации водорода (30, 60 и 100%). При 100%-м содержании водорода в газовой фазе выход продукта восстановления наибольший. Полученные результаты представлены на рис.1.
Влияние рН реакционной среды изучали на примере буфера трис-НС1. Был выбран небольшой интервал рН (слабо-кислая, нейтральная и слабо-щелочная среда). Результаты опыта приведены на рис. 2,
5.45
3.8
0,38
0,23
0,94 3.7
Г
30
60
100
водород,%
□ бензиловый спирт, мг/мл Пбензойная кислота,мг/мл
6 -| 5 -4 -I 32 21 -0 -
4,98
1,14
4,25
3,8
1,1
8 рН
□ бензиловый спирт, мг/мл □бензойная кислота, мг/мл
6
7
Рис. 1. Влияние концентрации водорода на выход бензилового спирта
Рис. 2. Влияние рН на выход бензилового спирта
0,43
3.8
0,3
3.1
0,22
3.36
25
40
температура, °С
60
□ бензиловый спирт, мг/мл □ бензойная кислота, мг/мл Рис. 3. Влияние температуры на выход бензилового спирта
, 0.5-
Ч 0.4-
0.3 -
0.2 -
0.0
—I—
0.1
0.2
—I—
0.3
—I—
0.4
—I—
0.5
—I—
0.6
Ионная сила, М Рис.4. Влияние ионной силы на выход бензилового спирта
где показано что, наибольший выход бензилового спирта достигается при рН 7,0.
На рис. 3 представлена зависимость выхода бензило-вого спирта от температуры реакционной смеси. Как известно, оптимальная температура ферментативной реакции зависит от соотношения влияния температуры на скорость ферментативной реакции и скорость деструкции фермента. Для изучения влияния температуры на выход бензилового спирта реакцию восстановления бензальдегида проводили при 25, 40 и 60°. Наибольшее количество бензилового спирта образуется при 25°.
Наличие в водном растворе разных ионов обусловливает их электростатическое взаимодействие друг с другом, характеризующееся ионной силой раствора, которое может быть выражено следующим образом:
М = 1/2 X CxZ2,
где М - ионная сила раствора; С - концентрация иона; Z - заряд иона.
Для раствора одной соли с однозарядными ионами ионная сила фактически равна молярной концентрации раствора. Фермент, как и любой белок, имеет большое число ионных групп, способных электростатически взаимодействовать с ионами в растворе, следовательно изменение состояния ионных групп в ферменте оказывает влияние на активность фермента, особенно это касается групп, участвующих в катализе или связывании субстрата. Поэтому изменение ионной силы раствора, в котором происходит ферментативная реакция, должно влиять на эффективность процесса.
Нами изучено влияние величины ионной силы раствора на выход бензилового спирта в реакции. Результаты приведены на рис. 4, где показано, чем меньше ионная сила в растворе, тем выше эффективность образования бензилового спирта.
Таким образом, наиболее оптимальными условиями для синтеза бензилового спирта в реакции восстановления бензальдегида молекулярным водородом являются следующие: трис-НС1 буфер (0,05 М); рН 7,0; Т = 25°, 100% Н2.
В реакции трансформации бензальдегида могут принимать участие, как минимум, два фермента: гидроге-наза и альдегиддегидрогеназа. Соотношение количества бензилового спирта и бензойной кислоты в продуктах ферментативной трансформации бензальдегида зависит от соотношения значений активности, по крайней мере, этих двух ферментов.
Изучение механизма трансформации бензальдегида сульфатредуцирующими бактериями и регулирование этого процесса могут составить задачу дальнейших исследований.
0.7 -
0.6
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Boopathy R., Manning J.F. // Can. J. Microbiol. 1996. 42.
Р. 1203.
2. MeckenstockR.U., AnnweilerE. // Appl. Environ. Microbiol. 2000.
66. Р. 2743.
3. Мухитова Ф.К., Кияшко С.В., Лапидус А.Л. // Прикл. биохим. микробиол. 1999. 35. С. 308.
4. Готшалк Г. Метаболизм бактерий. М., 1982.
5. Zellner G., Jargon A. // Arch. Microbiol. 1997. 168. Р. 480.
Поступила в редакцию 25.10.02
