CC BY
35УДК: 616-092.7
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ПАТОЛОГИИ СЕРДЦА ПРИ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ ТКАНЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Харченко В. З., Розумняк Р. Л., Мневец Р. А., Бекетов А. А.
Кафедра общей и клинической патофизиологии, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Мневец Руслан Александрович, студент кафедры общей и клинической патофизиологии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского, e-mail: mnevets.r@gmail.com
For correspondence: Ruslan A. Mnevets, student of the Department of General and Clinical Pathophysiology of Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, e-mail: mnevets.r@gmail.com
Information about authors:
Kharchenko V. Z., orcid.org/0000-0001-5092-4672 Rozumnyak R. L., orcid.org/0000-0001-5796-9750 Mnevets R. A., orcid.org/0000-0001-9614-5762 Beketov A. A., orcid.org/0000-0002-0369-5165
РЕЗЮМЕ
В данной статье описаны биохимические механизмы нарушения структуры и функции сердца при экспериментальном реперфузионном синдроме. Установлено, что при ишемии и реперфузии тканей происходит активация протеиназ в тканях сердца, что проявляется в существенном приросте активности протеолитических ферментов и угнетении активности их ингибиторов в супернатантах гомогенатов сердца. Эти изменения способны повреждать ткань сердца, что в дальнейшем может привести к расстройствам его биоэлектрической активности. При этом степень выраженности указанных расстройств прямо пропорционально связана с длительностью ишемического и постишемического периодов.
Ключевые слова: ишемия; реперфузия; сердце; миокард; протеолиз; ингибиторы протеиназ.
BIOCHEMICAL MECHANISMS OF DEVELOPING HEART PATHOLOGY DURING ISCHEMIA AND TISSUES REPERFUSION IN EXPERIMENT
Kharchenko V. Z., Rozumnyak R. L., Mnevets R. A., Beketov A. A.
Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
This article describes biochemical mechanisms of the heart function and structure lesion during the experimentally set reperfusion syndrome. It is well known that ischemia and reperfusion cause activation of proteinases in the heart tissues, which is manifested by a major growth of activity of proteolytic enzymes and suppression of their inhibitors in the supernatants of the heart homogenates . These changes can damage the heart tissue, which can lead to disorders of the heart bioelectrical activity.
Keywords: ischemia; reperfusion; heart; myocardium; proteolysis; proteinases inhibitors.
Высокая заболеваемость и смертность от ишемических и постишемических патологий определяет важность изучения молекулярных механизмов органопатологии при реперфузионном синдроме [1, 2]. Актуальность изучения реперфузионного синдрома обусловлена и тем, что он может приводить к развитию шока.
При этом известно, что во время шока в миокарде в результате нарушения микроциркуляции увеличивается метаболизм свободных жирных кислот и потребление лактата, что приводит к повреждению мембранного аппарата и ферментных систем кардиомиоцитов, нарушению обмена веществ и гипоксии миокарда. Большое значение придается вторичной
выработке свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов, которые способны повреждать кардиомиоциты [3-8].
Также избыток ионов Са2+ приводит к неконтролируемой активации сократительного аппарата кардиомиоцитов и образованию гиперконтрактур миофибрилл данных клеток, что способствует повреждению соседних здоровых кардиомиоцитов, нарушению транспорта натрия по щелевым соединениям с последующей активацией обмена Ма+ /Са2+ и повышением уровня кальция в этих клетках [9]. Повреждение миокарда вследствие развития реперфу-зионного синдрома происходит и в результате повышенной продукции активных форм кис-
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
лорода (АФК), реэнергизации электрон-транспортной цепи в митохондриях, ее активации и неконтролируемой продукции электронов, что способствует образованию большого количества АФК и выходу их из митохондрий в цитоплазму клетки. Оксидантный стресс в сочетании с высоким содержанием кальция и быстрой нормализацией рН способствует открытию митохондриальной поры - структуры в мембране митохондрий, через которую выходят в цитоплазму проапоптотические факторы. При этом реперфузионное повреждение миокарда может сопровождаться аритмиями - ускоренным идиовентрикулярным ритмом, синусовой брадикардией, желудочковыми экстрасисто-лиями, тахикардией и фибрилляцией [10-14].
В настоящее время установлена роль дисбаланса системы протеолиза в патогенезе развития органопатологии при турникетном шоке, однако отсутствуют достаточно полные данные о его роли в этиопатогенезе патологии сердца [8].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 50 крысах-самцах линии «'Ш81аг» массой 180-200 грамм, которые были разделены на 5 серий. Контрольную серию составили интактные крысы; первую серию - крысы с продолжительностью ишемии 2 часа, реперфузионного периода - 6 часов; вторую серию - крысы с продолжительностью ишемии 2 часа, реперфузионного периода - 12 часов; третью серию - крысы с продолжительностью ишемии 6 часов, репер-фузионного периода - 6 часов; четвертую серию - крысы с продолжительностью ишемии 6 часов, реперфузионного периода - 12 часов.
Содержание крыс в виварии было одинаковым, что позволило сформировать структурную группу [15].
Опытным животным моделировали репер-фузионный синдром путем наложения жгутов на обе задние конечности на уровне паховой складки сроком на 2 и 6 часов с последующим их снятием, используя методику профессора В. З. Харченко [16], ширина пережима тканей - 2-3 мм. Критерием правильности наложения жгута являлось отсутствие отёка конечностей и бледность их окраски. Реваску-ляризацию производили одномоментно рассечением жгутов. Эвтаназию и забор исследуемого материала крыс экспериментальных серий проводили через 6 и 12 часов после ре-васкуляризации конечностей в зависимости от принадлежности к экспериментальной серии.
Оценку динамического равновесия проте-иназ-ингибиторной системы определяли с помощью эластазо- (ЭПА) и трипсиноподобной
активности (ТПА), антитриптической активности (АТА) и активности кислотостабильных ингибиторов протеаз (КСИ) в супернатантах гомогенатов сердца. Исследование неспецифических протеиназ и их ингибиторов проводили с использованием энзиматических методов на спектрофотометре «Biomat 5» (Великобритания). Основой изучения активности ферментов протеолиза служил прирост оптической плотности при расщеплении субстратов, а измерение активности их ингибиторов - на торможении расщепления протеаназами белковых и низкомолекулярных субстратов [17].
Для оценки функционального состояния сердца проводили запись электрокардиограммы (ЭКГ) в динамике с использованием поверенного электрокардиографа «ЭК1Т-03М», для чего к электродам подсоединяли и фиксировали специальные иглы. Электроды накладывали на дистальные отделы передних и задних конечностей. Снятие электрокардиограммы проводили во втором отведении. Электрокардиография проводилась при скорости движения ленты, равной 50 мм/с при 20 мВ.
Экспериментальное исследование было проведено в соответствии с рекомендациями этического комитета Медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского», а также в соответствии с требованиями Постановления Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.08.2014 № 51 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных (США, 2011) и Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986).
Полученные в результате экспериментов данные подвергали статистической обработке с использованием методов вариационной статистики с вычислением средних величин (М), их стандартными отклонениями (m) и оценкой t-критерия Стьюдента в среде программы Microsoft Excel 2016; достоверными считали показатели при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе полученных данных было установлено достоверное увеличение активности ферментов протеолиза в супер-натантах гомогенатов сердца, прямо пропорционально связанное с длительностью ишемического периода (ЭПА - до 118%, ТПА - до 228%), при этом длительность периода
реперфузии на эти показатели влияла незначительно. Отмечалось пропорциональное длительности и ишемического, и репер-фузионного периода угнетение активности
ингибиторов протеиназ в супернатантах. Так, АТА последовательно снижалась до 53,19%, а активность КСИ - до 77% по сравнению с интактными крысами (Таблица 1).
Таблица 1
Активность неспецифических протеиназ и их ингибиторов в супернатантах гомогенатов сердца при
экспериментальном реперфузионном синдроме
Серии Показатели Активность ферментов протео-лиза Активность ингибиторов ферментов протеолиза
ЭПА (мкМоль/ мг*мин) ТПА (мкМоль/ мг*мин) АТА (мИЕ/мг) КСИ (мИЕ/мг)
К М±т 137,53±6,09 25,22±0,97 839,55±22,89 279,90±12,680
1 М 149,34±5,37 55,94±0,96 915,84±30,02 432,55±9,31
Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
2 М 160,81±7,67 63,33±1,01 756,66±47,78 411,33±10,30
Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
3 М 162,07±7,16 53,11±3,41 488,35±50,21 322,93±9,55
Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
4 М 162,73±5,40 57,54±6,65 446,63±12,03 217,15±8,230
Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
Динамика изменения частоты сердечных сокращений демонстрировала тенденцию к увеличению их количества через 1 час после наложения жгутов, а затем, после их снятия, наблюдалось постепенное снижение ЧСС, а спустя 12 часов после реперфузии у крыс с 2-х часов ишемией отмечалось снижение ЧСС на 41%, а у крыс с 6-ти часовой ишемией - на 60,2% (р<0,001). Также отмечалось уменьшение вольтажа зубцов Я и 8.
У некоторых крыс установлены электрокардиографические признаки развития острого инфаркта миокарда, характеризующиеся элевацией 8Т выше изолинии в виде монофазной кривой спустя 6 часов после моделирования 6-часовой ишемии (Рис. 1), а к 12 часам после реваскуляризации регистрировались глубокие зубцы Q (Рис. 2-3).
Функциональные и биохимические повреждения сердца были сопряжены с изменениями микроскопической картины. Так, при моделировании 6-часовой ишемии вне зависимости от продолжительности реперфузи-
Рис 1. ЭКГ крысы (ишемический период - 6 часов, реперфузионный период - 6 часов)
Рис 2. ЭКГ крысы (ишемический период - 6 часов, реперфузионный период - 12 часов)
Рис 3. ЭКГ крысы (ишемический период - 6 часов, реперфузионный период - 12 часов)
онного периода, значительная часть кардио-миоцитов, в большей степени расположенных субэндокардиально, приобретает признаки зернистой дистрофии и умеренного внутриклеточного отека; в отдельных кардиомиоци-тах определяются пикнотичные ядра (Рис. 4).
В эпикарде выявлены признаки очаговых разрастаний жировой клетчатки, признаки слабо выраженного отека, умеренное
2018, т. 8, № 2
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
полнокровие кровеносных сосудов, перива-скулярно обнаруживались небольшие скопления лимфоцитов и макрофагов (Рис. 5).
В миокарде кровеносные сосуды резко полнокровны, некоторые артерии среднего и мелкого калибра с признаками слабо выраженного спазма, в некоторых полях зрения периваскулярно определяются единичные лимфоциты и макрофаги, а также петехиальные кровоизлияния.
Рис. 4. Микрофотография препарата сердца, ишемический период - 6 часов, реперфузион-ный период - 6 часов (ув. 100).
Рис. 5. Микрофотография препарата сердца, ишемический период - 6 часов, реперфузион-ный период - 12 часов (ув. 400).
Таким образом, при реваскуляризации конечностей крыс происходит существенное увеличение активности протеиназ и угнетение активности их ингибиторов в тканях сердца. Это сопровождается повреждением миокарда и развитием ЭКГ-изменений, характерных для острого инфаркта миокарда, что в условиях циркуляторной гипоксии может способствовать, на наш взгляд, дальнейшему развитию полиорганной недостаточности.
ВЫВОДЫ
1. Реперфузия ранее ишемизирован-ных тканей приводит к активации протео-литической системы и повреждению сердца, которое имеет прямую пропорциональную зависимость длительности как ишеми-ческого, так и реперфузионного периода.
2. Функциональные и биохимические нарушения при ишемии и реперфу-зии тканей приводят к морфологическим и биоэлектрическим изменениям сердца.
3. Полученные результаты могут выявить более точные патогенетические механизмы патологических процессов миокарда в следствии повреждающего действия системы протеолиза, что делает дальнейшее их изучение перспективным направлением экспериментальной медицины.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors have no conflict of interests to declare.
Финансирование: отсутствует/
No funding.
ЛИТЕРАТУРА
1. Weman S. M., Karhunen P. J., Penttil A. et al. Reperfusion injury associated with one-fourth of deaths after coronary artery bypass grafting // Ann. Thorac. Surg. 2000; 70(3): 807-812.
2. Moore G. W., Hutchins G. M. Coronary artery bypass grafts in 109 autopsied patients. Statistical analysis of graft and anastomosis patency and regional myocardial injury. JAMA.1981; 246(16): 1785-1789.
3. Мойбенко А. А., Досенко В. Е., Пархоменко А. Н. Эндогенные механизмы кардиопротекции как основа патогенетической терапии заболеваний сердца. Киев; 2008.
4. Гребенчиков О. А., Лихванцев В. В., Плотников Е. Ю., Силачев Д.Н., Певзнер И. Б., Зорова Л. Д., Зоров Д. Б. Молекулярные механизмы развития и адресная терапия синдрома ишемии-реперфузии. Актуальные вопросы анестезиологии и реаниматологии. 2014; (3): 60-67.
5. Оробей М. В. Толерантность головного мозга к ишемии и течение реперфузионного синдрома в условиях модулирования активности кининовой системы: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 14.00.16. Новосибирск, 2008. - 19 с.
6. Фомочкина И. И., Кубышкин А. В. Патогенетическое значение протеиназ-ингибиторной системы в развитии локальной и системной патологи. Патология. 2012; 25(2): 50.
7. Фомочкина И. И., Кубышкин А. В. Протеиназ-ингибиторная система в патогенезе экстремальных состояний. Вестник морского врача. 2008; 6(6): 167.
8. Харченко В. З., Кубышкин А. В., Фомочкина И. И. и др. Молекулярные механизмы развития экстремальных состояний и их коррекция. Симферополь; 2011.
9. Ruiz-Meana M., Rodr í guez-Sinovas A., Cabestrero A. et al. Mitochondrial connexin43 as a new player in the pathophysiology of myocardial ischemia-reperfusion injury // Cardiovasc. Res. 2008; 77(2): 325333.
10. Bilenko M. V. Free-radical mechanism of macrophage involvement in endothelial cell injury and LDL oxidation in ischemic and reperfused vessels. Abstract From the XVII ISHR World Congress of the International Society for Heart Research. July 6-11, Winnipeg, Canada, J. Mol. Cell. Cardiol. 2001; 33(6): 13.
11. Siniscalchi A., Gamberini L., Laici C. et al. Post reperfusion syndrome during liver transplantation: From pathophysiology to therapy and preventive strategies. World J. Gastroenterol. 2016; 22(4): 1551-1569.
12. Sung-Moon J. Postreperfusion syndrome during liver transplantation. Korean J. Anesthesiol. 2015; 68(6): 527-539.
13. Murphy E., Steenbergen C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury. Physiol. Rev. 2008; 88(2): 581-609.
14. Perrelli M. G., Pagliaro P., Penna C. Ischemia/ reperfusion injury and cardioprotective mechanisms: Role of mitochondria and reactive oxygen species. World J. Cardiol. 2011; 3(6): 186-200.
15. Хельд Д. Р. Требования к лабораторным животным при осуществлении программ здравоохранения. Бюл. ВОЗ. 1981; 40(4): 20.
16. Харченко В. З., Алиев Л. Л., Фомочкина И. И., Харченко С. В. Механизмы развития органопатологии при экспериментальном реперфузионном синдроме. Вестник морского врача. 2008; 6(6): 168.
17. Кубышкин А. В. и др. Методы определения активности неспецифических протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и биологических. Киев; 2010.
REFERENCES
1. Weman S. M., Karhunen P. J., Penttil A. et al. Reperfusion injury associated with one-fourth of deaths after coronary artery bypass grafting // Ann. Thorac. Surg. 2000; 70(3): 807-812.
2. Moore G. W., Hutchins G. M. Coronary artery bypass grafts in 109 autopsied patients. Statistical analysis of graft and anastomosis patency and regional myocardial injury. JAMA.1981; 246(16): 1785-1789.
3. Moibenko A. A., Dosenko V. E., Parkhomenko A. N. Endogennye mekhanizmy kardioprotektsii kak osnova patogeneticheskoi terapii zabolevanii serdtsa. Kiev; 2008.
4. Grebenchikov O. A., Likhvantsev V. V., Plotnikov E. Yu., Silachev D.N., Pevzner I. B., Zorova L. D., Zorov
D. B. Molekulyarnye mekhanizmy razvitiya i adresnaya terapiya sindroma ishemii-reperfuzii. Aktual'nye voprosy anesteziologii i reanimatologii. 2014; (3): 60-67. (In Russ)
5. Orobei M. V. Tolerantnost' golovnogo mozga k ishemii i techenie reperfuzionnogo sindroma v usloviyakh modulirovaniya aktivnosti kininovoi sistemy: avtoreferat dis. ... kandidata meditsinskikh nauk: 14.00.16. Novosibirsk, 2008. - 19 s. (In Russ)
6. Fomochkina I. I., Kubyshkin A. V. Patogeneticheskoe znachenie proteinaz-ingibitornoi sistemy v razvitii lokal'noi i sistemnoi patologi. Patologiya. 2012; 25(2): 50. (In Russ)
7. Fomochkina I. I., Kubyshkin A. V. Proteinaz-ingibitornaya sistema v patogeneze ekstremal'nykh sostoyanii. Vestnik morskogo vracha. 2008; 6(6): 167. (In Russ)
8. Kharchenko V. Z., Kubyshkin A. V., Fomochkina I. I. i dr. Molekulyarnye mekhanizmy razvitiya ekstremal'nykh sostoyanii i ikh korrektsiya. Simferopol'; 2011. (In Russ)
9. Ruiz-Meana M., Rodr i guez-Sinovas A., Cabestrero A. et al. Mitochondrial connexin43 as a new player in the pathophysiology of myocardial ischemia-reperfusion injury // Cardiovasc. Res. 2008; 77(2): 325333.
10. Bilenko M. V. Free-radical mechanism of macrophage involvement in endothelial cell injury and LDL oxidation in ischemic and reperfused vessels. Abstract From the XVII ISHR World Congress of the International Society for Heart Research. July 6-11, Winnipeg, Canada, J. Mol. Cell. Cardiol. 2001; 33(6): 13.
11. Siniscalchi A., Gamberini L., Laici C. et al. Post reperfusion syndrome during liver transplantation: From pathophysiology to therapy and preventive strategies. World J. Gastroenterol. 2016; 22(4): 1551-1569.
12. Sung-Moon J. Postreperfusion syndrome during liver transplantation. Korean J. Anesthesiol. 2015; 68(6): 527-539.
13. Murphy E., Steenbergen C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury. Physiol. Rev. 2008; 88(2): 581-609.
14. Perrelli M. G., Pagliaro P., Penna C. Ischemia/ reperfusion injury and cardioprotective mechanisms: Role of mitochondria and reactive oxygen species. World J. Cardiol. 2011; 3(6): 186-200.
15. Khel'd D. R. Trebovaniya k laboratornym zhivotnym pri osushchestvlenii programm zdravookhraneniya. Byul. VOZ. 1981; 40(4): 20. (In Russ)
16. Kharchenko V. Z., Aliev L. L., Fomochkina I. I., Kharchenko S. V. Mekhanizmy razvitiya organopatologii pri eksperimental'nom reperfuzionnom sindrome. Vestnik morskogo vracha. 2008; 6(6): 168. (In Russ)
17. Kubyshkin A. V. i dr. Metody opredeleniya aktivnosti nespetsificheskikh proteinaz i ikh ingibitorov v syvorotke krovi i biologicheskikh. Kiev; 2010. (In Russ)
