CC BY
68УДК 575.174.015.3
Биохимические маркеры интоксикации фосфорорганическими отравляющими веществами
Проведено исследование динамики ряда биохимических показателей крови крыс в течение 6 недель после острого отравления зоманом (ОБ) и веществом типа УХ (ЯУХ). Показано, что помимо изменения активности «классических» маркеров интоксикации фосфоорганическими отравляющими веществами (ФОВ), -холинэстераз крови,- дополнительными биохимическими маркерами интоксикации в ранние после острого отравления сроки может служить активность аминотрансфераз, гамма-глутамилтрансферазы и параоксоназы-1. Динамика креатинина и мочевины может отражать развитие отставленной патологии на поздних сроках (4-6 недель) после острого отравления животных ФОв.
Ключевые слова: ацетилхолинэстераза, бутирилтиохолинэстераза, параоксо-наза-1, фосфорорганические отравляющие вещества, токсикодинамика
Шмурак В.И., Курдюков И.Д., Надеев А.Д., Войтенко Н.Г., Глашкина Л.М., Гончаров Н.В.
НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, г. С.-Петербург
Введенне. Интенсивное развитие химической промышленности и активное применение ее продукции в различных областях хозяйственной деятельности человека привели к широкому распространению заболеваний, этиологически связанных с воздействием химических факторов. Особой группой этих факторов являются фосфорорганические соединения (ФОС). Они широко используются в сельском хозяйстве и промышленности в качестве пестицидов, пластификаторов, компонентов в синтезе лекарственных веществ, полимерных материалов. Около 80 различных ФОС зарегистрированы в качестве инсектицидов, другие нашли свое применение в фармакологии [1], а также в военной токсикологии [2] - это так называемые фосфо-рорганические отравляющие вещества (ФОв).
Механизм острого токсического действия ФОС на организм обусловлен главным образом ингибированием ацетилхолинэстеразы (АХЭ, КФ 3.1.1.7) в нервно-мышечных синапсах и нервной системе. Помимо АХЭ в организме есть еще несколько сотен сериновых гидролаз и около 50 из них являются мишенями для ФОС. Снижение активности АХЭ эритроцитов служит маркером острого отравления ФОС, но известны примеры, когда наличие токсических признаков не сопровождается ингибированием холинэстераз. Например, у рабочих, занятых в производстве хлорофоса, было отмечено снижение памяти, способности обучения, бдительности и моторной реакции, хотя уровень активности АХЭ в крови был такой же, как в группе контроля [3]. Другой тип нейротоксичности, обусловленный действием некоторых ФОС, - центрально-периферическая дистальная сенсомоторная аксонопа-тия, известная как отставленный нейротоксический эффект (ОНЭ) [4] или ФОС-индуцированная отставленная полинейропатия (ОПН) [5] также не сопровождается снижением активности эритроцитарной АХЭ. После восстановления активности маркерных эстераз важно исследовать неспецифические физиолого-биохимические показатели, комплекс которых позволит оценить тяжесть последствий отравления и направленности патогенеза. Поэтому целью настоящего исследования стало изучение активности основных эстераз крови и ряда биохимических показателей на разных сроках после острого отравления ФОВ на примере зомана (GD) и вещества типа VX (RVX).
Материалы н методы нсследовання. Эксперименты проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 180-230 г, содержащихся в условиях вивария в соответствии c «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздрав с оцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н). Зоман и RVX вводили подкожно (п.к.) в дозе 0,4ЛД5о дважды с интервалом 1 час. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Измерение показателей проводили через 3 часа, 24 часа, 1 неделю, 2 недели, 4 недели и 6 недель после воздействия. На каждую временную точку было взято не менее 10 животных.
Для получения сыворотки, кровь, отобранную после декапитации, выдерживали 40мин и центрифугировали 15мин, 3000 об/мин (1500g). В сыворотке крови, полученной от контрольных и опытных животных, определяли уровень общего белка, альбумина, глюкозы, триглицеридов, холестерина, креатинина, мочевины, а также активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартат-аминотрансферазы (АСТ) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ). Биохимические анализы выполняли на автоматическом биохимическом анализаторе Hycel Lisa 300 Plus с использованием коммерческих наборов биохимических реактивов фирмы Biocon в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Активность параоксоназы-1 (PON1) в сыворотке крови определяли по образованию нитрофенола при гидролизе пара-оксона по методу Phuntwate [6]. Для оценки эстеразного статуса животных определяли активность АХЭ в цельной крови по методу Эллмана [7], активность бути-рилхолинэстеразы (БХЭ) при помощи планшетного варианта метода Эллмана с использованием бутирилтиохолина в качестве субстрата. Определение активности карбоксилэстеразы (КЭ) было произведено планшетным методом, основанном на расщеплении р-нитрофенилацетата (НФА) с образованием окрашенного продукта - р-нитрофенола.
Статистическую обработку осуществляли при помощи электронных таблиц EXCEL 2000 for Windows (Microsoft, USA) и программы «GraphPad Prism 5». Для оценки полученных данных использовали непараметрические методы статистики:
вычисление критерия Крускала-Уоллиса и критерия Данна для множественных сравнений. для всех видов анализа статистически значимыми считали значения р<0,05. Результаты представлены как Ме (5; 95 персентиль).
Результаты н обсуждение. В качестве маркера острого отравления зоманом и ЯУХ использовали измерение активности АХЭ в цельной крови крыс. Через 3 часа после отравления зоманом (рис. 1) активность АХЭ составляла менее 10% от контроля, через сутки 22%, а через одну неделю активность АХЭ восстанавливалась лишь до 56%. В более поздние сроки активность АХЭ цельной крови оставалась несколько ниже контрольных значений, но статистической значимости эти изменения не имели.
Изменение активности АХЭ в цельной крови после острого отравления ЯУХ представлено на рис. 2. Значительное снижение активности фермента обнаружено через 3 часа (в среднем до 22% от контроля) и 1 сутки (до 54%) после отравления (р<0,05). через 1 неделю активность АХЭ достигала контрольного уровня, а к двухнедельному сроку незначительно превышала его - на 14%. Некоторое повышение активности АХЭ через 2 недели по сравнению с контролем может быть связано с обновлением популяции эритроцитов: известно, что активность АХЭ эритроцитов «молодого и среднего возраста» значительно выше, чем у «старых» эритроцитов [8].
При сравнении характера действия зомана и ЯУХ на активность АХЭ в цельной крови обнаружено значительно более выраженное и продолжительное угнетение активности фермента после отравления зоманом. Вероятно, это связано с различным характером взаимодействия ФОВ с ферментом. Комплекс зомана с ферментом быстро подвергается «старению», поэтому восстановление активности АХЭ идет за счет вновь синтезированных молекул. С другой стороны, ингибированный ЯУХ фермент подвергается в организме реактивации, что позволяет быстрее восстановить активность АХЭ цельной крови.
Результаты измерения активности БХЭ представлены на рис. 3 и 4. Обнаружено достоверное снижение активности БХЭ на ранних сроках после отравления зоманом - через 3 часа, сутки и 1 неделю (р<0,05). При отравлении ЯУХ изменения имеют характер тенденции и недостоверны. Значительный разброс значений активности БХЭ в контрольной группе может быть связан с тем, что существуют различные генетические формы БХЭ, фенотипически проявляющие разную активность. Данный аспект достаточно подробно исследован в отношении БХЭ человека, которая имеет 9 различных фенотипических изоформ, активность которых может отличаться между собой в пять раз [9]. Однако на крысах такие исследования не проводились. Все же решающее значение имеет, очевидно, чрезвычайно медленное «старение» фермента при связывании с УХ [10].
Для более полной оценки эстеразного статуса экспериментальных животных было проведено исследование активности карбоксилэстеразы (КЭ), наличие которой в сыворотке крови мышей, крыс, других животных и отсутствие ее у человека показано ранее [11]. Отсутствие строгой субстратной специфичности этого фермента значительно затрудняет оценку его истинной активности в сыворотке крови. Для измерения активности КЭ использовали нитрофенилацетат (НФА), в отношении которого проявляют эстеразную активность и другие компоненты сыворотки крови. Как при отравлении зоманом, так и при отравлении ЯУХ достоверных отличий в уровнях активности КЭ не обнаружено.
Из исследованных биохимических показателей крови животных при интоксикации ФОВ наиболее значительно менялась активность АСТ, АЛТ, ГГТ, уровень креатинина, мочевины, холестерина и триглицеридов (табл. 1).
через 3 и 24 часа после острого отравления ФОВ наблюдается некоторое снижение концентрации триглицеридов в сыворотке крови, что обусловлено уменьшением потребления животными корма в течение первых суток. Повышение при этом уровня холестерина (достоверное через сутки после отравления зоманом) обусловлено, очевидно, системным ответом организма и является результатом взаимодействия ряда факторов. Так, с одной стороны, активность многих ферментов, в том числе внеклеточных липаз и внутриклеточной холестеринэстеразы, подавляется при действии ФОС: было показано, что эти ферменты более чувствительна
30
Токсикологический вестник №4 (115)
к действию ФОС, чем даже АХЭ мозга [12]. С другой стороны, ацетилхолин может вызвать повышение уровня цАМФ в клетках либо первично, либо вторично, в качестве компенсаторной реакции [13], тем самым усиливая выход холестерина из клеток [14].
В ранние сроки после отравления зоманом наблюдаются статистически значимые изменения уровня аминотрансфераз и ГГТ, однако они носят значительно менее выраженный характер, чем при острых воспалительных и некротических процессах в печени и сердечной мышце. При интоксикации ЯУХ значительно изменяется только активность АСТ через 3 часа и сутки и ГГТ через 4 недели после отравления. в ранние сроки повышение активности аминотрансфераз и ггТ может быть связано с чрезмерной активацией и повреждением эндотелия и скелетных мышц, связанным с избыточной стимуляцией холинорецепторов. После острого отравления ЯУХ наблюдается повышение ГГТ, а на сроке 4 недели этот показатель статистически значимо повышается в среднем на 30%. Известно, что ГГТ экспрессируется клетками многих органов и тканей: в печени и желчных протоках, в почках, селезенке, мозге, а также в эндотелиальных клетках, играя важнейшую роль, особенно в мозге, в переносе аминокислот из кровеносного русла [15].
Через 4 недели после отравления зоманом выявлено повышение уровня кре-атинина, свидетельствует о нарушении функции почек и/или белкового обмена в скелетных мышцах. Тенденция усиливается к 6-недельному сроку, когда наблюдается повышение уровня креатинина и мочевины. При интоксикации ЯУХ на этом сроке имеются признаки поражения эндотелия и почек: повышение активности ГГТ, а также повышение уровня мочевины в сыворотке крови.
Активность параоксоназы-1 (РОШ) достоверно снижена через сутки после отравления зоманом и имеет тенденцию к снижению при отравлении ЯУХ. Снижение активности РО№ в крови экспериментальных животных (морские свинки) после отравления зарином и зоманом отмечено в одной из недавних работ [16], хотя подавляющее большинство исследований посвящено изучению РОШ лишь в качестве потенциального «мусорщика» ФОС, т.е. как элемента токсикокинетики, а не ток-сикодинамики. Однако активность РОШ имеет значение при отравлении лишь низкотоксичными ФОС - диазоксоном, хлорпирифос-оксоном, малаоксоном [17], тогда как при отравлении более токсичным параоксоном, а тем более зарином или зома-ном физиологические концентрации РОШ неэффективны [18].
Выводы. Исследованные вещества фосфорорганической природы обладают
1501
Рис. 1. Динамика активности АХЭ в цельной крови после отравления зоманом. Данные представлены в виде Ме (5; 95 персентиль).
различными токсикокинетическими характеристиками, а потому имеют различный спектр молекулярных и клеточных мишеней, чем обусловлены различия биохимического «профиля» после острого отравления. Тем не менее, можно отметить общие тенденции изменения комплекса биохимических показателей: активность холинэстераз крови, уровень аминотрансфераз и гамма-глутамилтрансферазы являются биохимическими маркерами интоксикации в течение 1 недели после острого отравления ФОВ. Уровень креатинина и мочевины можно рассматривать как неспецифические маркеры отравления на поздних сроках острой интоксикации крыс. Повышение активности АЛТ, АСТ и ГГТ в ранние сроки интоксикации на фоне снижения активности эстераз крови может свидетельствовать о повреждении эндотелия сосудов. Полученные данные определяют дальнейшее направление наших исследований - поиск более чувствительных и специфических показателей, которые позволят более полно охарактеризовать состояние тканей и органов в период острой интоксикации ФОС и более отдаленные сроки.
///////
Рис. 3. Динамика активности БХЭ в сыворотке крови после отравления зоманом. Данные представлены в виде Ме (5; 95 персентиль)
Рис. 2. Динамика активности АХЭ в цельной крови после отравления ЯУХ. Данные представлены в виде Ме (5; 95 персентиль)
Рис. 4. Динамика активности БХЭ в сыворотке крови после отравления ЯУХ. Данные представлены в виде Ме (5; 95 персентиль)
31
32
Токсикологический вестник №4 (115)
Таблица 1
Биохимические показатели в кроввт^кры С)С0мЦов после 2-кратного введения ФОВ
Срок Холестерин, ммоль/л Триглицери-ды, ммоль/л Креатинин, мкмоль/л Мочевина, ммоль/л АЛТ, Е/л АСТ, Е/л ГГТ Е/л РОК-1, Е/л
ОБ 3 ч 2,25 (1,74; 2,73) 0,68 (0,44;1,08) 39,3 (24,77; 53,14) 7,81 (5,89;11,07) 63* (50;97) 204* (154; 317) 8,45* (6,15; 12,35) Нет данных
24 ч 2,85* (1,89; 4,55) 0,58 (0,36;1,17) 40,6 (33,8; 61,3) 6,40 (4,77;16,13) 57* (46;114) 250* (144; 699) 8,11 (6,51; 10,29) 290* (253; 382)
1 нед 2,10 (1,60; 2,78) 0,70 (0,42; 1,77) 45,8 (40,5; 57,9) 6,92 (4,80;7,80) 48 (33;62) 162 (140; 201) 7,58 (5,83; 8,99) 397 (301; 465)
2 нед 2,10 (1,60; 2,63) 0,61 (0,41; 1,17) 40,6 (32,6; 54,3) 6,28 (4,74;8,36) 43 (37;56) 180 (91; 269) 8,05 (4,75; 8,35) 428 (325; 502)
4 нед 2,10 (1,54; 2,94) 1,27 (0,62; 1,74) 51,1* (45,7; 60,5) 6,93 (5,84;9,36) 47 (37;54) 163 (139; 220) 7,76 (5,55; 9,61) 385 (278; 438)
6 нед 1,75 (1,15; 2,86) 0,85 (0,54; 1,11) 53,7* (48,3; 61,7) 9,18* (7,62;13,24) 52 (45;71) 184 (144; 220) 7,87 (3,02; 8,98) 415 (354; 518)
КОНТРОЛЬ 1,90 (1,50; 2,79) 0,82 (0,54; 1,46) 41,9 (34,0; 52,4) 6,66 (4,31;9,17) 48 (31;59) 154 (119; 205) 6,66 (6,00; 7,27) 422 (310; 489)
ИУХ 3 ч 1,70 (1,30; 2,20) 1,08 (0,72; 1,61) 30,1 (26,2; 43,3) 6,84 (4,55;9,74) 56 (39;69) 217* (196;265) 7,30 (5,69; 10,23) Нет данных
24 ч 2,10 (1,49; 2,87) 0,51 (0,29; 1,12) 39,3 (28,8; 44,5) 7,02 (4,67;8,31) 53 (43;68) 265* (153; 405) 7,87 (6,25; 9,57) 375 (247; 428)
1 нед 1,95 (1,05; 2,58) 1,06 (0,68; 1,68) 41,9 (31,4; 47,1) 6,55 (4,56;8,39) 40 (35;69) 172 (124; 283) 7,87 (6,64; 8,77) 366 (323; 550)
2 нед 1,85 (1,40; 2,82) 1,09 (0,70; 1,39) 43,2 (31,4; 51,2) 7,78 (6,71;12,55) 40 (32;58) 168 (108; 212) 7,70 (3,82; 9,79) 408 (333; 452)
4 нед 1,65 (1,30; 3,84) 1,05 (0,60; 2,00) 51,1 (25,9; 94,6) 10,08* (6,67;11,19) 46 (40;56) 184 (134; 257) 8,69* (6,57; 11,77) 409 (374; 434)
6 нед 1,55 (1,03; 2,01) 0,70 (0,34; 1,51) 44,5 (32,2; 52,7) 7,51 (4,56;8,81) 45 (34;56) 173 (137; 216) 7,01 (5,37; 8,0) 446 (260; 572)
*- различие с контролем (р<0,05)
33
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Pope C., Karanth S., Liu J. Pharmacology and toxicology of cholinesterase inhibitors: uses and misuses of a common mechanism of action. // Environmental Toxicology and Pharmacology. 2005. V19. № 3. P. 433-446.
2. Lotti M. Clinical toxicology of anticholinesterase agents in humans. // In: Handbook of Pesticide Toxicology. San Diego. Academic Press. 2001. P.1043-1085.
3. Srivastava A.K., Gupta B.N., Bihari V, Mathur N., Srivastava L.P., Pangtey B.S., Bharti R.S., and Kumar P. Clinical, biochemical and neurobehavioural studies of workers engaged in the manufacture of quinalphos // Food Chem. Toxicol. 2000. V 38. P. 65-69.
4. Lotti M. The pathogenesis of organophosphate neuropathy // Crit. Rev. Toxicol. 1992. V 21. P. 465-487.
5. Ray D.E. Organophosphorus esters: An evaluation of chronic neurotoxic effects. // Leicester. 1998. P. 62.
6. Phuntuwate W., Suthisisang C., Koanantakul B., Mackness M.I., Mackness B. Paraoxonase 1 status in the Thai population. // J. Hum. Genet. 2005. V. 50. № 6. P. 293-300.
7. Ellman G., Courtney D., Andres V A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. V. 7 P. 88-95.
8. Prall Y.G., Gambhir K.K., Ampy F.R. Acetylcholinesterase: an enzymatic marker of human red blood cell aging. // Life Sci. 1998. V 63. № 3. P. 177-184.
9. Simeon-Rudolf V, Reiner E., Evans R.T. Reversible inhibition of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase by 4,4-bipyridine and by a coumarin derivative. // Chem.-Biol. Interact. 1999. V. 119-120. P. 165-171.
10. Worek F., Koller M., Thiermann H., Szinicz L. Diagnostic aspects of organophosphate poisoning // Toxicology. 2005. V. 214. P. 182-189.
11. Li B., Sedlacek M., Manoharan I. Butyrylcholinesterase, paraoxonase, and albumin esterase, but not carboxylesterase, are present in human plasma. // Biochem. Pharmacol.
2005. V 70. № 11. P. 1673-1684.
12. Quistad G.B., Liang S.N., Fisher K.J., Nomura D.K., Casida J.E. Each lipase has a unique sensitivity profile for organophosphorus inhibitors. // Toxicol. Sci. 2006. V 91. № 1. P. 166-1172.
13. Linden J. Enhanced cAMP accumulation after termination of cholinergic action in the heart. // FASEB J. 1987. V 1. № 2. P. 119-124.
14. Buchebner M., Pfeifer T., Rathke N., Chandak P.G., Lass A., Schreiber R., Kratzer A., Zimmermann R., Sattler W, Koefeler H., Fr hlich E., Kostner G.M., Birner-Gruenberger R., Chiang K.P., Haemmerle G., Zechner R., Levak-Frank S., Cravatt B., Kratky D. Cholesteryl ester hydrolase activity is abolished in HSL-/- macrophages but unchanged in macrophages lacking KIAA1363. // J. Lipid. Res. 2010. V 51. № 10. P. 2896-2908.
15. Осадчая Л.М. Свободные аминокислоты нервной системы. // В кн. «Биохимия мозга». (Ред. Ашмарин И.П. и др.) Изд. СпбГУ 1999. С.29-56.
16. Valiyaveettil M., Alamneh Y., Rezk P., Biggemann L., Perkins M.W, Sciuto A.M., Doctor B.P., Nambiar M.P. Protective efficacy of catalytic bioscavenger, paraoxonase 1 against sarin and soman exposure in guinea pigs. // Biochem Pharmacol. 2011 Jan 8. [Epub ahead of print].
17. Jansen K.L., Cole T.B., Park S.S., Furlong C.E., Costa L.G. Paraoxonase 1 (PON1) modulates the toxicity of mixed organophosphorus compounds. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. V. 236. № 2. P. 142-153.
18. Lenz D.E., Yeung D., Smith J.R., Sweeney R.E., Lumley L.A., Cerasoli D.M. Stoichiometric and catalytic scavengers as protection against nerve agent toxicity: a mini review. // Toxicology. 2007. V. 233. P. 31-39.
Shmurak V.I., Kurdyukov I.D., Nadeyev A.D., Voitenko N.G., Glashkina L.M., Goncharov N.V. Biomarkers of intoxication by organophosphorous toxic agents
Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, Federal Medico-Biological Agency, St. Petersburg
The dynamics of a number of biochemical indicators in rat blood was studied over 6 weeks after acute intoxication by soman (CD) and a substance of VX type (RVX). It was shown that besides activity changes in «classic» markers of intoxication by organophosphorous compounds such as blood cholinesterases, additive intoxication biochemical markers at early intoxication terms can be the activity of amino transferases, gamma glutamine transferase and paraoxonase-1. The dynamics of creatinine and urea can reflect the development of delayed pathology at later stages ( 4 to 6 weeks) after acute poisoning of animals by organophosphorous componds
Материал поступил в редакцию 08.08.2011 года.
34
