CC BY
15УДК 615.9:543.632:585
Новые маркеры интоксикации фосфорорганическими соединениями в пептидной фракции плазмы крови крыс
Бабаков В.Н.1, Подольская Е.П.2, Гончаров Н.В.1, Глашкина Л.М.1, Краснов И.А.2, Поляков Н.Б.3, Войтенко Н.Г.1, Прокофьева Д.С.1, Краснов Н.В.2, Радилов А.С.1
1 НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, С.-Петербург
2 Институт аналитического приборостроения РАН, С.-Петербург
3 Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва
Выявлены низкомолекулярные пептиды плазмы крови крыс, которые могут претендовать на роль биомаркеров острой и субхронической интоксикации ФОС Обнаружен пептид с молекулярной массой 2245,1 Да SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL, который присутствовал в плазме контрольных животных и
отсутствовал в плазме крыс с острой или субхронической интоксикацией ФОС, а также через 1 месяц восстановительного периода. Идентификация пептида показала, что он является частью альфа-1-макроглобули-на плазмы крыс. Предлагаются механизм образования данного пептида в плазме контрольных крыс и возможные причины его
отсутствия в плазме отравленных животных. Кроме того, обнаружены и идентифицированы другие пептиды, которые могут быть новыми маркерами интоксикации ФОС.
Ключевые слова: фосфорор-ганические соединения, эстера-зы, пептидомика, деградомика, биомаркеры
Введение. Для мониторинга действия фосфорорганических соединений (ФОС) разработан ряд подходов, позволяющих маркировать наличие и эффект ФОС на организм [1]. Эти подходы включают определение и измерение метаболитов ФОС в моче [2], активности эстераз в плазме, эритроцитах и лимфоцитах [3,4]. В то же время, продолжается поиск новых чувствительных методов выявления биомаркеров интоксикации ФОС, не связанных с измерением активности эстераз, но позволяющих выявлять факт воздействия ФОС при ретроспективном анализе. Особое внимание уделяется выявлению нехарактерных для здорового состояния соединений, которые могут быть детектированы тем или иным способом. Например, одним из перспективных методов установления факта интоксикации в последнее время рассматривается детектирование аддуктов аминокислотных остатков белков крови с остатками ФОС [5].
Термин «биомаркер» включает в себя представление о ре-
зультате взаимодействия биологической системы с агентом окружающей среды, и применяется для обозначения биологических, биохимических и молекулярных свидетелей, которые могут быть выявлены в биологических тканях с помощью соответствующих технологий [6]. К таким соединениям могут относиться и пептиды, составляющие низкомолекулярную фракцию плазмы или сыворотки крови. Такие пептиды могут появляться или исчезать в связи с изменением активности основных протеаз крови, а низкомолекулярная фракция может быть легко получена путем осаждения белков крови. С точки зрения универсальности и чувствительности наиболее удобным методом для анализа пептидов является масс-спектрометрия. Применительно к массовому анализу наиболее адекватным представляется использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (MALDI-TOF).
Целью данной работы было выявление новых маркеров ин-
токсикации при остром и субхроническом отравлении крыс веществами фосфорорганичес-кой природы. Использовали фосфакол (пара-нитрофени-ловый эфир диэтилфосфорной кислоты, параоксон), диизо-пропилфторфосфат (ДФФ) и О-изобутил^-(2-диэтиламино-этил)метилтиофосфонат (российский VX, RVX). Через 24 часа (в остром и субхроническом эксперименте) и через 1 месяц восстановительного периода (только в субхроническом эксперименте) проводили биохимический и масс-спектромет-рический анализ плазмы крови.
Материалы и методы исследования. Исходные 1%-е растворы фосфакола, ДФФ и RVX готовили на диметилсульфок-сиде (ДМСО), затем разводили водой до необходимых концентраций. Модель подострой интоксикации крыс-самцов осуществляли однократным подкожным введением растворов фосфакола, ДФФ или RVX на уровне 1/10ЛД50. Забор крови производили чер5е0з 24 часа после введения веществ. Для моделирования субхронического
воздействия фосфакола и ДФФ крысам, разделенным на экспериментальные группы и подгруппы, ежедневно разводили указанные вещества в питьевой воде до концентраций 5х10-4 мг/ мл. Подгруппа из 5 животных примерно одного веса (200 г) ежедневно потребляла 20 мл раствора фосфакола или ДФФ, затем меняли раствор с веществом на обычную питьевую воду. Таким образом, крысы получали фосфакол и ДФФ в дозах 10-2 мг/кг (1/100 ЛД50). Для моделирования субхронического воздействия RVX ежедневно разводили указанное вещество в питьевой воде до концентраций 1х10-5 мг/мл. Подгруппа из 5 животных весом около 200 г ежедневно потребляла 20 мл раствора, затем меняли раствор с веществом на обычную питьевую воду. Таким образом, крысы ежедневно получали RVX в дозе 2х10-4 мг/кг (1/100 ЛД50). В связи с изменением массы тела животных вносили соответствующие поправки в концентрации растворов. Субхроническую интоксикацию крыс осуществляли ежедневно в течение трех недель. Затем следовал восстановительный период (1 месяц). Гепаринизи-рованную кровь получали при декапитации крыс. Форменные элементы крови осаждали центрифугированием 15 мин при 300&
Активность ацетилхолинэс-теразы (АХЭ) и бутирилхо-линэстеразы (БХЭ) в цельной крови и гепаринизированной плазме измеряли в соответствии с [7]. Активность нейротоксиэс-теразы (НТЭ) измеряли в соответствии с [8]. Статистический анализ активности ферментов проводили с помощью программы Microsoft Office Excel.
Низкомолекулярную фракцию пептидов плазмы крови крыс получали путем осаждения белков плазмы ацетонитрилом с 2% уксусной кислотой в соотношении 1:2 в течение 30 мин при 4 °С и последующим центрифугированием 30 мин при 10000 g. Осадок перерастворяли в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФУ), а нерастворившуюся фракцию из неосажденных на предыдущей стадии белков удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 10000 g. Пробу обессоливали с помощью мембраны с привитой фазой С-18, помещенной в микроколонку, после чего пептиды, которые связались с мембраной, смывали на мишень раствором 60% ацетонитрила в 0,1% ТФУ, содержащим а-циано-4-гидроксикоричную кислоту в концентрации 10 мг/мл.
Масс-спектрометрический анализ проводили с помощью масс-спектрометра Ultraflex MALDI Tof/Tof (Bruker, Германия). Детектировали положи-
тельно заряженные ионы в линейном режиме для белковых образцов и в режиме рефлек-трона для пептидов. Пептиды, претендующие на роль маркеров интоксикации ФОС, были подвергнуты МС-МС анализу, также с использованием масс-спектрометра Ultraflex. Образцы ионизировали азотным лазером с длиной волны 337 нм (энергия импульса 100 мкДж) и шириной импульса 1 нс. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения фирмы Bruker. Для всех поисков по базам данных (NCBI, SwisProt) использовали программу MASCOT (Matrix Science, http://matrixscience. com).
Результаты и обсуждение. Эстеразный статус. Основной целью работы было выявление новых маркеров интоксикации ФОС и разработка методики их детектирования. При масс-спектрометрическом поиске маркеров в пробах, полученных от крыс при острой и субхронической интоксикации, а также через месяц восстановительного периода проводили контрольный эксперимент по определению эстеразного статуса. В таблице 1 представлены данные активности эстераз крови крыс через 24 часа после острого отравления ФОС. Наиболее существенные изменения активности ферментов было отмече-
Таблица 1
Активность эстераз (мкмоль/(мл-мин)) в крови крыс через 24 часа после острой
интоксикации ФОС на уровне 1/10 ЛД50
Показатели Контроль n=4 Фосфакол n=4 ДФФ n=4 RVX n=4
НТЭ 46,25±4,31 43,23±3,09 40,09±5,02 27,8±2,66**
АХЭ цельная кровь 1,87±0,078 1,43±0,045** 1,67±0,063 1,04±0,026***
АХЭ плазма 0,73±0,046 0,64±0,021 0,78±0,037 0,61±0,028
АХЭ эритроциты 1,15±0,05 0,80±0,051** 0,90±0,065* 0,43±0,031***
БХЭ 0,16±0,013 0,11±0,008** 0,117±0,014 0,109±0,006**
Примечание: * Р< 0,05 ** Р< 0,01 *** Р< 0,001
ны при воздействии фосфакола и RVX. Разделение цельной крови на эритроциты и плазму выявило, что снижение активности АХЭ в крови обусловлено ингибированием эритроцитар-ной эстеразы. Активность НТЭ
выбрана низкомолекулярная фракция плазмы крови крыс. Каждая проба была проанализирована в отдельности, в первую очередь, сравнивали спектры внутри каждой группы (по 5 животных в каждой), выявляли сигналы, воспроизводившиеся при анализе каждой пробы, и затем проводили сравнение между группами. Таким образом, был выявлен ряд сигналов, относящихся к пептидам, предполагаемых на роль маркеров интоксикации ФОС. Результаты представлены в таблице 3. Пептиды с молекулярной массой 1667,7 Да и 1738,8 Да не вы-
достоверно снижалась только при воздействии RVX. При субхронической интоксикации в течение 1 месяца (табл. 2) было отмечено статистически достоверное, однако незначительное снижение активности эритроци-
явлены в группах животных субхронического экспонирования фосфаколом и RVX. Особую ценность представляет сигнал, соответствующий пептиду с молекулярной массой 2245,1 Да, который имеется во всех контрольных пробах, но отсутствует в спектрах проб остальных групп. Сравнивая результаты биохимического и масс-спект-рометрического анализа, можно сделать вывод, что для выявления острой интоксикации оба метода одинаково эффективны, в то время как для выявления субхронической интоксикации биохимический анализ не эф-
тарной АХЭ через 1 месяц восстановительного периода.
Масс-спектрометричес-кий поиск возможных маркеров интоксикации ФОС. Как упоминалось выше, основным объектом исследования была
фективен, а метод масс-спект-рометрии надежно детектирует сигналы, позволяющие судить о воздействии ФОС на организм.
Идентификация пептидов, предполагаемых в качестве маркеров интоксикации ФОС.
Идентификацию пептидов проводили методом тандемной масс-спектрометрии. Выяснилось, что пептиды с молекулярной массой 1667,7 Да и 1738,8 Да являются фрагментами альфа цепи фибриногена либо фибри-нопептида А (табл. 4). Пептид с молекулярной массой 2245,1 Да был идентифицирован как фрагмент а1-макроглобулина,
Таблица 2
Активность эстераз (мкмоль/(мл-мин)) в крови крыс после субхронической интоксикации ФОС на уровне 1/100 ЛД50 и через 1 месяц восстановительного периода
Показатели Контроль n=6 Фосфакол n=6 ДФФ n=6 RVX n=6
1 месяц субхронической интоксикации
НТЭ 41,6±4,73 30,9±1,45 29,5±3,11 34,4±2,82
АХЭ цельная кровь 1,79±0,028 1,87±0,065 1,81±0,062 1,94±0,072
АХЭ плазма 0,685±0,025 0,703±0,020 0,751±0,064 0,857±0,072
АХЭ эритроциты 1,11±0,027 1,17±0,070 1,06±0,033 1,08±0,033
БХЭ 0,144±0,006 0,133±0,011 0,165±0,017 0,192±0,029
1 месяц восстановительный период
НТЭ 33,3±2,30 28,9±2,20 38,4±1,32 33,3±1,91
АХЭ цельная кровь 1,87±0,066 1,73±0,036 1,76±0,065 1,69±0,067
АХЭ плазма 0,710±0,052 0,750±0,036 0,717±0,029 0,710±0,031
АХЭ эритроциты 1,157±0,050 0,984±0,066 1,047±0,048 0,952±0,126*
БХЭ 0,145±0,017 0,14±0,011 0,128±0,011 0,131±0,005
Примечание: * Р< 0,05
Таблица 3
Пептиды, отсутствующие в плазме крови крыс после острой и субхронической интоксикации различными ФОС и через 1 месяц восстановительного периода.
MH+ пептида Контроль Фосфакол ДФФ RVX
№ Острая интокс. Субхрон. интокс. Восст. период Острая интокс. Субхрон. интокс. Восст. период Острая интокс. Субхрон. интокс. Восст. период Острая интокс. Субхрон. интокс. Восст. период
1 1668,7 + + + + - + + + + + - +
2 1739,8 + + + + - + + + + + - +
3 2246,1 + + + - - - - - - - - -
Примечание: + наличие пептида; - отсутствие пептида
Таблица 4
Идентификация пептидов, претендующих на роль маркеров интоксикации ФОС.
№ Мол. Масса (Да) Счет (Mascote) Поиск в базе данных Mascot Пептид Аминокислотная последовательность
1 2245,1 104 gi|202857 а1-макроглобулин SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL
2 1667,7 82 or 80 gi|229210 or gi|71824 фибринопептид A или предшественник а цепи фибриногена DTGTTSEFIDEGAGIR or DTGTTSEFIEAGGDIR
3 1738,8 92 or 84 gi|71824 or gi|229210 предшественник а цепи фибриногена или фибринопептид A АDTGTTSEFIEAGGDIR or ADTGTTSEFIDEGAGIR
белка, который является одним из мажорных компонентов плазмы крови крыс. Поскольку данный пептид оказался специфическим маркером, ему стоит уделить особое внимание.
Пептид БГБУКРЯАР-
БАЕУЕЫТАУУЬ. Пептид SF-SYKPRAPSAEVEMTAYVL, принадлежащий а1-макро-глобулину, присутствует во всех контрольных пробах и отсутствует в экспериментальных (рис. 1). Для демонстрации были выбраны спектры проб из группы животных через 1 месяц после
«восстановительного периода», поскольку сохранение последствий интоксикации в этом периоде представляет наибольший интерес. МС-МС спектр этого пептида с определением его последовательности приведен на рис. 2. Отнесение пептида к а1-макроглобулину достаточно обосновано, поскольку величина «счета» или скоринга (обратного десятичного логарифма вероятности, вычисляемого программой Mascot) при идентификации по одному пептиду очень высока (табл. 4). Досто-
верность идентификации также подтверждается наличием большого числа a, Ь и у ионов, найденных во фрагментном спектре. Кроме того, в рамках исследования природы пептида SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL был проведен МС-МС анализ еще нескольких пептидов, обнаруженных в осажденной плазме крыс. Особого внимания заслуживают два из них, а именно: сигналы MH+ 3493,77 Да и MH+ 2359,20 Да. Идентификация данных пептидов также проведена тандемной масс-спектрометри-
Таблица 5
Аминокислотные последовательности пептидов, отнесенных к а1-макроглобулину.
Аминокислотная последовательность MH+ . Да наид., ^ MH+ Да теор, ^
SFSYKPRAPSAEVEMTAYVLLAYLTSASSRPT 3493,6 3493,7
SFSYKPRAPSAEVEMTAYVLLAYLTSASSRPT 2359,1 2359,2
SFSYKPRAPSAEVEMTAYVLLAYLTSASSRPT 2246,1 2246,1
Рис. 1. Масс-спектры пептидной фракции плазмы крови контрольных крыс и крыс после субхронической интоксикации ФОС. Отсутствие пептида SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL в плазме крови крыс после субхронической интоксикации ФОС.
Ось ординат - относительная интенсивность сигнала, ось абсцисс - отношение массы к заряду (m/z). a - Контроль (наличие пептида с MH+ 2246,110 Да в пептидной фракции плазмы крови), b - интоксикация фосфаколом, c - интоксикация ДФФ, d - интоксикация RVX.
Рис. 2. Масс-спектр пептида SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL с MH+ 2246,1 Да, полученный тандемной масс-спектрометрией, и определение его последовательности.
ей (данные не представлены). При поиске в базах данных оба указанных пептида были отнесены к а1-макроглобулину, причем пептид с меньшей массой является частью пептида с большей массой, а ранее идентифицированный пептид с массой 2245,1 Да является частью обоих пептидов (табл. 5). Пептид с MH+ 3493,7 Да и аминокислотной последовательностью S FSYKPRAPSAEVEMTAYVL LAYLTSASSRPT присутствует во всех пробах, тогда как два остальных пептида с молекуляр-
ной массой 2245,1 и 2358,1 Да -только в пробах, полученных от крыс после воздействия на них ФОС (рис.1).
Мы предполагаем, что на основной пептид воздействует некая протеаза, либо до забора крови, либо в период от забора крови до осаждения белков плазмы. С помощью программ, рассчитывающих теоретический ферментолиз (Protein Prospector), было определено, что подобной активностью может обладать хи-мотрипсин (рис. 3). На рисунке
подчеркнуты места возможного разрыва аминокислотной цепи исследуемого пептида при действии предполагаемого фермента.
После получения первичных результатов мы стали искать другие сигналы, подтверждающие прохождение деградации пептидов крови по химотрипти-ческому механизму.
Еще один пептид с последовательностью SFSYKPRAPSAEVEMTAY 2033,9 Да), являющийся частью всех трех пептидов, так-
Рис. 3. Аминокислотная последовательность пептида с MH+ 3493,7 Да с указаниями сайтов разрыва цепи при действии химотрипсина.
SFSYKPRAPSAEVEMTAYVLLAYLTSASSRPT
Рис. 4. Пептиды, принадлежащие а1-макроглобулину, которые могут появляться в результате химотрипсин-подобной активности в плазме крови крыс. Идентифицированные тандемной масс-спектрометрией пептиды отмечены жирным шрифтом. Обычным шрифтом отмечены другие пептиды, которые, возможно, принадлежат а1-макроглобулину.
же был найден в спектрах контрольных проб и отсутствовал в экспериментальных. На рисунке 4 отмечены все идентифицированные пептиды в плазме крови крыс.
В норме химотрипсин в крови отсутствует, кроме как в состоянии острого панкреатита. Тем не
менее описаны протеазы, проявляющие химотрипсин-подобную активность в крови, например, химаза и катепсин G, источником которых являются тучные клетки [9, 10]. Их основными мишенями являются ингибитор а, ангиотензин 1, белки внеклеточного матрикса, интерлейкин 1р
и а2-макроглобулин [11-15]. При рассмотрении экспериментальных данных следует учитывать, что а1-макроглобулин является основным макроглобулином плазмы крови крыс, его концентрация составляет 2-4 мг/ мл, тогда как концентрация а2-макроглобулина - менее чем 50
мкг/мл [13, 14]. В плазме крови человека а1-макроглобулин отсутствует [14], а концентрация а2-макроглобулина человека близка по величине к концентрации а1-макроглобулина крысы в плазме крови. Предполагается, что два упомянутых макроглобулина выполняют аналогичные функции в кро-
ви человека и крысы [15]. Поиск предполагаемой маркерной протеазы - задача для дальнейшей работы.
Заключение. Основным результатом проведенной работы с экспериментальными животными является выявление и идентификация пептида SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL,
относящегося к а1-макрогло-булину крыс и являющегося возможным маркером интоксикации ФОС. Кроме того, идентифицированы некоторые пептиды, которые могут претендовать на роль маркеров интоксикации для каждого из исследуемых отравляющих веществ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Maroni M., Colosio C., Ferioli A., Fait A. Biological Monitoring of Pesticide Exposure: a review. Introduction. // Toxicology. - 2000. - V. 143. - P. 5-118.
2. Coye M.J., Lowe J.A., Maddy K.J. Biological monitoring of agricultural workers exposed to pesticides: II.Monitoring of intact pesticides and their metabolites. // J. Occup. Med. -1986. - V. 28.
- P. 628-636.
3. Carlock L.L, Chen W.L, Gordon E.B, et al. Regulating and assessing risks of cholinesterase-inhibiting pesticides: divergent approaches and interpretations. // J. Toxicol. Environ. Health. Part B. - 1999. - V. 2.
- P. 105-160.
4. Cocker J., Mason H.G, Garfitt S.J., Jones K. Biological monitoring of exposure to organophosphate pesticides // Toxicol. Lett. - 2002. -V. 134. - P. 97-103.
5. Подольская Е.П., Бабаков В.Н. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в токсикологическом анализе. // Научное приборостроение. - 2008. - Т. 18. - № 4. - С. 5-12.
6. Costa L.G. Basic toxicology of pesticides // Occup. Med. - 1997.
- V. 12. - P. 251-268.
7. Ellman G.L. Courtney K.D., Andres V. Jr, Feather-Stone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. // Biochem. Pharmacol. - 1961. - V. 7. - P. 88-95.
8. Johnson M.K. The delayed neurotoxic effect of some organophosphorus compounds. Identification of the phosphorylation site as an esterase. // Biochem. J. - 1969. - V. 114. - P. 711-717.
9. Bísaro de Lorenc L., Ramos A.M., Sánchez M.C., Montenegro R., Chiabrando G.A. Structural evaluation of plasma alpha2-macroglobulin in acute pancreatitis. // Clin. Chem. Lab. Med. - 2005. - V. 43. - P. 11831189.
10. Bacani C., Frishman W.H. Chymase: a new pharmacologic target in cardiovascular disease. // Cardiol. Rev. - 2006. - V. 14. - P. 187-193.
11. Schoenberger O.L., Sprows J.L., Schechter N.M., Cooperman B.S., Rubin H. Limited proteolysis of C1-inhibitor by chymotrypsin-like proteinases. // FEBS Lett. - 1989. - V. 259. - P. 165-167.
12. Doggrell S.A., Wanstall J.C. Vascular chymase: pathophysiological role and therapeutic potential of inhibition. // Cardiovasc. Res. - 2004. - V. 61. - P. 653-662.
13. Sottrup-Jensen L., Sand O., Kristensen L., Fey G.H. The alpha-macroglobulin bait region. Sequence diversity and localization of cleavage sites for proteinases in five mammalian alpha-macroglobulins. // J. Biol. Chem. - 1989. - V. 264. - P. 15781-15789.
14. Lonberg-Holm K., Reed D.L., Roberts R.C., Hebert R.R., Hillman M.C., Kutney R.M. Three high molecular weight protease inhibitors of rat plasma. Isolation, characterization, and acute phase changes. // J. Biol. Chem. - 1987. - V. 262. - P. 438-445.
15. Tsuji A., Akamatsu T., Nagamune H., Matsuda Y. Identification of targeting proteinase for rat alpha 1-macroglobulin in vivo. Mast-cell tryptase is a major component of the alpha 1-macroglobulin-proteinase complex endocytosed into rat liver lysosomes. // Biochem. J. - 1994. - V. 298. - P. 79-85.
Babakov V.N.1, Podolskaya Ye.P.2, Goncharov N.V.1, Glashkina L.M.1, Krasnov I.A.2, Polyakov N.B.3, Boitenko N.G.1, Prokofieva D.S.1, Krasnov N.V.2, Radilov A.S.1
New markers of intoxication by organophosphoric compounds in the peptide fraction
of the rat blood plasma
1 Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology of St. Petersburg 2Institute of Analytical Instrumentation, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg
3 Academicians M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow
Were revealed low-molecular peptides in the rat blood plasma which may claim to serve biomarkers of acute and sub-chronic intoxication by organophosphoric compounds (OPhC) . A peptide SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL was found out with a molecular weight of 2245.1 Da which was present in the plasma of the animals control group and was absent in the plasma of rats suffering from acute or sub-chronic intoxication by OPhC as well as a month later during the recovery period. The identification of the peptide showed that it is a part of the rat plasma alpha-1-macroglobulin. A mechanism of formation of the said peptide in plasma of control rats is suggested as well as possible causes of its absence in the plasma of poisoned animals. Besides, other peptides which also may serve as new markers of intoxication by OPhC were revealed and identified.
Переработанный вариант статьи поступил в редакцию 25.02.2010 г.
