CC BY
149
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
Мурашко Е.А1., Дубровский Я.А.123, Бабаков В.Н.1
АДДУКТЫ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ С БЕЛКАМИ КРОВИ КАК МАРКЁРЫ ОТРАВЛЕНИЯ (ОБЗОР)
1ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский 2Санкт-Петербургский государственный университет, Институт химии,
198504, г. Санкт-Петербург; 3Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург
Представлен обзор современных аналитических методик, направленных на определение различных биомаркеров отравления фосфорорганическими соединениями, подходов к идентификации, обогащению и количественному определению аддуктов фосфорорганических отравляющих веществ с холинэстеразами, сывороточным альбумином и другими белками крови. Сочетание информации, полученной при анализе нескольких аналитов, позволяет достоверно устанавливать факт отравления фосфорорганическими соединениями.
Ключевые слова: химическое оружие; фосфорорганические отравляющие вещества;
аддукты белков; ацетилхолинэстераза; бутирилхолинэстераза; реактивирование; алкилметилфосфоновые кислоты; масс-спектрометрия.
Для цитирования: Мурашко Е.А., Дубровский Я.А., Бабаков В.Н. Аддукты фосфорорганических отравляющих веществ с белками крови как маркёры отравления (обзор). Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(1): 124-139.
Для корреспонденции: Мурашко Екатерина Александровна, научный сотрудник лаборатории молекулярной токсикологии и экспериментальной терапии ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский. Е-mail: [email protected]
Murashko E.A.1, Dubrovskii Ya.A.123, Babakov V.N.1
PROTEIN ADDUCTS WITH ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS AS BIOMARKERS OF EXPOSURE
Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, Federal Medical Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation
2St. Petersburg State University, Institute of Chemistry, St. Petersburg, Russian Federation
3Research and Training Center of molecular and cellular technologies of SPCPU, St. Petersburg, Russian Federation
Review of modern analytical methods of identifying various biomarkers of organophosphorus compounds poisoning, approaches to the identification, enrichment and quantitative determination of ad-ducts of organophosphorus toxicants with cholinesterase, serum albumin and other blood proteins. Combination of data obtained from different analytes, allows reliable establishment of the fact ofpoi-soning with organophosphorus compounds.
Keywords: chemical weapon, organophosphorus compounds, protein adducts, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, reactivation, alkyl methylphosphonic acids, mass spectrometry.
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
For citation: Murashko E.A., Dubrovskii Ya. A., Babakov V.N. Protein adducts with organophosphorus compounds as biomarkers of exposure (review). Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations, Russian journal) 2019; 21(1): 124-139. (In Russ.).
For correspondence: Ekaterina A. Murashko, Researcher, Laboratory of Molecular Toxicology and Experimental Therapy of Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology Federal Medical and Biological Agency,bld 93, Kapitolovo station, Kuzmolovsky, Vsevolozhsky District, Leningrad Region, 188663, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received: February 5, 2019 Accepted: February 21, 2019
В 1993 г. мировым сообществом была подписана «Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении». Контроль за соблюдением Конвенции осуществляется международной Организацией по запрещению химического оружия (ОЗХО), находящейся в Гааге (Нидерланды). Уничтожение химического оружия проводилось в течение нескольких десятилетий в ряде стран и все еще продолжается в США. Масштабность процесса уничтожения, вовлечение большого контингента лиц требовала разработки методик биологического мониторинга, который обязательно включает установление факта отравления человека химическим оружием (ХО) с применением современных методов аналитической химии. Многие пестициды, широко применяемые в сельском хозяйстве, также относятся к фосфороргани-ческим соединениям, их действие на организм человека аналогично действию фосфороргани-ческих отравляющих веществ (ФОВ), применяемых в военных целях [1].
В статье представлен обзор современных аналитических подходов для установления факта отравления ФОВ.
К химическому оружию относятся фосфор-органические вещества, являющиеся нервно-паралитическими ядами. Первая серия таких соединений была разработана перед Второй мировой войной и имеет название G-газы. Представителями этой группы газов являются: табун ^А - впервые синтезирован в 1936 г. Герхардом Шрадером), зарин ^В), зоман (GD) и циклозарин (GF). Позднее была разработана У-группа нервно-паралитических газов: УХ, "УЯ, СУХ. Нервно-паралитические агенты
чрезвычайно токсичны, средняя летальная доза (LD50) для человека составляет: 4000 мг для табуна; 1700 мг для зарина; 300 мг для зомана, 10 мг для УХ [2].
Основным механизмом токсичности ФОВ является ингибирование ацетилхолинэстеразы. Данный фермент участвует в гидролизе ацетил-холина, накопление данного нейротрансмитте-ра приводит к возникновению таких биологических эффектов, как головные боли, головокружение, слюноотделение, слезотечение, диарея, тремор, брадикардия, судороги, кома и даже смерть [3, 4].
Определение фосфорорганических соединений в биопробах остается актуальной задачей, так как в мире широко используются фос-форорганические инсектициды и присадки к маслам [1].
Одним из главных путей биотрансформации ФОВ является связывание с холинэстера-зами (ХЭ) крови: ацетилхолинэстеразой (АХЭ) и бутирилхолинэстеразой (БХЭ). Воздействие ФОВ сопровождается быстрым образованием ковалентной связи между атомом фосфора молекулы ФОВ и серином активного центра холинэстераз: в случае ацетилхолинэстеразы с серином-203, бутирилхолинэстеразы - с сери-ном-198. Аддукт ХЭ с ФОВ является специфическим и долгоживущим маркером отравления. Следует отметить, что коньюгаты холинэстераз с ФОВ подвержены процессу спонтанного деал-килирования - старению, при этом образуется аддукт ХЭ, модифицированный остатком ме-тилфосфоновой кислоты, одинаковый для всех ФОВ на основе метилфосфоновой кислоты. Как следствие, теряется информация о структуре ФОВ. По рекомендациям международных
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Гидролиз
О
Р R2
НзС01/°\
^Р"^ R
I
ОН
АМФК
Экстракция
ФОВ
Фосфонилирование о
белков Я1\П<_...'0\ Реактивация
Аддукты белков с ФОВ
R2 Старение ,
-► I
VJLOH
I
он
АМФК
о
Р R2
ФОВ
О
Р R2
w
Деалкилированные
Аддукты альбумина
Рис. 1. Пути биотрансформации ФОВ и возможные биомаркеры отравления.
экспертов ОЗХО для успешного установления факта отравления необходимо определять несколько биомаркеров. Сочетание информации, полученной в ходе анализа различных анали-тов, позволяет нивелировать недостатки каждого из отдельных биомаркеров. Так, тип нервного агента может быть определен в ходе анализа свободных ФОВ, полученных с помощью реактивации аддуктов белков с ФОВ (рис. 1).
Молекулы фосфорорганических соединений могут образовывать аддукты не только с серином холинэстераз, но также с такими аминокислотами, как тирозин, лизин, гистидин и цистеин. При воздействии высоких концентраций ФОВ образуются аддукты с сывороточным альбумином [5-7] и другими белками (тубули-ном, кератином) [8, 9]. В данном случае биомаркерами отравления являются соединения,
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
получаемые в ходе ферментативного гидролиза фосфонилированных белков: модифицированный тирозин, пептиды, содержащие модифицированную аминокислоту (см. рис. 1). Аддукты белков крови с ФОВ являются долго-живущими маркерами отравления, БХЭ имеет времяполужизни 11 сут, сывороточныйальбумин 20-25 сут [10], аддукты с АХЭ эритроцитов потенциально могут сохраняться на протяжении всего времени жизни эритроцитов - до 100 сут после отравления.
Основной путь выведения метаболитов ФОВ из организма - экскреция с мочой (см. рис. 1) в течение нескольких дней. Алкилметилфосфо-новые кислоты являются метаболитами нервных агентов: О-изопропилметилфосфоновая кислота - метаболит зарина; О-изобутил-метилфосфоновая кислота - зомана; О-пина-колилметилфосфоновая кислота - УХ.
Установление факта воздействия нервных агентов при анализе остаточного количества ФОВ в биопробах практически нереализуемо в силу ограниченной стабильности и высокой реакционной способности данных соединений. Следовательно, для ретроспективного химико-токсикологического анализа необходимо использовать метаболиты и аддукты с высокомолекулярными соединениями, которые возникают в процессе биотрансформации ФОВ в организме [11].
Определение активности холинэстераз
Холинэстеразы - семейство ферментов, которые катализируют гидролиз нейротранс-миттера ацетилхолина до холина и уксусной кислоты, что является важнейшим процессом, необходимым для жизнедеятельности холинэр-гических нейронов.
Одним из основных признаков отравления ФОС считается ингибирование холинэстераз. Определение уровня активности холинэстера-зы имеет решающее значение для ранней диагностики отравления ФОВ, а также для мониторинга терапевтического действия применяемых реактиваторов (антидотов).
Классическим методом определения активности ферментов является метод Эллмана [12] и его модификации [13, 14]. В основе метода лежит фотометрический анализ реакции тио-
холина с дитиобиснитробензоат-ионом, в качестве субстрата используют ацетилтиохолин для АХЭ, бутирилтиохолин для БХЭ, хромогеном служит 5,5-дитиобис-(2-нитробензойная) кислота. Однако известно, что метод Эллмана имеет ряд недостатков: низкая чувствительность -невозможно определить степень ингибирова-ния ниже 20%; низкая селективность - снижение активности ХЭ может быть связано не только с наличием ингибиторов, но и с рядом заболеваний. Популяционные различия уровней ХЭ в крови человека могут сильно варьироваться. Следовательно, метод Эллмана является нерепрезентативным в случае низкой дозы отравления человека без ранее проведенных измерений индивидуального уровня активности ХЭ. Другие ограничения метода Эллмана связаны с нестабильностью наборов во времени и высокими фоновыми значениями вследствие взаимодействия реагентов с свободными сульфгидрильными группами в биологических образцах [15]. Также стоит отметить, что для определения уровня активности АХЭ методом Эллмана необходимо проводить дополнительную процедуру пробоподготовки - выделение теней эритроцитов. Прямое определение АХЭ в крови сильно затруднено из-за присутствия гемоглобина, который имеет высокую степень абсорбции при 412 нм [13], поэтому обычно активность АХЭ в цельных эритроцитах определяют методом Хёстрина.
Ряд методов, таких как потенциометриче-ский, титриметрический, флуориметрический и другие, также используются для скрининга активности холинэстеразы. Применяемые методы были систематически обобщены в обзоре Holas и соавт. [16].
Методы масс-спектрометрии успешно могут быть применены для определения активности холинэстераз. Sun и Lynn в своих работах разрабатывали метод идентификации и количественной оценки ингибирования БХЭ методом МАЛДИ и ЖХ-МС/МС на модельной системе, используя БХЭ лошади и пестициды в экспериментах in vitro [17,18]. Уровни ингибирования менее 3% были определены для БХЭ лошади с использованием нормализованных соотношений, которые рассчитывали путем деления соотношений содержания модифицированного
127
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
О О О
Н2 || О
он Р АСИЕ Р АСИЕ
АСИЕ - нх 1
О"
т Деалкилированный
ФОВ Аддукт АХЭ с ФОВ аддукт АХЭ
Рис.2. Образование ковалентной связи между молекулой ФОВ и серином активного центра холинэстераз.
или немодифицированного пептида на общее содержание всех пептидов, содержащих активный сайт [17]. Тот же подход нормализации был использован для АХЭ ската Е1ес1гор^гт е1ес1пст, обработанной зарином или УХ. Низкий уровень ингибирования АХЭ (около 1%) определяли методом ЖХ-МС/МС [19].
Для оценки степени ингибирования БХЭ с помощью масс-спектрометрии можно применять соотношение модифицированного к ин-тактному пептиду БХЭ [20]. В основе метода лежит количественное определение нонапеп-тида FGESAGAAS, модифицированного ФОВ, методом ВЭЖХ-МС/МС. Для определения ин-гибирования БХЭ в одну пробу вносят избыток ФОВ, площадь пика нонапетида принимают за 100%. Ингибирование БХЭ в образцах, содержащих разное количество ФОВ, определяют по соотношению площади пика пептида в данном образце к площади пика при 100% ингибиро-вании. Такой подход имеет ряд преимуществ: высокая чувствительность - возможность определения ингибирования БХЭ при низких дозах ФОВ; возможность установления ингибирования БХЭ без знания уровня активности фермента до экспозиции.
Определение аддуктов ФОВ с ацетилхолинэстеразой
Ацетилхолинэстераза (ЕС 3.1.1.7; Р22303) известна как эритроцитарная холинэстераза, так как сохраняет активность в клеточной массе после разделения компонентов крови. АХЭ участвует в холинэргической передаче нервного сигнала и экспрессируется в нервных клетках и эритроцитах. Активный сайт АХЭ, как и вся структура АХЭ, эволюционно консервати-
вен и содержит последовательности, общие для класса сериновых гидролаз [21]. Каталитический домен АХЭ представлен триадой Ser-203, His-447, Ии-334.
АХЭ в основном находится в виде тетрамера G4, но может образовывать и димеры G2, которые секретируются как водорастворимые молекулы [22]. Мономер АХЭ имеет молекулярный вес 69 кДа [23].
Механизм образования аддукта представлен на рис. 2. Молекула ФОВ атакует гидрокси-группу серина активного центра АХЭ с образованием ковалентной Р-0 связи, при этом случае зарина и зомана в качестве уходящей группы Х выделяется фторид-анион; табуна-цианогруппа; УХ-тиольная группа [2]. Аддукт АХЭ с ФОВ является специфическим и долгоживущим маркером отравления.
Главным недостатком аддуктов ХЭ с ФОВ является то, что данные коньюгаты подвержены дальнейшей трансформации - процессу деал-килирования или старения. При этом теряется информация о структуре ФОВ, присоединенного к активному центру, в результате образуется аддукт с остатком метилфосфоновой кислоты, идентичный для зарина, зомана и УХ [19]. Изучение механизмов процесса старения очень важно. Известно, «состарившийся» фермент не способен к реактивации, что затрудняет проведение антидотной терапии [24]. Процесс старения аддуктов АХЭ с различными ФОВ может протекать по разным механизмам: с разрывом С-О-связи в случае с зарина и зомана [25], и Р-Ы связи в случае табуна [26]; и с разными скоростями.
Аддукты АХЭ с зарином были исследованы в качестве маркера отравления ФОВ при рас-
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
следовании теракта в токийском метро 20 марта 1995 г., в котором пострадало более 5000 человек, 12 человек погибли. Nagao и соавт. в своей работе определяли продукты гидролиза зарина -изопропилметилфосфоновую и метилфосфоно-вую кислоту, полученные при ферментативном гидролизе АХЭ, методом ГХ-МС [27]. Сначала для выделения АХЭ из крови получали тени эритроцитов, которые затем растворяли в трис-HCl-буфере с 1 % детергентом CHAPS, образовавшаяся фракция белков содержит более 90% АХЭ. Фосфонилированную АХЭ подвергали последовательному ферментативному гидролизу в присутствии трипсина и щелочной фосфа-тазы. Щелочная фосфатаза способна гидроли-зовать эфиры как фосфорной, так и метилфос-фоновых кислот. Однако получение продуктов гидролиза остатка зарина, присоединенного к серину активного центра АХЭ, затруднено из-за конформационных особенностей молекулы белка. Для решения этой проблемы был проведен трипсинолиз фосфонилированной АХЭ. В результате ферментативного гидролиза получается пептид, состоящий из 41 аминокислотного остатка, содержащий модифицированный серин активного центра. Образовавшийся пептид гидролизовали щелочной фосфатазой. В результате были получены продукты гидролиза зарина, которые после дериватизации анализировали методом ГХ-МС.
Долгое время работ по определению аддук-тов АХЭ не было, несмотря на то, что АХЭ является главной мишенью при отравлении ФОВ. Это связано с низкой концентрацией данного фермента в крови (0,5 мкг/мл), трудоемким процессом выделения белка из эритроцитов. Однако в последние годы все больше ученых занимаются анализом аддуктов АХЭ с ФОВ при исследовании антидотов, изучении кинетики процессов ингибирования, старения и реактивации [28-30].
В работе L. Yan и соавт. предложен ЖХ-МС/ МС-метод для определения аддуктов АХЭ с зарином и VX [19] Для модельных экспериментов использовали АХЭ ската Electrophorus electricus. В качестве биомаркеров были выбраны пептиды GESAGAASVGM, полученные в результате ферментативного гидролиза в присутствии пепсина, модифицированные
остатком зарина c m/z 1056 или остатком VX c m/z 1042, а также остатком метилфосфоновой кислоты (состарившиеся аддукты) с m/z 1014. Разработанный метод позволяет обнаруживать аддукты АХЭ с ФОВ при уровне ингибирова-ния фермента менее 1 %. Авторы использовали свой подход для оценки степени ингибирования АХЭ, а также для исследования действия типичных реактиваторов АХЭ (HI-6, обидоксим и пралидоксим) и расчета EC50 этих соединений.
Использование эффективных и специфических методов выделения и очистки АХЭ делает возможным использование аддуктов АХЭ с ФОВ в качестве биомаркеров. В первую очередь, это метод иммунопреципитации [29]. В качестве сорбентов используют микросферы с привитыми антителами к АХЭ. Антитела HR2 были успешно использованы при выделении АХЭ из теней эритроцитов [31]. В работе Dafferner и соавт. представлены сравнительные результаты для сорбентов с 6 разными антителами: коммерчески доступными AE-1, AE-2, HR2 и новыми моноклональными антителами 1G, 6A, 10D. Показано, что все исследованные антитела могут быть использованы для выделения АХЭ, в том числе и модифицированной зоманом, из эритроцитов, без стадии выделения теней эритроцитов. Аффинная хроматография может быть успешно использована для выделения АХЭ [30]. Недавно синтезированный аффинный сорбент на основе хуприна (Хупрезин, Hupresin, CHEMFORASE) находит все более широкое применение. Хупрезин дешевле сорбентов с привитыми антителами, а также является регенерируемым [32], что, безусловно, делает его привлекательным для выделения АХЭ. В работе Onder и соавт. [30] показано, что использование данного сорбента позволяет выделить АХЭ в количестве, достаточном для успешного проведения масс-спектрометрического анализа при установлении факта отравления зоманом.
Определение аддуктов ФОВ с бутирилхолинэстеразой
Бутирилхолинэстераза (EC 3.1.1.8; P06276) представляет собой тетрамерный гликопротеин массой 340 кДа, масса отдельной субъединицы 85 кДа. Несмотря на то, что фермент известен с 40-х годов XX века, 3D-структура тетрамера
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
БХЭ человека была точно описана российскими учеными лишь в 2018 г. [33]. БХЭ синтезируется в печени и имеет период полужизни в плазме крови 11 дней. Содержание бутирил-холинэстеразы в плазме крови человека около 4 мкг/мл [34]. Хотя БХЭ широко представлена в теле человека, ее физиологические функции долгое время были не ясны. Индивидуумы с дефектами БХЭ не проявляют значительных признаков заболевания [35]. В настоящее время основной физиологической функцией БХЭ считают гидролиз гормона голода октаноил-грелина до неактивных продуктов, таким образом, фермент играет роль в регуляции аппетита [36]. БХЭ способна нейтрализовать большое количество экзогенных агентов: прокаин [37], сукцинилхолин [38], кокаин [39], героин, ацетилсалициловую кислоту, также она может защитить организм от воздействия фосфорорганических ингибиторов АХЭ [40, 41]. Рекомбинантный фермент БХЭ рассматривается как перспективный антидот при отравлениях ФОВ [34].
Аддукты БХЭ с ФОВ чаще всего используют в качестве биомаркера при установлении факта экспозиции ФОВ [42]. Механизм связывания БХЭ с ФОВ идентичен АХЭ (рис.2). Как и аддукты АХЭ, аддукты БХЭ с ФОВ подвержены процессу спонтанного деалки-лирования - старению [43]. В качестве анали-та при определении аддуктов БХЭ с ФОВ используют нонапептид, содержащий серин-198, получаемый при ферментативном гидролизе пепсином, FGESAGAAS, который затем анализируют методами ВЭЖХ-МС или МАЛДИ масс-спектрометрией. Основной проблемой проведения анализа является необходимость очистки БХЭ от других белков плазмы крови, присутствующих в высокой концентрации.
Бутирилхолинэстеразу выделяют из плазмы крови, это более удобная для работы биоматрица, чем цельная кровь, которая необходима для выделения АХЭ. Наиболее распространенными методами выделения БХЭ являются аффинная хроматография на прокаинамидном геле [44, 45] и иммунопреципитация на микросферах с привитыми антителами [46-48].
В работе Н. Li и соавт. представлена оптимизированная методика выделения БХЭ из небольшого объема плазмы с использованием
прокаинамидного геля [44]. Такой подход позволил получить образцы БХЭ из плазмы крови, достаточные для определения аддуктов с пестицидами методом масс-спектрометрии. Однако следует отметить, что для увеличения чувствительности определения пептидов, получаемых при ферментативном гидролизе аддуктов БХЭ с ФОВ, частично очищенной из плазмы крови, могут применяться дополнительные методы концентрирования, такие как твердофазная экстракция и металл-аффинная хроматография [49].
В настоящее время используют недавно полученный Brazzolotto и соавт. [50] и уже коммерчески доступный сорбент для выделения БХЭ на основе хуприна. Чистота БХЭ, выделенной на прокаинамид-сефарозе, составляет 3-8%, в то время как чистота белка при использовании сорбента Hupresin составляет 54-90% [34].
Другим подходом для выделения БХЭ из плазмы крови является использование сорбентов с привитыми антителами. Впервые такой метод очистки БХЭ для определения аддук-тов БХЭ с ФОВ описан в работе Sporty и соавт. [46]. Авторы использовали антитела к БХЭ клона 3Е8 на ферромагнитных микросферах, покрытых белком G (Protein G). Полученные образцы анализировали методом ВЭЖХ-МС. В результате авторам удалось выделить пептиды, входящие в состав немодифицированной БХЭ, с пределом обнаружения 0,42 нг/мл, и фосфонилированной БХЭ: 0,35 нг/мл в случае зарина, 4,0 нг/мл -циклозарин, 2,5 нг/мл-VX, 1,0 нг/мл - VR. Протокол, предложенный в данной работе, многие лаборатории используют при прохождении профессиональных тестов ОЗХО, а также при расследовании атаки с применением зарина в Сирии в 2013 г [42].
В последние годы появились работы с оптимизированными протоколами иммунопреци-питации БХЭ. Так, в работе Я.А. Дубровского и соавт. [47] для определения аддуктов БХЭ c VR использовали сорбент, где антитела были привиты на эпоксиактивированные магнитные микросферы. При таком подходе, БХЭ элю-ируется с сорбента 0,6% водным раствором муравьиной кислоты. Следовательно, образец не загрязнен продуктами гидролиза белка G, а сорбент может быть использован повторно.
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
Масс-спектрометрические характеристики пептидов БХЭ, модифицированных ФОВ
Определяемое соединение Переход в режиме мониторинга множественных реакций
Нонапептид (нативная форма) FGESAGAAS 796,3^778,4; 673,3; 602,3
Деалкилированный нонапептид, модифицированных по серину FGES(MPA)AGAAS 874,2^778,4; 673,3; 602,3
Нонапептид, модифицированный по серину остатком фосфорной кислоты FGES(PA)AGAAS 876,2^778,4; 673,3; 602,3
Нонапептид, модифицированный по серину остатком зомана FGES(PinacolylMPA)AGAAS 958,4^778,4; 673,3; 602,3
Нонапептид, модифицированный по серину остатком зарина FGES(IsopropylMPA)AGAAS 916,4^778,4; 673,3; 602,3
Нонапептид, модифицированный по серину остатком RVX FGES(IsobuthylMPA)AGAAS 930,4^778,4; 673,3; 602,3
Низкий рН пробы оптимален для проведения ферментативного гидролиза в присутствии пепсина. Такой вариант выделения БХЭ с последующим ВЭЖХ-МС/МС-анализом позволяет определять факт экспозиции с VR в биопробах с пределом обнаружения около 1 нг/мл в плазме крови (по аддукту с БХЭ) и при менее 5 % ингибировании БХЭ. Данный подход был реализован и для аддуктов БХЭ с зарином, зо-маном, масс-спектрометрические характеристики определяемых аналитов в режиме мониторинга множественных реакций представлены в таблице [31].
В статье M. Bonichon и соавт. представлен разработанный «online» метод иммуноэкстрак-ции и ферментативного гидролиза в сочетании с микроЖХ-МС/МС для анализа аддуктов БХЭ с зарином и зоманом в плазме крови человека [48]. Авторы оптимизировали метод выделения БХЭ путем исследования различных антител (mAb2, 3E8 и B2 18-5), привитых на сефарозу. Эффективность сорбентов оценивали, как отношение количества нонапетида, полученного в результате иммуноэкстракции и пепсиноли-за к количеству нонапептида при теоретическом 100% выходе этих процессов. Выход реакции выделения БХЭ составил: 90-100% для mAb2SP и B2 18-5Sp; 60% для 3E8SP.
Процедура выделения и анализа БХЭ была апробирована при анализе плазмы крови, инкубированной с зарином и зоманом. В режи-
ме мониторинга множественных реакций при масс-спектрометрическом анализе были детектированы: нативный пептид (m/z 796,3 ^ 602,3); пептид, модифицированный остатком зарина (m/z 916,4 ^ 602,3); пептид, модифицированный остатком метилфосфоновой кислоты (состарившийся аддукт; m/z 874,3 ^ 602,3). Известно, что скорость старения аддуктов БХЭ с зоманом очень высокая, а, следовательно, наиболее интенсивным был сигнал нонапепетида, модифицированного остатком метилфосфоно-вой кислоты (m/z 874,3 ^ 602,3), сигнал нона-петида, модифицированного остатком зомана также был детектирован (m/z 958,3 ^ 602,3).
Для оценки эффективности своего подхода, авторы сравнили свой метод выделения БХЭ на сорбентах с привитыми антителами с выделением с помощью широко применяемой аффинной хроматографии на прокаинамидном геле и недавно разработанном сорбенте Hupresin. Показано, что описываемый подход в 10 раз более эффективный, чем экстракция на Hupresin, использование прокаинамидного геля является наименее эффективным.
Следует отметить, что практически все методики определения аддуктов ФОВ с ХЭ основаны на целевой масс-спектрометрической детекции пептического нонапептида - активного центра холинэстераз. На данный момент отсутствует процедура обзорного анализа ад-дуктов холинэстераз с фосфорорганическими
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
соединениями и карбаматами. Перспективным направлением может быть использование менее распространенной фрагментацией пептида, вызванной переносом электрона [51], которая в отличие от общепринятой фрагментации, вызванной столкновением, позволяет получить массу модифицированного серина. Подобный подход продемонстрировал эффективность в определении аддуктов с сывороточным альбумином [52].
Определение аддуктов ФОВ с другими белками
При высоких концентрациях ФОВ могут связываться не только с холинэстеразами, но и с другими белками. Работы, посвященные использованию аддуктов белков с ФОВ в качестве биомаркеров, были подробно рассмотрены в обзоре Marsillach и соавт. [1]. Альбумин является одним из основных белков крови, концентрация составляет около 50 мг/мл. Альбумин синтезируется и секретируется в печени, время полужизни составляет 20-25 дней. Преимущественно, ФОВ ковалентно модифицируют альбумин по тирозину-411. Аддукты альбумина с ФОВ имеют ряд преимуществ в качестве биомаркера отравления: высокая концентрация белка в крови; простота выделения белка; аддукты с ФОВ не подвержены процессу старения, а, следовательно, можно установить тип применённого ФОВ; возможность анализа ад-дуктов после проведения терапии антидотами [53]. В качестве аналитов выступает либо пептид, содержащий тирозин, модифицированный остатком ФОВ [5-7], либо модифицированный тирозин [53, 54], полученные в ходе ферментативного гидролиза.
Впервые аддукты альбумина с ФОВ в качестве биомаркера отравления были предложены Black и соавт. [55]. Известно, что менее 1% альбумина модифицируется у человека летальными дозами ФОВ, которые ингибиру-ют 95% бутирилхолинэстеразы в плазме. Несмотря на высокую концентрацию альбумина в плазме, концентрация фосфонилированных пептидов в получаемом гидролизате сравнительно невысока. Для решения этой проблемы применяют методы обогащения пробы анали-том - металл-аффинную хроматографию. Так, в работе Jiang и соавт. [7] представлен метод
обогащения фосфонилированных пептидов на сорбенте, содержащем ионы Fe3+. Плазму крови инкубировали с зоманом или хлорпирифо-сомоксоном, затем проводили ферментативный гидролиз в присутствии пепсина. Пептиды альбумина обогащали путем связывания металл-аффинным сорбентом при рН 2.6 и элюировали буфером рН 11. Пептиды VRY411TKKVPQVST и LVRY411TKKVPQVST, модифицированные ФОВ по тирозину-411, идентифицировали с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии. Такой подход позволяет определять аддукты альбумина с ФОВ при воздействии невысоких концентраций ФОВ [56].
Наиболее распространённым методом анализа аддуктов ФОВ с белками крови является получение модифицированного тирозина, это достигается при использовании проназы при проведении ферментативного гидролиза. Данный подход применяли при расследовании атаки химическим оружием в Сирии в 2013 г. [42]. Использование дейтерированных стандартов модифицированного тирозина позволяет достичь очень низких пределов обнаружения: 0,01 нг/мл для аддуктов с зарином и зоманом и 0,05 нг/мл для аддукта с УХ [54]. Необходимо отметить, что определение модифицированной аминокислоты не позволяет говорить о ее белке-предшественнике, но модифицированный тирозин остается маркером интоксикации.
Реактивирование фторид-ионом
Реактивирование ФОВ из состава аддуктов с белками является общепризнанным методом анализа биопроб при установлении факта отравления [42, 57]. Реактивирование проводят с помощью фторид-иона, продуктами реактивирования из коньюгатов с белками являются алкилметилфосфонаты. В случае зарина, зома-на и циклозарина при действии фторид-иона на аддукты выделяются сами ФОВ, в случае табуна - УХ и У^фторангидриды соответствующих метилфосфоновых кислот [58]. Основными ограничениями метода реактивирования являются спонтанное реактивирование холи-нэстераз, деалкилирование старение аддуктов ХЭ с ФОВ. Однако данный подход позволяет устанавливать факт воздействия ФОВ на уровне ингибирования БХЭ < 1% и идентифициро-
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
вать действующий агент. Анализ ФОВ, реактивированных из состава аддуктов с белками, проводят методом газовой хроматографии с селективным детектированием, наиболее предпочтительным является использование тандемной масс-спектрометрии или масс-спектрометрии высокого разрешения [59].
В работе Н.Л. Корягиной и соавт. [59] проведено сравнительное исследование процедур для определения аддуктов белков с ФОВ: реактивирование ФОВ из состава конъюгатов с белками; определение нонапептида БХЭ, модифицированного ФОВ, определение фосфонилирован-ного тирозина, полученного из модифицированного альбумина. Показано, что определение реактивированных ФОВ является наиболее экспрессным методом, определение фосфони-лированного серина в активном центре БХЭ -наиболее чувствительным, а определение фос-фонилированного тирозина можно рассматривать в качестве наиболее ретроспективного из рассмотренных подходов. В работе также представлена оптимальная схема анализа плазмы крови при проведении токсикологических экспериментов, выполнении сличительных тестов по анализу биопроб, ОЗХО, расследовании случаев применения химического оружия.
Определение алкилметилфосфоновых кислот
Алкилметилфосфоновые кислоты (АМФК) являются метаболитами ФОВ, образующиеся в результате гидролиза. По данным [60] 90% от общего количества метаболитов ФОВ выводится через 48-72 ч после интоксикации, в случае достаточно высоких доз АМФК могут быть обнаружены в моче в течении 2 нед [61]. В настоящее время разработаны методики определения данных биомаркеров с пределами обнаружения на уровне 0,1-1 нг/мл методами газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием.
Определение АМФК методом газовой хроматографии требует обязательной предварительной экстракции аналитов из матрицы и дери-ватизации [62, 63]. Для дериватизации АМФК традиционно используют метилирование, сили-лирование или пентафторбензилирование. Так,
при анализе биомедицинских проб, взятых у жертв токийского инцидента, использовали си-лильные производные АМФК [64].
В работе Н.Л. Корягиной и соавт. [63] проведено сравнение различных летучих производных АМФК. Показано преимущество перфторбензиловых эфиров при определении АМФК методом реакционной газовой хрома-томасс-спектрометрии. АМФК экстрагировали из мочи методом жидкостно-жидкостной экстракции последовательно ацетонитрилом и диэтиловым эфиром. Объединенный экстракт упаривали в токе азота, затем подвергали де-риватизации с помощью пентафторбензилбро-мида. Полученные летучие пентафторбензило-вые производные (ПФБ) анализировали методом ГХ-МС. Пределы обнаружения составили 1 нг/мл и менее.
Основным методом анализа АМФК является ВЭЖХ-МС/МС. В ФГУП НИИ ГПЭЧ ФМБА России разработана и аккредитована методика определения АМФК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения [63]. Главным достоинством является отсутствие сложной процедуры пробоподготовки, образцы мочи перед анализом центрифугируют, фильтруют и разбавляют. Использование изотопно-меченных стандартов позволяет получать точные количественные результаты на очень низких уровнях концентраций от 0,1 до 1 нг/мл.
Преимуществами АМФК как биомаркеров отравления ФОВ являются простота, доступность и высокая чувствительность определения данных аналитов в такой биоматрице, как моча. Моча, в отличие от крови, не требует соблюдения условий стерильности и инвазивных методов при отборе, а также предварительной подготовки перед заморозкой.
Заключение
За четверть века уничтожения химического оружия в мире накоплен огромный опыт идентификации и количественного определения как самих фосфорорганических отравляющих веществ в объектах окружающей среды и биопробах, так и их низкомолекулярных метаболитов и аддуктов с высокомолекулярными соедине-
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ниями, что позволяет достоверно определять
факт отравления и контакта с ФОВ в течение
нескольких недель и месяцев. Этот опыт может
быть успешно трансформирован в разработку
методов определения как опасных экотоксикан-
тов, так и распространенных ксенобиотиков и
лекарственных средств.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Marsillach J., Costa L. G., Furlong C.E. Protein adducts as biomarkers of exposure to organophosphorus compounds. Toxicology. 2013; 307: 46- 54.
2. Vital de Oliveira O., Cuya T., Correa Ferreira E., da Silva Gongalves A.. Theoretical investigations of human acetylcholinesterase inhibition efficiency by neurotoxic organophosphorus compounds. Chemical Physics Letters. 2018; 706: 82-6.
3. Costa, L.G.Current issues in organophosphate toxicology. Clin. Chim. Acta. 2006; 366: 1-13.
4. Jokanovic M., Kosanovic M., Brkic D., Vukomanovic P. Organophosphate induced delayed polyneuropathy in man: an overview. Clin. Neurol. Neurosurg. 2011;113: 7-10.
5. Peeples E.S., Schopfer L.M., Duysen E.G., Spaulding R., Voelker T., Thompson C.M., Lockridge, O. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry. Toxicol. Sci. 2005; 83: 303-12.
6. Li B., Ricordel I., Schopfer L.M., Baud F., Megarbane B., Nachon F., Masson P., Lockridge O. Detection of ad-duct on tyrosine 411 of albumin in humans poisoned by dichlorvos. Toxicol. Sci. 2010; 116: 23-31.
7. Jiang W., Masson P., Schopfer L.M., Lockridge O., Du-brovskii Y.A., Murashko E.A., Babakov V, Podolskaya E.P., Nachon F. Phos-select iron affinity beads enrich peptides for the detection of organophosphorus adducts on albumin . Chemical Research in Toxicology. 2013; 26 (12): 1917-25.
8. Jiang W., Duysen E.G., Hansen H., Shlyakhtenko L., Schopfer L.M., Lockridge O. Mice treated with chlor-pyrifos or chlorpyrifos oxon have organophosphorylated tubulin in the brain and disrupted microtubule structures, suggesting a role for tubulin in neurotoxicity associated with exposure to organophosphorus agents. Toxicol Sci. 2010; 115(1):183-93.
9. Daan R.W. Verstappen, Albert G. Hulst, Alex Fidder, Nico P.E. Vermeulen, Daan Noort. Interactions of or-ganophosphates with keratins in the cornified epithelium of human skin. Chemico-Biological Interactions.2012; 197: 93-102.
10. Schaller J., Gerber S., Kämpfer U., Lejon S. and Ch. Trachsel. Human Blood Plasma Proteins: Structure and
Function © 2008 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0470-01674-9.
11. Подольская Е.П., Бабаков В.Н. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в токсикологическом анализе. Научное приборостроение. 2008; 18 (4): 5-12.
12. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V Jr., Feather-Stone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1961;.7: 88-95
13. Worek F., Mast U., Kiderlen D, Diepold C., Eyer P. Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood. Clinica Chimica Acta.1999; 288: 73-90.
14. Prokofieva D.S., Voitenko N.G., Gustyleva L.K., Babakov V.N., Savelieva E.I., Jenkins R.O., Goncharov N.V Microplate spectroscopic methods for determination of the organophosphate soman. J. Environ. Monit. 2010;12(6):1349-54.
15. Dingova D., Leroy J., Check A., Garaj V., Krejci E., Hrabovska A., Optimal detection of cholinesterase activity in biological samples: Modifications to the standard Ellman's assay. Anal. Biochem. 2014; 462: 67-75.
16. Holas O., Musilek K., Pohanka M., Kuca K., The progress in the cholinesterase quantification methods. Expert Opin. Drug. Discov. 2012; 7(12): 1207-23.
17. Sun J., Lynn B.C. Development of a MALDI-TOF-MS method to identify and quantify butyrylcholinesterase inhibition resalting from exposure to organophosphate and carbamate pesticides. J. Am.Soc. Mass Spectrom. 2007; 18: 698-706.
18. Sun J., Lynn B.C. Development of a LC/MS/MS method to analyze butyrylcholinesterase inhibition resalting from multiple pesticide exposure. J. of chromatography B.2009; 877: 3681- 5.
19. Yan L., Chen J., Xu B., Guo L., Xie Y., Tang J., Xie J. A liquid chromatography tandem mass spectrometric method on in vitro nerve agents poisoning characterization and reactivator efficacy evaluation by determination of specific peptide adducts in acetylcholinesterase. Journal of Chromatography A. 2016; 1450: 86-93.
20. Murashko E.A., Dubrovskii Ya. A., Beltyukov P.P., Radilov A.S., Babakov V.N. Determination of BChE activity by mass spectromic analysis of its adduct with Russian VX. Military medical science letters. 2018; 87: 112.
21. Brenner S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines. Nature. 1988; 334: 528-30.
22. Chatonnet A, Lockridge O. Comparison of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase. Biochem J. 1989; 260: 625-34.
23. Andres C., elMourabit M., Stutz C., Mark J., Waksman A. Are soluble and membrane-bound rat brain acetlcho-linesterase different? Neurochem Res. 1990; 15: 1065-72.
24. Mangas I., Taylor P., Vilanova E., Estevez J., Franga T.C.C., Komives E., Radic Z. Resolving pathways of interaction of mipafox and a sarin analog with human acetylcholinesterase by kinetics, mass spectrometry and
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
molecular modeling approaches. Archives of Toxicology. 2016; 90. Issue 3: 603-616.
25. Shafferman A., Ordentlich A., Barak D., Stein D., Ariel N., Velan B. Aging of phosphylated human acetylcholinesterase: catalytic processes mediated by aromatic and polar residues of the active centre. Biochem. J. 1996; 318: 833-40.
26. Barak D., Ordentlich A., Kaplan D., Barak R., Mizrahi D., Kronman Ch., Segall Y., Velan B., Shafferman A. Evidence for P-N bond scission in phosphoroamidate nerve agent adducts of human acetylcholinesterase. Biochemistry. 2000; 39: 1156-61.
27. Nagao M., Takatori T., Matsuda Y., Nakajima M., Iwase H., Iwadate K. Definitive Evidence for the acute sarin poisoning diagnosisin the tokyo subway. Toxicology and applied pharmacology. 1997; 144: 198-203.
28. Jennings L.L., Malecki M., Komives E.A., Taylor P. Direct analysis of the kinetic profiles of organophosphate - acetylcholinesterase adducts by MALDI-TOF Mass spectrometry. Biochemistry. 2003; 42: 11083-91
29. Dafferner A J., Schopfer L. M., Xiao G., Cashman J. R., Yerramalla U., Johnson R. C., Blake T. A., Lockridge O. Immunopurification of acetylcholinesterase from red blood cells for detection of nerve agent exposure. Chem. Res. Toxicol. 2017; 30: 1897-910.
30. Onder S., Schopfer L. M., Cashman J. R., Tacal O., Johnson R. C., Blake T. A., Lockridge O. Use of Hupresin to capture red blood cell acetylcholinesterase fordetection of soman exposure. Anal. Chem. 2018; 90: 974-9.
31. Рембовский В.Р., Радилов А.С., Бельтюков П.П., Бабаков В.Н., Дубровский Я.А., Мурашко Е.А., Пуш-карева Т.И., Чуприна О.И. Определение фосфони-лированных модификаций холинэстераз. МР ФМБА России 12.05.2016. СПб., изд-во Политехнического института, 2016. 20 с.
32. Onder S., David E., Tacal O., Schopfer L. M., Lockridge O. Hupresin retains binding capacity for butyrylcholin-esterase and acetylcholinesrase after sanitation with sodium hydroxide. Frontiers in Pharmacology. 2017; 8: Art.713.
33. Boyko K. M., Baymukhametov T. N., Chesnokov Y. M., Hons M., Lushchekina S.V., Konarev P.V., Lipkin A. V, Vasiliev A. L., Masson P., Popov VO., Kovalchuk M. V. 3D structure of the natural tetrameric form of human butyrylcholinesterase as revealed by cryoEM, SAXS and MD. Biochimie. 2019; 156: 196- 205.
34. Lockridge O. Review of human butyrylcholinesterase structure, function, genetic variants, history of use in the clinic, and potential therapeutic uses. Pharmacology & Therapeutics. 2015; 148: 34-46.
35. Manoharan I., Boopathy R., DArvesh S., Lockridge O. A medial health report on individuals with silent butyrylcholinesterase in Vysya community of India. Clin Chim Acta. 2007; 378: 128-35.
36. Pope C.N., Brimijoin S. Cholinesterases and the fine line between poison and remedy. Biochemical Pharmacol-ogy.2018; P. 205-16.
37. Yuan J., Yin J, Wang E. Characterization of procaine metabolism as probe for the butyrylcholinesterase enzyme investigation by simultaneous determination of procaine and its metabolite using capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection. J. Chromatography A. 2007; 1154: 368-72.
38. Zelinski T., Coghlan G., Mauthe J., Triggs-Raine B. Molecular basis of succinylcholine sensitivity in a prairie Hutterite kindred and genetic characterization of the region containing the BCHE gene. Mol Genet Metab..2007; 90: 210-6.
39. Duysen E.G., Li B., Carlson M., Li Y.F., Wieseler S., Hinrichs S.H., Lockridge O. Increased hepatotoxicity and cardiac fibrosis in cocaine-treated butyrylcholinesterase knockout mice. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2008; 103: 514-21.
40. Ilyushin D.G., Smirnov I.V., Belogurov A.A., Dyachenko I.A., Zharmukhamedova T., Novozhilova T.I., Bychikhin E.A., Serebryakova M.V, Kharybin O.N., Murashev A.N., Anikienko K.A., Nikolaev E.N., Pono-marenko N.A., Genkin D.D., Blackburn G.M., Masson P., Gabibov A.G. Chemical polysialylation of human recombinant butyrylcholinesterase delivers a long-acting bioscavenger for nerve agents in vivo. Proc Natl Acad Sci US A 2013; 110: 1243-8.
41. Saxena A., Sun W., Fedorko J.M., Koplovitz I., Doctor B.P. Prophylaxis with human serum butyrylcholinester-ase protects guinea pigs exposed to multiple lethal doses of soman or VX. Biochem Pharmacol. 2011; 81: 164-9.
42. John H., van der Schans M. J., Koller M, Spruit H.E. T., Worek F., Thiermann H., Noort D. Fatal sarin poisoning in Syria 2013: forensic verification within an international laboratory network. Forensic toxicology. 2017; 36(1): 61-71.
43. Li H., Schopfer L. M., Nachon F., Froment M., Masson P., Lockridge O. Aging pathways for organophosphate-inhibited human butyrylcholinesterase, including novel pathways for isomalathion, resolved by mass spectrom-etry. Toxicological sciences.2007; 100(1): 136-45.
44. Li H., Ricordel I., Tong L., Schopfer L. M., Baud F., Me-garbane B., Maury E., Masson P., Lockridge O. Carbofu-ran poisoning detected by mass spectrometry of butyrylcholinesterase adduct in human serum. J. Appl. Toxicol. 2009; 29: 149-55.
45. Liu C., Huang G., Xia Ha., Liu S., Liu J., Yu H., Zhou S., Liang L.i, YuanL. Simultaneous quantification of soman and VX adducts to butyrylcholinesterase, their aged methylphosphonic acid adduct and butyrylcholinesterase in plasma using an off-column procainamide-gel separation method combined with UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 2016; 1036-1037: 57-65.
46. Sporty J.L.S., Lemire S.W., Jakubowski E.M., Renner J.A., Evans R.A., Williams R.F., Schmidt J.G., van der Schans M.J., Noort D., Johnson R.C. Immunomagnetic separation and quantification of butyrylcholinesterase nerve agent adducts in human serum. Anal. Chem. 2010; 82: 6593-600.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
47. Дубровский Я.А., Мурашко Е.А., Бельтюков П.П., Подольская Е.П., Бабаков В.Н. Масс-спектро-метрическая идентификация аддуктов бутирилхо-линэстеразы с фосфорорганическими соединениями с помощью концентрирования иммунопреципи-тацией из плазмы крови. Биомедицинский журнал www.medline.ru. 2015;16: 481-8.
48. Bonichon M., Valbi V, Combes A., Desoubries C., Bossee A., Pichon V. Online coupling of immunoextraction, digestion, and microliquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of sarin and soman-butyr-ylcholinesterase adducts in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2018; 410, Issue 3: 1039-51.
49. Jiang W., Murashko E.A., Dubrovskii Y.A., Podolskaya E.P., Babakov V.N., Mikler J., Nachon F., Masson P., Schopfer L.M., Lockridge O. Matrix-assisted laser de-sorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of titanium oxide-enriched peptides for detection of aged organophosphorus adducts on human butyrylcholines-terase. Anal. Biochem. 2013; 439: 132-41.
50. Brazzolotto X., Wandhammer M., Ronco C., Trovaslet M., Jean L., Lockridge O., Renard P., Nachon F. Human butyrylcholinesterase produced in insect cells: huprine-based affinity purification and crystal structure. FEBS J. 2012; 279: 2905-16.
51. Краснов И. А. Гаврик М.А., Подольская Е.П., Краснов Н.В.Фрагментация фосфопептидов методом ECD/ ETD в современной тандемной масс-спектрометрии. Научное приборостроение. 2013; 23(1): 5-19.
52. Дубровский Я.А., Мурашко Е.А., Подольская Е.П., Бабаков В.Н., Краснов Н.В., Радилов А.С. Оптимизация условий проведения металл-аффинной хроматографии для выделения фосфонилированных пептидов. Научное приборостроение. 2013; 23(3): 13-9.
53. Read R.W., Riches J.R., Stevens J.A., Stubbs S.J., Black R.M. Biomarkers of organophosphorus nerve agent exposure: comparison of phosphylated butyrylcholinesterase and phosphylated albumin after oxime therapy. Arch Toxicol. 2010; 84: 25-36.
54. Bao Y., Liu Q., Chen J., Lin Y., Wu B., Xie J. Quantification of nerve agent adducts with albumin in rat plasma using liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2012; 1229: 164-71.
55. Black R.M., Harrison J.M., Read R.W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site. Arch Toxicol. 1999;73(2):123-6.
56. Dubrovskiy Ya.A., Murashko E.A., Podolskaya E.P., Babakov V.N., Krasnov N.V, Radilov A.S. Optinisation procedure of metal-affinity chromatography on sorbents, containing ions of Ti (IV) for isolation of phosphonyl-ated peptides. Nauchnoe priborostroenie. 2013; 23(3): 13-9). (in Russian)
56. Дубровский Я.А., Мурашко Е.А., Подольская Е.П., Бабаков В.Н., Краснов Н.В., Радилов А.С. Оптимизация условий проведения металл-аффинной хромато-
графии для выделения фосфонилированных пептидов. Научное приборостроение. 2013; 23(3): 13-9.
57. Holland K.E., Solano K.E., Johnson, R.C., Mario VL., Barr J.R. Modifications to the organophosphorus nerve agent-protein adduct refluoridation method for retrospective analysus of nerve agent exposures. J. Anal.Toxi-col. 2008; 32: 116-24.
58. Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Хлебникова Н.С., Копейкин В.А., Конева В.Ю., Радилов А.С. Особенности анализа фосфорорганических отравляющих веществ, реактивированных из состава аддуктов с белками крови, при установлении факта воздействия химического оружия. Токсикологический вестник. 2014; 4(127): 39-46.
59. Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Каракашев Г.В., Бабаков В.Н., Дубровский Я.А., Уколова Е.С., Хлебникова Н.С., Мурашко Е.А., Конева В.Ю., Уколов А.И., Копейкин В. А., Радилов А. С. Определение конъю-гированных с белками метаболитов фосфороргани-ческих отравляющих веществ в плазме крови. Журнал аналитической химии. 2016; 71(8): 883-893
60. Riches J., Morton I., Read R.W., Black R.M. The trace analysis of alkyl alkylphosphonic acids in urine using gas chromatography-ion trap negative ion tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2005; 816 (1-2): 251-8.
61. Black R. M. An overview of biological markers of exposure to chemical warfare agents J. Anal. Toxicol. 2008; 32(1): 2-9.
62. Black R.M., Muir R.W. Derivatisation reactions in the chromatographic analysis of chemical warfare agents and their degradation products. J. Chromatogr. A. 2003; 1000 (1-2): 253-81.
63. Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Хлебникова Н.С., Уколов А.И., Уколова Е.С., Каракашев Г.В., Радилов А.С. Хроматомасс-спектрометрическое определение алкилметилфосфоновых кислот в моче. Масс-спектрометрия. 2015; 12(4): 236-46.
64. Nakajima T., Sasaki K., Ozawa H., Sekijima Y., Morita H., Fukushima Y., Yanagisawa N. Urinary metabolites of sarin in a patient of the Matsumoto sarin incident. Arch. Toxicol. 1998; 72(9): 601-3.
REFERENCES
1. Marsillach J., Costa L. G., Furlong C.E. Protein adducts as biomarkers of exposure to organophosphorus compounds. Toxicology. 2013; 307: 46- 54.
2. Vital de Oliveira O., Cuya T., Correa Ferreira E., da Silva Gonçalves A.. Theoretical investigations of human acetylcholinesterase inhibition efficiency by neurotoxic organophosphorus compounds. Chemical Physics Letters. 2018; 706: 82-6.
3. Costa, L.G.Current issues in organophosphate toxicology. Clin. Chim. Acta. 2006; 366: 1-13.
4. Jokanovic M., Kosanovic M., Brkic D., Vukomanovic P. Organophosphate induced delayed polyneuropathy in
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
man: an overview. Clin. Neurol. Neurosurg. 2011;113: 7-10.
5. Peeples E.S., Schopfer L.M., Duysen E.G., Spaulding R., Voelker T., Thompson C.M., Lockridge, O. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry. Toxicol. Sci. 2005; 83: 303-12.
6. Li B., Ricordel I., Schopfer L.M., Baud F., Megarbane B., Nachon F., Masson P., Lockridge O. Detection of ad-duct on tyrosine 411 of albumin in humans poisoned by dichlorvos. Toxicol. Sci. 2010; 116: 23-31.
7. Jiang W., Masson P., Schopfer L.M., Lockridge O., Du-brovskii Y.A., Murashko E.A., Babakov V, Podolskaya E.P., Nachon F. Phos-select iron affinity beads enrich peptides for the detection of organophosphorus adducts on albumin . Chemical Research in Toxicology. 2013; 26 (12): 1917-25.
8. Jiang W., Duysen E.G., Hansen H., Shlyakhtenko L., Schopfer L.M., Lockridge O. Mice treated with chlor-pyrifos or chlorpyrifos oxon have organophosphorylated tubulin in the brain and disrupted microtubule structures, suggesting a role for tubulin in neurotoxicity associated with exposure to organophosphorus agents. Toxicol Sci. 2010; 115(1):183-93.
9. Daan R.W. Verstappen, Albert G. Hulst, Alex Fidder, Nico P.E. Vermeulen, Daan Noort. Interactions of or-ganophosphates with keratins in the cornified epithelium of human skin. Chemico-Biological Interactions.2012; 197: 93-102.
10. Schaller J., Gerber S., Kämpfer U., Lejon S. and Ch. Trachsel. Human Blood Plasma Proteins: Structure and Function © 2008 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0470-01674-9.
11. Podolskaya E.P., Babakov VN. Soft ionization mass-spectrometry in toxicological analysis. Nauchnoe pribo-rostroenie. 2008; 18 (4): 5-12. (in Russian)
12. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V Jr., Feather-Stone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1961;.7: 88-95
13. Worek F., Mast U., Kiderlen D, Diepold C., Eyer P. Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood. Clinica Chimica Acta.1999; 288: 73-90.
14. Prokofieva D.S., Voitenko N.G., Gustyleva L.K., Babakov V.N., Savelieva E.I., Jenkins R.O., Goncharov N.V. Microplate spectroscopic methods for determination of the organophosphate soman. J. Environ. Monit. 2010;12(6):1349-54.
15. Dingova D., Leroy J., Check A., Garaj V., Krejci E., Hrabovska A., Optimal detection of cholinesterase activity in biological samples: Modifications to the standard Ellman's assay. Anal. Biochem. 2014; 462: 67-75.
16. Holas O., Musilek K., Pohanka M., Kuca K., The progress in the cholinesterase quantification methods. Expert Opin. Drug. Discov. 2012; 7(12): 1207-23.
17. Sun J., Lynn B.C. Development of a MALDI-TOF-MS method to identify and quantify butyrylcholinesterase in-
hibition resalting from exposure to organophosphate and carbamate pesticides. J. Am.Soc. Mass Spectrom. 2007; 18: 698-706.
18. Sun J., Lynn B.C. Development of a LC/MS/MS method to analyze butyrylcholinesterase inhibition resalting from multiple pesticide exposure. J. of chromatography B.2009; 877: 3681- 5.
19. Yan L., Chen J., Xu B., Guo L., Xie Y., Tang J., Xie J. A liquid chromatography tandem mass spectrometric method on in vitro nerve agents poisoning characterization and reactivator efficacy evaluation by determination of specific peptide adducts in acetylcholinesterase. Journal of Chromatography A. 2016; 1450: 86-93.
20. Murashko E.A., Dubrovskii Ya. A., Beltyukov P.P., Radilov A.S., Babakov V.N. Determination of BChE activity by mass spectromic analysis of its adduct with Russian VX. Military medical science letters. 2018; 87: 112.
21. Brenner S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines. Nature. 1988; 334: 528-30.
22. Chatonnet A, Lockridge O. Comparison of butyrylcho-linesterase and acetylcholinesterase. Biochem J. 1989; 260: 625-34.
23. Andres C., elMourabit M., Stutz C., Mark J., Waksman A. Are soluble and membrane-bound rat brain acetlcho-linesterase different? Neurochem Res. 1990; 15: 1065-72.
24. Mangas I., Taylor P., Vilanova E., Estevez J., Franga T.C.C., Komives E., Radic Z. Resolving pathways of interaction of mipafox and a sarin analog with human acetylcholinesterase by kinetics, mass spectrometry and molecular modeling approaches. Archives of Toxicology. 2016; 90. Issue 3: 603-616.
25. Shafferman A., Ordentlich A., Barak D., Stein D., Ariel N., Velan B. Aging of phosphylated human acetylcholin-esterase: catalytic processes mediated by aromatic and polar residues of the active centre. Biochem. J. 1996; 318: 833-40.
26. Barak D., Ordentlich A., Kaplan D., Barak R., Mizrahi D., Kronman Ch., Segall Y., Velan B., Shafferman A. Evidence for P-N bond scission in phosphoroamidate nerve agent adducts of human acetylcholinesterase. Biochemistry. 2000; 39: 1156-61.
27. Nagao M., Takatori T., Matsuda Y., Nakajima M., Iwase H., Iwadate K. Definitive Evidence for the acute sarin poisoning diagnosisin the tokyo subway. Toxicology and applied pharmacology. 1997; 144: 198-203.
28. Jennings L.L., Malecki M., Komives E.A., Taylor P. Direct analysis of the kinetic profiles of organophosphate -acetylcholinesterase adducts by MALDI-TOF Mass spectrometry. Biochemistry. 2003; 42: 11083-91
29. Dafferner A J., Schopfer L. M., Xiao G., Cashman J. R., Yerramalla U., Johnson R. C., Blake T. A., Lockridge O. Immunopurification of acetylcholinesterase from red blood cells for detection of nerve agent exposure. Chem. Res. Toxicol. 2017; 30: 1897-910.
30. Onder S., Schopfer L. M., Cashman J. R., Tacal O., Johnson R. C., Blake T. A., Lockridge O. Use of Hupresin to
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
capture red blood cell acetylcholinesterase fordetection of soman exposure. Anal. Chem. 2018; 90: 974-9.
31. Rembovkii V.R., Radilov A.S., Beltyukov P.P., Babakov V.N., Dubrovskii Ya. A., Murashko E.A., Pushkareva T.I., Chuprina O.I. Determination of phosphonylated modifications of cholinesterases FMBA of Russia 12.05.2016 [Opredelenie fosfonilirovannykh modifikatsiy kholiesteraz FMBARossii 12.05.2016]. Saint Petersburg, 2016. 20 p.
32. Onder S., David E., Tacal O., Schopfer L. M., Lockridge O. Hupresin retains binding capacity for butyrylcholin-esterase and acetylcholinesrase after sanitation with sodium hydroxide. Frontiers in Pharmacology. 2017; 8: Art.713.
33. Boyko K. M., Baymukhametov T. N., Chesnokov Y. M., Hons M., Lushchekina S.V., Konarev P.V., Lipkin A. V, Vasiliev A. L., Masson P., Popov VO., Kovalchuk M. V. 3D structure of the natural tetrameric form of human butyrylcholinesterase as revealed by cryoEM, SAXS and MD. Biochimie. 2019; 156: 196- 205.
34. Lockridge O. Review of human butyrylcholinesterase structure, function, genetic variants, history of use in the clinic, and potential therapeutic uses. Pharmacology & Therapeutics. 2015; 148: 34-46.
35. Manoharan I., Boopathy R., DArvesh S., Lockridge O. A medial health report on individuals with silent butyryl-cholinesterase in Vysya community of India. Clin Chim Acta. 2007; 378: 128-35.
36. Pope C.N., Brimijoin S. Cholinesterases and the fine line between poison and remedy. Biochemical Pharmacol-ogy.2018; P. 205-16.
37. Yuan J., Yin J, Wang E. Characterization of procaine metabolism as probe for the butyrylcholinesterase enzyme investigation by simultaneous determination of procaine and its metabolite using capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection. J. Chromatogra-phy A. 2007; 1154: 368-72.
38. Zelinski T., Coghlan G., Mauthe J., Triggs-Raine B. Molecular basis of succinylcholine sensitivity in a prairie Hutterite kindred and genetic characterization of the region containing the BCHE gene. Mol GenetMetab..2007; 90: 210-6.
39. Duysen E.G., Li B., Carlson M., Li Y.F., Wieseler S., Hinrichs S.H., Lockridge O. Increased hepatotoxicity and cardiac fibrosis in cocaine-treated butyrylcholines-terase knockout mice. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2008; 103: 514-21.
40. Ilyushin D.G., Smirnov I.V., Belogurov A.A., Dyachenko I.A., Zharmukhamedova T., Novozhilova T.I., Bychikhin E.A., Serebryakova M.V., Kharybin O.N., Murashev A.N., Anikienko K.A., Nikolaev E.N., Pono-marenko N.A., Genkin D.D., Blackburn G.M., Masson P., Gabibov A.G. Chemical polysialylation of human recombinant butyrylcholinesterase delivers a long-acting bioscavenger for nerve agents in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110: 1243-8.
41. Saxena A., Sun W., Fedorko J.M., Koplovitz I., Doctor B.P. Prophylaxis with human serum butyrylcholinester-
ase protects guinea pigs exposed to multiple lethal doses of soman or VX. Biochem Pharmacol. 2011; 81: 164-9.
42. John H., van der Schans M. J., Koller M, Spruit H.E. T., Worek F., Thiermann H., Noort D. Fatal sarin poisoning in Syria 2013: forensic verification within an international laboratory network. Forensic toxicology. 2017; 36(1): 61-71.
43. Li H., Schopfer L. M., Nachon F., Froment M., Masson P., Lockridge O. Aging pathways for organophosphate-inhibited human butyrylcholinesterase, including novel pathways for isomalathion, resolved by mass spectrom-etry. Toxicological sciences.2007; 100(1): 136-45.
44. Li H., Ricordel I., Tong L., Schopfer L. M., Baud F., Mé-garbane B., Maury E., Masson P., Lockridge O. Carbofu-ran poisoning detected by mass spectrometry of butyryl-cholinesterase adduct in human serum. J. Appl. Toxicol. 2009; 29: 149-55.
45. Liu C., Huang G., Xia Ha., Liu S., Liu J., Yu H., Zhou S., Liang L.i, YuanL. Simultaneous quantification of soman and VX adducts to butyrylcholinesterase, their aged methylphosphonic acid adduct and butyrylcholinesterase in plasma using an off-column procainamide-gel separation method combined with UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 2016; 1036-1037: 57-65.
46. Sporty J.L.S., Lemire S.W., Jakubowski E.M., Renner J.A., Evans R.A., Williams R.F., Schmidt J.G., van der Schans M.J., Noort D., Johnson R.C. Immunomagnetic separation and quantification of butyrylcholinesterase nerve agent adducts in human serum. Anal. Chem. 2010; 82: 6593-600.
47. Dubrovskii Ya.A., Murashko E.A., Beltyukov P.P., Podolskaya E.P., Babakov V.N. Mass spectrometric identification of butyrylcholinesterase adducts with organophosphorus compounds using immunoprecipi-tation from blood plasma. Biomeditsinskiy zhurnal. Medline.ru. 2015; 16: 481-8. (in Russian).
48. Bonichon M., Valbi V., Combès A., Desoubries C., Bossée A., Pichon V. Online coupling of immunoextraction, digestion, and microliquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of sarin and soman-butyrylcholinesterase adducts in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2018; 410, Issue 3: 1039-51.
49. Jiang W., Murashko E.A., Dubrovskii Y.A., Podolskaya E.P., Babakov V.N., Mikler J., Nachon F., Masson P., Schopfer L.M., Lockridge O. Matrix-assisted laser de-sorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of titanium oxide-enriched peptides for detection of aged organophosphorus adducts on human butyrylcholinesterase. Anal. Biochem. 2013; 439: 132-41.
50. Brazzolotto X., Wandhammer M., Ronco C., Trovaslet M., Jean L., Lockridge O., Renard P., Nachon F. Human butyrylcholinesterase produced in insect cells: huprine-based affinity purification and crystal structure. FEBS J. 2012; 279: 2905-16.
51. Krasnov I.A., Gavrik M.A., Podolskaya E.P., Krasnov N.V Method ECD / ETD fragmentation of the phospho-
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
peptides in modern tandem mass spectrometry. Nauch-noepriborostroenie. 2013; 23(1): 5-19. (in Russian)
52. Dubrovskiy Y., Krasnov I., Murashko E., Anurov M., Radilov A., Krasnov N., Podolskaya E., Babakov V. Comparative analysis of CID and ETD tandem mass-spectrometry in human serum albumin adductomics. The FEBS Journal. 2013; 280(1):169.
53. Read R.W., Riches J.R., Stevens J.A., Stubbs S.J., Black R.M. Biomarkers of organophosphorus nerve agent exposure: comparison of phosphylated butyrylcholinesterase and phosphylated albumin after oxime therapy. Arch Toxicol. 2010; 84: 25-36.
54. Bao Y., Liu Q., Chen J., Lin Y., Wu B., Xie J. Quantification of nerve agent adducts with albumin in rat plasma using liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2012; 1229: 164-71.
55. Black R.M., Harrison J.M., Read R.W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site. Arch Toxicol. 1999;73(2):123-6.
56. Dubrovskiy Ya.A., Murashko E.A., Podolskaya E.P., Babakov V.N., Krasnov N.V, Radilov A.S. Optinisation procedure of metal-affinity chromatography on sorbents, containing ions of Ti (IV) for isolation of phosphonyl-ated peptides. Nauchnoe priborostroenie. 2013; 23(3): 13-9). (in Russian)
57. Holland K.E., Solano K.E., Johnson, R.C., Mario VL., Barr J.R. Modifications to the organophosphorus nerve agent-protein adduct refluoridation method for retrospective analysus of nerve agent exposures. J. Anal.Toxi-col. 2008; 32: 116-24.
58. Koryagina N.L., Savelieva E.I., Khlebnikova N.S., Ko-peikin V.A., Koneva V.U., Radilov A.S. Analysis fea-
tures of organophosphorus nerve agents reactivated from blood protein adducts while identifying exposure to chemical weapons. Toxicologicheskiy vestnik. 2014; 4(127): 39-46. (in Russian)
59. Koryagina N.L., Savelieva E.I., Karakashev G.V, Babakov V.N., Dubrovskii Y.A., Ukolova E.S., Khlebnikova N.S., Murashko E.A., Koneva V.Y., Ukolov A.I., Ko-peikin VA., Radilov A.S. Determination of protein ad-ducts of organophosphorus nerve agents in blood plasma. Journal of Analytical Chemistry. 2016; 71(8): 88393. (in Russian)
60. Riches J., Morton I., Read R.W., Black R.M. The trace analysis of alkyl alkylphosphonic acids in urine using gas chromatography-ion trap negative ion tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2005; 816 (1-2): 251-8.
61. Black R. M. An overview of biological markers of exposure to chemical warfare agents J. Anal. Toxicol. 2008; 32(1): 2-9.
62. Black R.M., Muir R.W. Derivatisation reactions in the chromatographic analysis of chemical warfare agents and their degradation products. J. Chromatogr. A. 2003; 1000 (1-2): 253-81.
63. Koryagina N.L., Savel'eva E.I., Khlebnikova N.S., Ukolov A.I., Ukolova E.S., Karakashev G.V, and Radilov A.S. Chromatography-Mass spectrometry determination of alkyl methylphosphonic acids in urine. Mass-spektrometriya. 2015; 12(4): 236-46.
64. Nakajima T., Sasaki K., Ozawa H., Sekijima Y., Morita H., Fukushima Y., Yanagisawa N. Urinary metabolites of sarin in a patient of the Matsumoto sarin incident. Arch. Toxicol. 1998; 72(9): 601-3.
Поступила 05.02.2019 Принята в печать 21.02.2019
