Изменения спектра производных фибринопептида в плазме крови при действии о-изобутил-s-(2-диэтиламиноэтил)метилтиофосфоната Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2008, том 18, № 4, c. 29-36

. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ДАННЫХ, МЕТОДОЛОГИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ

УДК 577.112.6 + 615.9

© И. А. Краснов, Е. П. Подольская, Н. В. Гончаров, В. Н. Бабаков,

Л. М. Глашкина, Е. Е. Ермолаева, Я. А. Дубровский, Д. С. Прокофьева,

Н. Г. Войтенко, Т. И. Смолихина, Н. Б. Поляков, А. С. Радилов, Н. В. Краснов

ИЗМЕНЕНИЯ СПЕКТРА ПРОИЗВОДНЫХ ФИБРИНОПЕПТИДА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПРИ ДЕЙСТВИИ 0-ИЗОБУТИЛ-£-(2-ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛ)МЕТИЛТИОФОСФОНАТА

Известно, что при воздействии фосфорорганических соединений (ФОС) на организм происходит подавление активности ряда ключевых ферментов, что подтверждается простыми методами лабораторной и клинической биохимии. Однако диагностика при хроническом действии малых доз ФОС или в отдаленные сроки после острой интоксикации затруднена вследствие отсутствия подавления или восстановления активности этих ферментов. Определение пептидного спектра плазмы или сыворотки крови может служить альтернативным и более чувствительным методом диагностики интоксикации. В данной работе приведены пептидные спектры плазмы и сыворотки крови крыс и человека, полученные при субхроническом воздействии российского VX (RVX) на крыс in vivo или однократном воздействии на кровь человека in vitro. Показано, что основной пептидный фон в плазме крови или сыворотки человека и крысы после воздействия RVX составляют производные фибринопептида А, что свидетельствует об инактивации экзопептидаз при воздействии RVX.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время уничтожение химического оружия в соответствии с федеральной целевой программой "Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации" является одной из приоритетных технологических задач. Однако существует опасность для персонала, участвующего в выполнении работ, которая может быть связана как с однократным острым поражением в аварийных ситуациях, так и с хроническим отравлением малыми дозами отравляющих веществ (ОВ) [1]. Доказательством поражения ОВ может служить изменение биохимической активности определенных ферментов, так называемых биомаркеров интоксикации. Так, известными биомаркерами острой и подострой интоксикации организма фосфорорганическими соединениями (ФОС) являются ферменты ацетилхолинэстераза (АХЭ) и бутирилхолинэстераза (БХЭ), активность которых снижается. Из перечня ФОС наиболее токсичным считается 0-изобутил-^-(2-диэтил-аминоэтил)метилтиофосфонат — российский VХ (RVX). Как и другие ФОС, RVX обладает цито-токсическим действием на клетки нервной системы, печени, системы крови, а также вызывает неблагоприятные эффекты при длительном воздействии субтоксических концентраций [2]. Однако диагностика при действии малых доз ФОС вообще

и RVX в частности затруднена отсутствием подавления активности АХЭ или БХЭ.

В последние годы активно развивается область протеомики, которая получила название пептидо-мика [3-5]. Это направление достаточно перспективно при поиске биомаркеров различных патологических состояний, в том числе и при интоксикации. Воздействие ОВ на организм приводит к появлению нехарактерных для здорового состояния соединений, которые могут быть детектированы тем или иным способом. К таким соединениям в первую очередь относятся белки и пептиды крови. Набор низкомолекулярных пептидов можно рассматривать как "молекулярный отпечаток" состояния биологических систем, или "роспись" (signature). Состояние пептидного спектра ("пептидом", "деградом") отражает состояние определенных белков-ферментов, активность или сам факт существования которых чрезвычайно сложно измерить прямыми биохимическими методами [6, 7]. С точки зрения специфичности и чувствительности наиболее удобным методом для анализа пептидов является масс-спектрометрия (М8), а применительно к массовому анализу наиболее подходящим методом представляется масс-спектрометрия с ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (MALDI).

Целью данной работы было изучение пептидного спектра низкомолекулярной фракции плазмы

крови крыс при интоксикации RVX, а также пептидного спектра плазмы крови человека при взаимодействии с RVX in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Субхроническую интоксикацию крыс обеспечивали добавлением RVX в питьевую воду животных в течение трех недель, из расчета ежедневного потребления вещества в дозе 1/100 ЛД50. Низкомолекулярную фракцию пептидов плазмы крови крыс получали путем осаждения белков плазмы ацетонитрилом с 2 % уксусной кислоты в соотношении 1 : 2 в течение 30 мин при 4 °С с последующим центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин. Затем осадок перерастворяли в 0.1 % растворе трифторуксусной кислоты (ТФУ), а не-растворившуюся фракцию из неосажденных на предыдущей стадии белков удаляли центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин. Пробу обессоливали с помощью мембраны с привитой фазой С-18, помещенной в микроколонку, после чего пептиды, которые связались с мембраной, смывали на мишень 60 %-м раствором ацетонитрила

в 0.1 %-м ТФУ, содержащим а-циано-4-гидрокси-коричную кислоту в концентрации 10 мг/мл.

Цельную венозную кровь от здоровых доноров отбирали в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА (Becton Dickinson). Цельную кровь инкубировали с RVX в конечной концентрации 0.1 мг/мл при 37 °С в течение 1 часа. Затем кровь центрифугировали при 1000 g 10 мин. Низкомолекулярную фракцию пептидов плазмы крови человека получали путем осаждения белков плазмы ацетонитри-лом с 2 % уксусной кислоты в соотношении 1 : 2 в течение 30 мин при 4°С и последующим центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин.

Масс-спектрометрический анализ пептидов проводили на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex-TOF-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) с источником MALDI, оснащенном УФ-лазером (337 нм) в режиме детектирования положительных ионов с использованием рефлектрона при следующих настройках ионного источника. Напряжение на IS1 — 25 кВ, IS2 — 21.75 кВ, напряжение на линзах (Lens) 9.5 кВ, напряжения на рефлектроне (Ref) — 26.99 и 13.80 кВ (Ref 2). Ионы детектировали в диапазоне m/z от 700 до 2000.

2.0

1.0

977.512

1106.615

1395.638

1193.605 |i 1294.667

kuM

2.0

1.0

1668.797 1739.801

1553.75J

Ш

1000

1500

m/z

1739.809

1688.764

1106.623

977.552

1193.632

I

1452.722

1294.665 1553.764

1395.686

1000

1500

iUl

M-fcUw ш

m/z

Рис. 1. Масс-спектры пептидной фракции плазмы крови контрольных крыс (а) и крыс после субхронической интоксикации ЯУХ (б)

I

I

а

б

Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF-TOF проводили при помощи программного обеспечения Flex Analysis 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). К спектрам применяли сглаживание по алгоритму Savizky Golay (ширина 0.1 miz, 1 цикл), и вычитание базовой линии согласно алгоритму Convex Hull. Использовали следующие параметры детекции пиков: алгоритм детекции пиков SNAP; соотношение сигнал/шум 2; порог качества спектра 100). Поиск в базе SwisProt осуществляли с помощью программного комплекса MASCOT (Matrix Science, Великобритания). Точная моноизотопная масса и форма изотопного распределения вычислялись при помощи программы MassPro (ИАнП РАН). Данные MS-MS анализа представлялись с помощью программы Sequence Viewer 2.0 (ИАнП РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Основной целью данной работы было выявление и идентификация пептидных маркеров влияния RVX на низкомолекулярную фракцию плазмы крови крыс и человека. На первом этапе проводился масс-спектрометрический анализ проб, по-

лученных от крыс, подвергнутых воздействию RVX in vivo, и контрольных проб из плазмы крови здоровых крыс. При сравнении спектров значительного различия между пептидными пулами по качественному составу в диапазоне масс 7002000 Да не было обнаружено. Но ряд сигналов, не выделяющихся по интенсивности из общего пула в спектрах контрольной группы, становятся мажорными в спектрах образцов экспериментальной группы (рис. 1, б). Кроме того, в этих спектрах появляется сигнал с MH+ 1452.77 Да, который отсутствует в контроле. Для каждого из пептидов, которым соответствуют указанные сигналы, был проведен MS-MS анализ, результат которого показал, что все они относятся к фибринопептиду А, который является частью фибриногена, и характеризуются потерей одной аминокислоты с N-конца (рис. 2, б). На рис. 3 приведен фрагментный спектр пептида с MH+ 1452.77 Да с указанием b- и y-фрагментных серий. Как показано на рисунке, данный спектр принадлежит пептиду с аминокислотной последовательностью GTTSEFIDEGAGIR, являющемуся частью фибринопептида А ADTGTTSEFIDEGAGIR с потерей трех аминокислот с N-конца.

Рис. 2. Масс-спектры пептидной фракции плазмы крови контрольных крыс (а) и крыс после субхронической интоксикации RVX (б). Показано отсутствие пептида с МН+ 1452.77 Да в плазме крови контрольных животных (а)

3000-

2000-

1000-

ы

58,

)36

72

Ь2 У1

ЬЗ Ь4 у4 Ь5

уб

187.031)

058

|129.0е I10.012

159.02

Zi

У 2 уЗ 115

416

476.

I

У5

187

336

595.

„к

390

Ь7 I

У7

Ь8

у8

980.220 -?-

Ь9 I

у9

Ы0 Ы1 У11 ЫЗ

85 L

106

144

977.471

Ы2

у 10

110Е

1106,539

144

1294

I ■ ■ ■ ■ I ■ ■ ■ ■ I ^ ■ ■ ■ I ■ ■ ■ ■ I ■ ■ ■ ■ I ' ■ ■ ■ I ■ ■ ■ ' I ■ ■ ■ ■ I ■ ' ■ ■ I ■ ■ ■ ■ I

О 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500

у12

у13

452.678

784

1395.923

3000'

2000-

1000-

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500

Mass/Charge

Рис. 3. Масс-спектр пептида GTTSEFIDEGAGIR с MH+ 1452.77 Да, полученный тандемной масс-спектрометрией (а), и определение его последовательности (б)

а

б

FLAEGGGVR

ADSGEGDFLAEGGGVR

DSGEGDFLAEGGGVR

EG D FLAEGGGVR 1206.576

DFLAEGGGVR 1020.491

GDFLAEGGGVR 1077.530

SGEGDFLAEGGGVR

EGDFLAEGGGVR

FLAEGGGVR

DFLAEGGGVR

GDFLAEGGGVR

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 16

m/z

Hi

ADSGEGDFLAEGGGVR Phospho S

ADSGEGDFLAEGGGVR DSGEGDFLAEGGGVR

1465.666

SGEGDFLAEGGGVR

1350.616

GEGDFLAEGGbVR

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 m/z

б

а

Рис. 4. Масс-спектры пептидной фракции плазмы крови человека (а) и плазмы крови человека после инкубации с RVX in vitro (б)

Таким образом, в низкомолекулярной фракции плазмы крови крыс, подвергнутых субхронической интоксикации RVX, обнаружен пептид фиб-риногеновой природы; этот факт наряду с характерным изменением пептидного спектра в целом может служить молекулярным свидетельством интоксикации RVX.

В следующем эксперименте мы добавляли RVX в кровь человека in vitro (см. раздел "Материалы и методы"), после чего исследовали пептидную фракцию плазмы крови. Как и в эксперименте с крысами in vivo, некоторые компоненты спектра становятся мажорными (рис. 4, б). Более того, все мажорные сигналы в процессе идентификации были отнесены к фибринопептиду А, лишенного аминокислот с N-конца. Масс-спектро-метрический анализ образцов контрольной плазмы и плазмы с добавлением RVX показал определенное сходство полученных результатов с теми, что

были получены в эксперименте in vivo с кровью крыс. В образцах появляется пептид GEGDFLAEGGGVR, MH+ 1263.6 Да, также имеющий фибриногеновую природу и характеризующийся отсутствием трех аминокислот по сравнению с фибринопептидом человека (ADSGEGDFLAEGGGVR). MS-MS спектр пептида GEGDFLAEGGGVR приводится на рис. 5.

Таким образом, в обоих экспериментах обнаружен фрагмент фибринопептида, отсутствующий в контрольных пробах и имеющий разницу с родительским пептидом в три аминокислоты, отщепленные с N-конца. Фрагменты фибринопептидов крысы и человека начинаются с глицина с N-конца, а предшествующая отщепленная аминокислота является нейтральной и имеет гидроксильную группу (треонин в фибринопептиде крысы и серин в фибринопептиде человека) (см. таблицу).

Рис. 5. Масс-спектр (а) пептида GEGDFLAEGGGVR МН+ 1263.6 Да, полученный тандемной масс-спектрометрией, и определение его последовательности (б)

а

б

Пептиды, относящиеся к фибринопептиду А, выявленные в плазме крови крысы и человека, в контроле и при действии RVX

№ п/п Крыса Человек

Пептид (МН+Да) Контроль VX Пептид (МН+Да) Контроль VX

1 АОТЭТТвЕПБЕЗАЭТК + РЬозрЬо ЗТ - - АБЗЗЕЗБГЬАЕЗЗЭУК + РЬозрЬо БТ (1616.6515) - +

2 АОТЭТТвЕПБЕЗАЭТК. (1739.809) + + АБЗЭЕЗБГЬАЕЗЗЭУК (1536.6912) + +

3 ОТЭТТвЕПБЕЗАЭТК. (1668.772) + + БЗЗЕЗБГЬАЕЗЗЭУК (1465.6481) + +

4 ТЭТТвЕПБЕЗАЭТК. (1553.745) + + ЗЭЕЗБГЬАЕЗЗЭУК (1350.6212) + +

5 ЭТТвЕПБЕЗАЭТК. (1452.697) - + ЭЕЗБГЬАЕЗЗЭУК (1263.5891) - +

6 ТТЗЕПБЕЭАЭХК (1395.676) + + ЕЭБГЬАЕЗЗЭУК (1206.5677) + +

7 ТЗЕПБЕЭАЭХК (1294.628) + + ЗБГЬАЕЭЭЭУК (1077.5251) + +

8 ЗЕПБЕЗАЭХК (1193.580) + + БГЬАЕЗЗЭУК (1020.5036) + +

9 ЕПБЕЗАЭТК. (1106.548) + + ГЬАЕЭЭЭУК (905.4767) + +

По-видимому, при действии RVX происходит ингибирование ряда экзопептидаз (К-амино-пептидаз), в результате чего изменяется количественное соотношение компонентов низкомолекулярной фракции плазмы крови, в частности наблюдается значительное усиление сигналов фиб-ринопептидных фрагментов по отношению к остальным сигналам в спектре, а также появляются другие пептиды, имеющие фибриногеновую природу. С другой стороны, возможно ингибирование антитромбина, что приводит к усиленному расщеплению фибриногена и повышению уровня фиб-ринопептида А. Так, помимо вышеназванного пептида с МН+ 1263.6 Да в пробах плазмы человека с добавлением RVX появляется еще один пептид с МН+ 1616.6 Да. По результатам анализа методом тандемной масс-спектрометрии, данный сигнал был также отнесен к фибринопептиду А, фосфорилированному по серину (рис. 6). Фибри-нопептид А — это пептид, отщепляемый тромбином от фибриногена при активации системы свертывания крови. Тромбин гидролизует 4 пептидные

связи Arg-Gly в фибриногене, в результате чего образуются фибринопептиды А и В [8]. Функциональное значение отщепленных фибринопептидов и их фрагментов остается неясным.

Таким образом, на основе полученных результатов можно сделать следующие выводы.

• Основной пептидный фон в плазме крови человека и крысы после воздействия RVX составляют пептиды, принадлежащие к фибриногену, в частности к фибринопептиду А.

• Пептиды, входящие в состав низкомолекулярной фракции сыворотки крови (GTTSEFIDEGAGIR) и (GEGDFLAEGGGVR) соответственно крысы и человека, могут появляться в результате инактивации экзопептидаз при воздействии RVX [7].

• Два пептида, имеющие фибриногеновую природу в сыворотке крови человека, а именно ADSGEGDFLAEGGGVR + Р^рЬо фТ) и GEGDFLAEGGGVR, могут свидетельствовать о воздействии RVX на организм, в частности на систему гуморального гемостаза.

Рис. 6. Масс-спектр (а) пептида АБЗЗЕЗБГЬАЕЗЗЭУК , фосфорилированного по серину с МН+ 1616.6 Да, полученный тандемной масс-спектрометрией, и определение его последовательности (б)

а

б

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lotti M. Experimental and Clinical Neurotoxicol-ogy. Oxford: Oxford University Press, 2000. P.898-925.

2. Lotti M. Handbook of Pesticide Toxicology. San Diego: Academic Press, 2001. P. 1043-1085.

3. Schulz-Knappe P. et al. Peptidomics: The Comprehensive Analysis of Peptides in Complex Biological Mixtures // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2001. V. 4, N 2. P. 207-217.

4. Villanueva J., et al. Serum Peptidome Patterns that Distinguish Metastatic Thyroid Carcinoma from Cancer-Free Controls Are Unbiased by Gender and Age // Mol. Cell. Proteomics. 2006. V. 5, N 10. P.1840-1852.

5. Martorella A., Robbins R. Serum Peptide Profiling: Identifying Novel Cancer Biomarkers for

Early Disease Detection // Acta Biomed. 2007. V. 78, N 1. P. 123-128.

6. Villanueva J. et al. Correcting Common Errors in Identifying Cancer-Specific Serum Peptide Signatures // J. Proteome Res. 2005. V. 4, N 4. P. 10601072.

7. Villanueva J. et al. Differential Exoprotease Activities Confer Tumor-Specific Serum Peptidome Patterns // J. Clin. Invest. 2006. V. 116, N 1. P. 271-284.

8. Blombäck B., Bark N. Fibrinopeptides and Fibrin Gel Structure // Biophys. Chem. 2004. V. 112, N 2-3. P. 147-151.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург (Краснов И.А., Подольская Е.П., Дубровский Я.А., Краснов Н.В.)

ФГУП "Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека" ФМБА России, Санкт-Петербург (Гончаров Н.В., Бабаков В.Н., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Радилов А.С.)

Институт биофизики клетки РАН, Пущино (Смоли-хина Т.И.)

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

(Поляков Н.Б.)

Материал поступил в редакцию 11.09.2008.

DIFFERENCES IN SPECTRA OF FIBRINOPEPTIDE DERIVATIVES IN BLOOD PLASMA AFTER EXPOSURE TO O-ISOBUTYL-S-2-DIETHYLAMINOETHYL METHYLPHOSPHONOTHIOLATE

I. A. Krasnov1, E. P. Podolskaya1, N. V. Goncharov2, V. N. Babakov2, L. M. Glashkina2, E. E. Ermolaeva2, Y. A. Dubrovsky1, D. S. Prokofieva2, N. G. Voitenko2, T. I. Smolikhina3,

N. B. Polyakov4, A. S. Radilov2, N. V. Krasnov1

1 Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg

2 Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, Saint-Petersburg

33Institute for Cell Biophysics RAS, Pushchino

4Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Mosrnw

It is a well-known fact that organophosphates (OP) inhibit several major enzymes, and this fact can be easily proved by simple laboratory and clinical biochemistry methods. On the other hand, diagnostics of low dosed chronic OP action, or their delayed effects after subacute intoxication is a serious problem because of lack of inhibition or recovery of the enzymes activity. Determination of peptide or serum blood plasma spectrum can serve an alternative and more sensitive method for intoxication diagnostics. In this paper, we demonstrate data on peptide spectra of rat plasma or serum after subchronic intoxication with Russian VX (RVX) in vivo, and that of human plasma or serum after human blood exposure to RVX in vitro. It is shown that the principal peptide plasma or serum component after RVX exposure is peptides derivatives of fibrinopeptide A, thus showing inac-tivation of exopeptidases under RVX exposure.