CC BY
8
7. Миллер Г. // Инженерная психология. — М., 1964. — С. 27—30.
8. Петров В. М., Яблонский А. И. Математика и социальные процессы. — М., 1980.
9. Правдин Н. С. Методика малой токсикологии промышленных ядов. — М., 1947.
10. Румянцев Г. И., Новиков С. М. // Гиг. и сан.— 1975.— №4, —С. 91—95.
11. Сороко Э. М. Структурная гармония систем. — Минск, 1984.
12. Уланова И. П., Пинигин М. А. //Жури. Всесоюз. хим. о-ва им. Д. И. Менделеева. — 1974.— Т. 19, № 2. — С. 135—142.
13. Фрумин Г. Т. //Хнм.-фарм. журн. — 1981. — № 9. — (2 52_55
14. Фрумин Г. Т. Ц Там же. — 1983. — № 7. — С. 822— 827.
15. Я г лом А. И., Яглом И. М. Вероятность и информация,— М., 1973.
16. Christensen Н. Е. (Ed.). The Toxic Substances List. — Maryland, 1973.
17. Deichmann W. В., Gerarde H. \V. Toxicilogy of Drugs and Chemicals. — New York, 1969.
18. Duprat P.. Fabry I. P., Gradiski D. // Arch, malad. prof.— 1979. —Vol. 40.— P. 927—938.
19. Hodge H. C., Srerner J. H. //Amer. industr. Hyg. Ass. Quart.— 1943.— Vol. 10.— P. 93.
20. McCreesh A. H. // J. Toxicol, appl. Pharmacol. — 1965.—Vol. 7. —P. 20.
21. Spectro W. S. (Ed.). Handbook of Toxicology. — Philadelphia, 1956.—Vol. 1.
22. Wepierre /., Marty I. P. // Sciences ty techniques. — 1978,—Vol. 8. —P. 171—180.
Поступила 10.03.88
УДК 6Н.31:633.1]:015.917|-07
А. Н. Котик, В. А. Труфанова
БИОАВТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИХОТЕЦЕНОВЫХ МИКОТОКСИНОВ В ЗЕРНЕ И ПРОДУКТАХ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ
Украинский НИИ птицеводства, ст. Боркн Южной железной дороги, Харьковская область
Трихотеценовые микотоксины (трихотецены) представляют согруппу структурно родственных соединений, продуцируемых грибами Fusarium, Myrothecium, Trichoderma, Trichothecium, Sta-chybotrys, и во многих странах являются существенным фактором загрязнения зерна, ведущим к развитию алиментарных токсикозов человека и животных. Для определения трихотеценов в продуктах питания и кормах используют биологические тесты, а также тонкослойную, жидкостную и газожидкостную хроматографию, масс-спектроскопию [4]. Эти методы характеризуются недостаточной чувствительностью и специфичностью или требуют для осуществления дорогостоящего оборудования.
В качестве скрининг-метода определения трихотеценов целесообразно использовать биоавтографию с помощью штаммов микроорганизмов, высокочувствительных к трихотеценам [1, 3]. В настоящей работе приводится описание биоавтографического метода определения 5 трихотеценов—веррукарина А, роридина А, токсина Т-2, токсина НТ-2 и трихотецена.
Метод основан на извлечении трихотеценов из исследуемой пробы органическими растворителями, осаждении коэкстрактивных веществ 15% водным раствором уксуснокислого свинца, очистке экстракта с помощью жидкость-жидкостной экстракции гексаном и хлороформом; разделении, идентификации и количественном определении каждого трихотецена путем двукратной тонкослойной хроматографии с последующим биоавтографическим обнаружением и определением количеств трихотеценов с помощью штамма То-rulopsis sp. 86А.
Веррукарин А получен нами из Института ви-
русологии и микробиологии АН УССР, рори-дин А — из Института питания АМН СССР, три-хотецен — из Московского университета. Токсин Т-2 мы получали из культуры Fusarium spo-rotrichiella методом адсорбционной колоночной хроматографии [2], токсин НТ-2 — путем гидролиза токсина Т-2 водным раствором аммиака.
Ход определения. Экстракция. Из средней пробы измельченного зерна или комбикорма берут навеску массой 25 г, помещают в плоскодонную мерную коническую колбу на 500 мл, добавляют 20 мл 10 % водного раствора хлорида натрия и тщательно перемешивают. Затем приливают 120 мл ацетона и смесь встряхивают в течение 1 ч, после чего фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр и отбирают 100 мл фильтрата.
Очистка экстракта. К 100 мл фильтрата добавляют 20 мл 15 % раствора уксуснокислого свинца и 30 мл воды, перемешивают и выдерживают в темноте 10 мин. Образовавшийся осадок отделяют путем фильтрации через бумажный фильтр. 120 мл фильтрата вносят в делительную воронку, добавляют 40 мл гексана, встряхивают и после разделения слоев отделяют нижний водно-ацетоновый слой; гексановый слой удаляют. К водно-ацетоновому слою добавляют дважды по 20 мл гексана, каждый раз отбирая и удаляя верхний гексановый слой и 40 мл хлороформа, встряхивают в делительной воронке. После разделения слоев нижний хлороформный слой отделяют, а к верхнему добавляют 40 мл хлороформа. После встряхивания и разделения слоев нижний хлороформный слой отделяют. В объединенный хлороформный экстракт вводят 5—7 г безводного сернокислого натрия, встряхивают и
Рис. 1. Хроматографическая подвижность трихотеценов в
системе этилацетат— толуол 3: 1. 1 — токсин НТ-2; 2 — роридин А; 3 — токсин Т-2; 4 — веррукарин А;
5 — трихотецен.
оставляют на 10 мин в темноте. Раствор фильтруют и упаривают досуха, остаток растворяют в 100 мкл бензола.
Разделение экстракта в тонком слое. Экстракт в количествах 2, 5 и 10 мкл наносят на стартовую линию пластинки илуфол на расстоянии 1,5 см от нижнего края и 2 см друг от друга. В качестве веществ-свидетелей берут по 2 мкл растворов в бензоле веррукарина А (2 нг/мкл), роридина А (5 нг/мкл), токсина Т-2 (50 нг/мкл), трихотецена (50 нг/мкл) и токсина НТ-2 (400 нг/мкл). Пластинку хроматографируют в системе диэтиловый эфир •—гексан 1:1, высушивают и вторично хроматографируют в системе
14
1Z
Ю
в
// i
/ / 1
/
1 ! )
/ J / / j f
/ / / /
a k 0' > г д/
0,0030005 О.ОГ
QP40JX О,!
О;4
Рис. 2. Зависимость диаметра зоны подавления роста То-ги]орз1з ер. 86А от количества трихотецена на пластинке. По оси абсднсс — количество трихотецена. мкг; по оси ординат — диаметр зоны подавления роста, мм; а — веррукарин А; б — рорн-дин А; в — токсин Т-2; г — трихотецен; д — токсин НТ-2.
этилацетат — толуол 3:1 (рис. 1), после чего снова высушивают.
Биоавтографическое обнаружение трихотеценов. Пластинку располагают горизонтально, на поверхность наносят расплавленный сусло-агар (0,05 мл на 1 см2 поверхности пластинки) и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. На поверхность агара наносят и равномерно распределяют 2—3 мл суточной культуры Тогу-lopsis sp. 86А, выращенной на стерильном не-охмеленном сусле, разбавленном в соотношении 1 : 1 дистиллированной водой. Излишкам жидкости дают стечь. Пластинку помещают во влажную камеру и выдерживают в термостате при 28—32 °С в течение 14—16 ч, после чего отмечают наличие и диаметр зон подавления роста тест-микроорганизма. Зоны, идентичные по хро-матографической подвижности зонам, вызванным веществами-свидетелями, указывают на наличие в исследуемой пробе определенных трихотеценов.
Количество обнаруженного трихотецена определяют по формуле:
2-ЮО-Б
х= 25.А -1000,
где X — содержание трихотецена в пробе; мкг/кг; А — количество экстракта, нанесенное на пластинку, мкл; Б — количество трихотецена, соответствующее величине зоны подавления роста тест-микроорганизма, мкг (рис. 2); 100 — объем экстракта, мкл; 25 — масса исследуемой пробы, г; 2 — коэффициент, учитывающий потери вещества в ходе экстракции и очистки; 1000 — коэффициент для выражения содержания трихотецена в мкг/кг.
Чувствительность метода для веррукарина А—2 мкг/кг, для роридина А — 5 мкг/кг, для трихотецена и токсина Т-2 — 25 мкг/кг и для токсина НТ-2 — 200 мкг/кг. Средняя относительная погрешность анализа не превышает ±20— 25%. Продолжительность анализа 18 ч.
Литература
1. A.c. 660653 СССР // Бюл. изобрет. — 1979. — № 17.
2. Котик А. #., Чернобай В. Т., Комиссаренко И. Ф., Тру-фанова В. А. // Микробиол. жури.— 1979. — № 6.— С. 636—639.
3. Методические указания по количественному определению Т-2 токсина в зерне и комбикормах: Главное управление ветеринарии Госагропрома СССР. — М., 1987.
4. Trichothcevenes-chemical, biological and toxicological aspects / Ed Y. Ueno. — Tokyo, 1983.
Поступила 24.03.88
