CC BY
40
Бактерицидная активность комбинаций антибиотиков в отношении экстремально-антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae с устойчивостью к колистину
Тапальский Д.В., Петровская Т.А.
Гомельский государственный медицинский университет, Беларусь
Tapalski D.V., Petrovskaya TA.
Gomel State Medical University, Belarus
Bactericidal activity of antibiotic combinations against extensively drug resistant strains of Klebsiella pneumoniae with resistance to colistin
Резюме. Для 43 экстремально-антибиотикорезистентных штаммов K. pneumoniae, устойчивых к колистину, определена бактерицидная активность фармакокинетических / фармакодинамических концентраций колистина, карбапенемов, кларитромицина, рифампицина и их комбинаций. Выявлена синергидная активность комбинаций колистина с кларитромицином, которая усиливалась в присутствии меропенема или дорипенема. Бактерицидный эффект комбинаций из двух карбапенемов (меропенем + эртапенем, дорипенем + эртапенем) проявлялся только в отношении штаммов с относительно невысокими значениями МПК меропенема (4-32 мкг/мл). Ключевые слова.: Klebsiella pneumoniae, антибиотикорезистентность, карбапенемазы, колистин, кларитромицин, карбапенемы.
Медицинские новости. — 2020. — №2. — С. 63—66. Summary. The bactericidal activity of pharmacokinetic /pharmacodynamic concentrations of colistin, carbapenems, clarithromycin, rifampicin and their combinations was determined for 43 extensively drug resistant K. pneumoniae strains resistant to colistin. A synergistic activity of colistin combinations with clarithromycin was revealed, which intensified in the presence of meropenem or doripenem. The bactericidal effect of double-carbapenem combinations (meropenem/ertapenem, doripenem/ertapenem) was manifested only against strains wtth relatively low values of the meropenem MIC (4-32 yg/ml).
Keywords: Klebsiella pneumoniae, antibiotic resistance, carbapenemases, colistin, clarithromycin, carbapenems. Meditsinskie novosti. - 2020. - N2. - P. 63-66.
Устойчивые к карбапенемам энте-робактерии, наряду с Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa, представляют серьезную угрозу для глобального здравоохранения и отнесены экспертами Всемирной организации здравоохранения к группе наиболее приоритетных бактериальных возбудителей для проведения исследований и создания новых антибиотиков [10]. Основным механизмом устойчивости энтеробактерий к карбапенемам является продукция карбапенемаз KPC, NDM, OXA-48 [4, 11]. Карбапене-мазопродуцирующие штаммы Klebsiella pneumoniae широко распространены в организациях здравоохранения Беларуси и имеют ассоциированную устойчивость к большинству не-беталактамных антибиотиков [3]. Вынужденное широкое использование колистина в качестве препарата последнего резерва для лечения инфекций, вызванных карбапе-неморезистентными штаммами, привело к появлению панрезистентных штаммов, нечувствительных ко всем антибиотикам из всех классов [6]. По данным российского многоцентрового исследования
«МАРАФОН», в 2015-2016 гг. устойчивыми к колистину были 18,6% нозокоми-альных штаммов энтеробактерий, в том числе 21,2% штаммов, продуцирующих карбапенемазы [1].
Комбинированная антибиотикотера-пия в настоящее время является единственной возможностью для лечения инфекций, вызванных панрезистентными микроорганизмами [12]. Надежно прогнозировать микробиологическую и клиническую эффективность комбинаций антибиотиков не представляется возможным, поскольку панрезистентные микроорганизмы несут в себе уникальные сочетания различных генетических детерминант и механизмов антибиотикорезистентности, что требует проведения лабораторных исследований по определению чувствительности к комбинациям антибиотиков для штаммов, выделенных от конкретных пациентов.
Цель исследования - выявление комбинаций антибиотиков с бактерицидной активностью в отношении колистинорези-стентных карбапенемазопродуцирующих штаммов K. pneumoniae, выделен-
ных в организациях здравоохранения Беларуси.
Материалы и методы
В исследование включено 43 штамма K. pneumoniae, выделенных в 20152018 гг. от госпитализированных пациентов в организациях здравоохранения Минска (24 штамма из 8 организаций здравоохранения), Гомеля (11 штаммов из 3 организаций здравоохранения), Витебска (1 штамм) и районных центров Гомельской области (7 штаммов из 6 центральных районных больниц). Указанные штаммы были выделены из крови (22 штамма - 51,2%), мокроты (4 штамма - 9,3%), мочи (8 штаммов -18,6%), раневого отделяемого (9 штаммов - 20,9%) пациентов, госпитализированных в отделения реанимации и интенсивной терапии (74,4%), а также в отделения хирургического и терапевтического профиля.
Определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) антибиотиков выполняли методом последовательных микроразведений в бульоне Мюллер -Хинтон (BD, США) в соответствии с ISO 20776-1:2006. Все штаммы были
_Бактерицидная активность антибиотиков и их комбинаций в
отношении колистинорезистентных карбапенемазопродуцирующих штаммов K. pneumoniae. Модифицированный метод тестирования бактерицидности различных комбинаций: МЕР - меропенем, ИМП - имипенем, ДОР - дорипенем, ЭРТ - эртапенем, КОЛ - колистин, КЛР - кларитромицин, РИФ - рифампицин
90,0 80,0 70,0
0 60,0
1 50,0 | 40,0
30,0 20,0 10,0 0,0
74 4 79Д
69,8
58,1
Ь-3,
27,9 30,2
* 18,6 18,6 20,9
7,0 7,0 7,0 4 7 |
щ щ щ и U,0 U,0 и,о I
#
* /
^ / /
'S к®
Л с •?
нечувствительны к карбапенемам (МПК меропенема >2 мкг/мл) и колистину (МПК колистина >2 мкг/мл) и имели фенотипы экстремальной (XDR) или полной (PDR) антибиотикорезистентности. Наличие генов карбапенемаз определено методом ПЦР в реальном времени с использованием диагностических наборов «АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL» и «АмплиСенс MDR MBL-FL» (Российская Федерация). Устойчивость к карбапенемам у всех включенных в исследование штаммов была обусловлена продукцией карбапенемаз (OXA-48 - 34 штамма, NDM - 5 штаммов, KPC - 2 штамма, сочетание NDM и OXA-48 - 2 штамма).
Определение бактерицидной активности отдельных антибиотиков и их комбинаций выполнено с использованием модифицированного метода тестирования бактерицидности различных комбинаций (Multiple combination bactericidal testing, MCBT) [2, 5]. Тестировались пограничные фармакокинетические / фармакодинами-ческие (ФК/ФД) концентрации антибиотиков, приведенные в EUCAST [7] и других источниках. Определяли бактерицидную активность меропенема (8 мкг/мл), ими-пенема (8 мкг/мл), дорипенема (2 мкг/ мл), эртапенема (1 мкг/мл), колистина (2 мкг/мл), кларитромицина (1 мкг/мл), рифампицина (2 мкг/мл), а также 11 их комбинаций (меропенем + колистин, имипенем + колистин, дорипенем + колистин, эртапенем + колистин, колистин + кларитромицин, меропенем + колистин + кларитромицин, дорипенем + колистин + кларитромицин, колистин + рифампицин, меропенем + колистин + рифампицин, меропенем + эртапенем, дорипенем + эртапенем).
На втором этапе исследования для оценки способности антибиотиков потенцировать активность колистина в отношении колистинорезистентных штаммов K pneumoniae выполнялось определение МПК колистина в присутствии фиксированной концентрации второго антибиотика, соответствующей его ФК/ФД концентрации. При отсутствии сведений о ФК/ФД концентрации антибиотика тестировали концентрацию, соответствующую пограничному значению МПК для стафилококков (рифампицин, макролиды), рекомендованную EUCAST [7]. Фактор потенцирования (ФП) рассчитывали как соотношение МПК колистина к МПК
колистина в присутствии фиксированной концентрации второго антибиотика.
Контроль качества исследований выполняли с использованием референтных штаммов Американской коллекции типовых культур E. coli ATCC 25922 и S. aureus ATCC 29213.
Результаты и обсуждение
Результаты определения бактерицидной активности антибиотиков и их комбинаций, полученные с использованием модифицированного MCBT представлены на рисунке 1. Бактерицидная активность колистина, кларитромицина и рифампицина отсутствовала. Бактерицидный эффект карбапенемов отмечен в отношении единичных штаммов (4,7-7,0%), все они являлись продуцентами карбапенемазы ОХА-48 и имели невысокие МПК меропенема (4-8 мкг/ мл). Бактерицидный эффект двойных комбинаций на основе колистина и карбапенемов проявлялся в отношении только 18,6-30,2% штаммов, что может быть связано с высокими значениями МПК колистина, значительно превышающими тестируемую в составе комбинаций концентрацию 2 мкг/мл.
Бактерицидный эффект комбинаций из двух карбапенемов (меропенем + эртапенем и дорипенем + эртапенем) отмечен только для 18,6-20,9% штаммов. Дополнительный анализ эффективности этих комбинаций позволил выявить связь с МПК карбапенемов и присутствием карбапенемаз различных типов. Все чувствительные к комбинациям ме-ропенем + эртапенем и дорипенем + эртапенем штаммы K. pneumoniae являлись продуцентами карбапенема-зы OXA-48 и имели МПК меропенема не более 32 мкг/мл. В то же время для
продуцентов карбапенемазы KPC (МПК меропенема - 64 и 1024 мкг/мл), NDM (МПК меропенема - 128-1024 мкг/мл), ко-продуцентов карбапенемаз NDM и OXA-48 (МПК меропенема - 512 мкг/мл) бактерицидный эффект комбинаций из двух карбапенемов отсутствовал. Таким образом, МПК меропенема может быть предиктором эффективности указанных двойных комбинаций. Подобные результаты приведены в статье A. Oliva и соавт., где с использованием метода шахматной доски и кривых роста-отмирания показана зависимость синергидной активности комбинации меропенем + эртапенем в отношении карбапенемазапродуцирую-щих штаммов K. pneumoniae от величины МПК меропенема [ 8]. Для прогнозирования клинической эффективности комбинаций из двух карбапенемов требуется определение истинных значений МПК меропенема или дорипенема, поскольку получаемые с помощью широко используемых автоматизированных микробиологических анализаторов результаты (МПК>16 мкг/мл) могут соответствовать различным значениям МПК и не позволяют оценивать активность имеющихся у штамма карбапенемаз или иных механизмов устойчивости к карбапенемам.
Наиболее активными из двойных комбинаций являлись комбинации ко-листин + кларитромицин и колистин + рифампицин (бактерицидный эффект в отношении соответственно 58,1% и 53,5% исследуемых штаммов). Добавление в указанные комбинации карбапе-немов усиливало синергидный эффект, наибольшая активность отмечена для комбинации дорипенем + колистин + кларитромицин (79,1% чувствительных штаммов).
_Распределение МПК колистина и МПК колистина в присутствии
фиксированной концентрации антибиотика: А - кларитромицин (1 мкг/мл); Б -меропенем (8 мкг/мл) и кларитромицин (1 мкг/мл); В - рифампицин (2 мкг/мл)
16
о 14 §
§ 12
10
5 4 £ 2
ш
0,06 0,125 0,25
0,5 1 2 4 S МПК колистина, мкг/мл
■ КОЛ «КОЛ-КЛР
16
32
64
128
16
m
0 14
г
S 12
1 Ю 8 S
I 6
5 4
4
5 2
И
III
■ Ii
0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 МПК колистина, мкг/мл
16
32
64 128
I КОЛ
КОЛ+МЕР+КЛР
0,06 0,125 0,25
12 4 8 МПК колистина, мкг/мл
16
И
I КОЛ
I КОЛ-РИФ
32
64
128
Выявленный синергидный эффект колистина с антибиотиками, не способными в обычных условиях проникать через наружную мембрану K. pneumoniae и других грамотрицательных бактерий к внутриклеточным мишеням, заслуживает более детального изучения в отношении колистинорезистентных штаммов с экстремальной и полной антибиоти-корезистентностью. На рисунке 2 представлены гистограммы распределения МПК колистина и МПК колистина в присутствии фиксированной концентрации кларитромицина (1 мкг/мл), рифампи-цина (2 мкг/мл), а также фиксированных концентраций кларитромицина (1 мкг/ мл) и меропенема (8 мкг/мл). Эффект снижения МПК колистина (в 2 раза и
более) в присутствии 1 мкг/мл кларитромицина отмечен для 93,0% штаммов К. рпеитопае, при этом для 81,4% штаммов выявлено снижение МПК колистина до или ниже порогового значения 2 мкг/ мл, что формально восстанавливало их чувствительность. В присутствии 1 мкг/мл кларитромицина и 8 мкг/мл меропенема эффект потенцирования усиливался и отмечался уже в отношении 95,3% штаммов, для 84,0% штаммов МПК колистина уменьшалась до или ниже порогового значения 2 мкг/мл. Антагонистический эффект (увеличение МПК колистина в присутствии фиксированных концентраций кларитромицина или кларитромицина и меропенема) не был отмечен ни для одного из включенных
в исследование штаммов. Эффект снижения МПК колистина в присутствии 2 мкг/мл рифампицина отмечен для всех включенных в исследование штаммов K. pneumoniae, при этом МПК колистина снижалась до 0,06-1 мкг/мл.
Средние значения 1од2ФП (отражают количество двукратных разведений, на которое уменьшилась МПК колистина при добавлении фиксированной концентрации второго антибиотика) составили 5,72±0,44 при внесении 1 мкг/мл кларитромицина, 6,44±0,39 - при внесении
1 мкг/мл кларитромицина и 8 мкг/мл меропенема, 7,21±0,40 - при внесении
2 мкг/мл рифампицина.
Выявлено 2 штамма K. pneumoniae с высокими уровнями устойчивости к колистину (МПК - 128 мкг/мл), для которых не отмечался синергидный эффект колистина в присутствии фиксированных концентраций кларитромицина и клари-тромицина с меропенемом. Вместе с тем в присутствии 2 мкг рифампицина МПК колистина для этих штаммов снижалась в 128 и 512 раз до 0,25-1,0 мкг/мл, что указывает на вероятный механизм выявленных синергидных взаимодействий. В многочисленных исследованиях было показано, что колистин повышает эффективность ряда антибиотиков, обеспечивая их проникновение в клетку, но при этом не влияет на их внутриклеточную активность [9]. Вероятно, в отношении колистинорезистентных штаммов K. pneumoniae эффект потенцирования за счет увеличения проницаемости наружной мембраны проявляется даже при воздействии небольших концентраций колистина, не способных самостоятельно вызвать лизис микробной клетки.
Заключение
Выявлена выраженная синергид-ная активность комбинаций колистина с кларитромицином в отношении коли-стинорезистентных карбапенемазопро-дуцирующих штаммов K. pneumoniae, которая усиливалась в присутствии меропенема или дорипенема. Наибольшая микробиологическая активность обнаружена для комбинации дорипенем (2 мкг/мл) - колистин (2 мкг/мл) -кларитромицин (1 мкг/мл), которая оказывала бактерицидное действие на 79,1% штаммов. Возможным механизмом выявленных синергидных взаимодействий является значительное увеличение проницаемости наружной
мембраны для макролидов в присутствии даже небольших концентраций колистина, что делает возможным их доступ к внутриклеточным мишеням.
Бактерицидный эффект комбинаций из двух карбапенемов (меропенем + эртапенем, дорипенем + эртапенем) проявлялся только в отношении штаммов с относительно невысокими значениями МПК меропенема (4-32 мкг/мл), что требует определения истинных МПК карбапенемов для прогнозирования клинической эффективности указанных комбинаций при лечении инфекций, вызванных экстремально антибиотикоре-зистентными штаммами K. pneumoniae.
Полученные результаты открывают перспективы для клинического использования альтернативных схем комбинированной антибиотикотерапии инфекций, вызванных колистинорезистентными XDR и PDR штаммами K. pneumoniae,
основанных на включении антибиотиков, не способных в обычных условиях проникать через наружную мембрану. Доступ антибиотиков к внутриклеточным мишеням открывается в присутствии концентраций колистина, часто не превышающих его ФК/ФД концентрации, а эффект комбинированного воздействия является бактерицидным и проявляется даже в отношении колистинорезистентных штаммов с высокими значениями МПК.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склее-нова Е.Ю. и др. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2019. - Т.21, №2. - С.147-159.
2. Тапальский Д.В. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2018. - Т.20, №3. - С.182-191.
3. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Евсеенко Е.О. и др. // Здравоохранение. - 2017. - №3. - С.40-47.
4. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. //
Медицинский журнал. - 2012. - №2. - С.10—15.
5. Aaron S.D., Ferris W., Henry D.A., et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2000. - Vol.161. - P.1206-1212.
6. Bradford P.A., Kazmierczak K.M., Biedenbach D.J., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2015. -Vol.60. - P.1385-1392.
7. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (EUCAST). Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Ver. 9.0., 2019. Available at: www.eucast.org/clinical_breakpoints/. Accessed October 01, 2019.
8. Oliva A., Scorzolini L., Cipolla A., et al. // J. Antimicrob. Chemother. - 2017. - Vol.72. - P.1981-1984.
9. Sheu C.C., Chang YT., Lin SY, et al. // Front. Microbiol. - 2019. - Vol.10. - Art.80.
10. Tacconelli E., Carrara E., Savoldi A., et al. // Lancet Infect. Dis. - 2018. - Vol.18. - P.318-327.
11. van Duin D., Doi Y // Virulence. - 2017. - Vol.8. -P.460-469.
12. Zavascki A.P., Bulitta J.B., Landersdorfer C.B. // Expert Rev Anti Infect. Ther. - 2013. - Vol.11. -P.1333-1353.
Поступила 22.11.2019 г.
(Д. Международные Обзоры;
клиническая практика и здоровье
Интернет-сайт
www.mednovosti.by
Повысить цитируемость? Легко!
Публикуясь в высокоцитируемом журнале «Медицинские новости» (издание входит в перечень ВАК Республики Беларусь и ряда стран СНГ), Вы повышаете цитируемость своих статей. Кроме того, Вы можете разместить свои статьи в нашем электронном журнале открытого доступа «Международные обзоры: клиническая практика и здоровье», выходящем в свет с 2013 года, и на сайте mednovosti.by.
Медицинские новости - самое высокоцитируемое периодическое издание среди журналов медицинского профиля в Беларуси (85-е место по цитируемости среди зарубежных медицинских журналов). В электронных библиотеках eLIBRARY.ru журнал «Медицинские новости» имеет цитируемость - 8346, индекс Хирша - 14, impact factor - 0,237, число просмотров статей в 2017 г. - 12 829, а в КиберЛенинке: просмотр статей - 448 642, копирование статей - 99 908.
Главные преимущества электронного журнала «Международные обзоры: клиническая практика и здоровье»
Эффективность:
s доступен в базах научных электронных библиотек eLIBRARY.ru (индекс Хирша - 5; число просмотров статей в 2017 г. - 4754, скопировано - 1449 статей) и КиберЛенинка (число просмотров статей: составило 200 266, скопировано - 54 206 статей).
s по международной бесплатной подписке журнал «Международные обзоры: клиническая практика и здоровье» рассылается
на 2 500 ведомственных и индивидуальных электронных адресов s находится в свободном доступе на главной странице сайта mednovosti.by, который, по данным Google Analytics, ежемесячно посещают более 320 тысяч пользователей из 124 стран мира
Удобство:
s публикуясь в наших электронных изданиях, Вы формируете в сети Интернет полнотекстовую библиотеку собственных опубликованных научных работ, с каждой из которых Вы можете ознакомиться в любом месте и в любое удобное для Вас время, а также поделиться ссылкой в социальных сетях с коллегами s возможно ретроспективное размещение Ваших статей, опубликованных в прошлые годы в журналах «Медицинские новости», на нашем сайте mednovosti.by и в журнале «Международные обзоры: клиническая практика и здоровье»
Практичность:
s электронный журнал можно читать в режиме листания страниц на любом носителе (компьютер, ноутбук, планшет, смартфон),
показывать на демонстрационном экране в аудитории s есть возможность публиковать статьи с полноразмерными цветными иллюстрациями и фото в режиме слайд-шоу s можно размещать видеоролики (проведение уникальной операции) и со звуком (востребовано в кардиологии, к примеру, услышать тоны сердца)
Публикуясь в журнале «Медицинские новости» с последующим размещением на сайте mednovosti.by и в электронном журнале открытого доступа «Международные обзоры: клиническая практика и здоровье», Вы автоматически попадаете в электронные бибилиотеки eLIBRARY.ru и КиберЛенинку и существенно повышаете свою цитируемость.
Тел. редакции (+37517) 373-07-01; моб. (+375 29) 69 59 419. E-mail: redakcia1995@mail.ru
