Бактерии рода Bacillus на Международной космической станции

Еникеев Радмир Рустамович; Захарчук Леонид Михайлович

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

УДК 579.65

Бактерии рода Bacillus на Международной космической станции

P.P. Еникеев*©, JI.M. 3 ах арчу к©

Кафедра микробиологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 'e-mail: [email protected]

С поверхностей оборудования российского сегмента Международной космической станции получены чистые культуры 19 штаммов спорообразующих бактерий. Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств этих бактерий позволило отнести все штаммы к роду Bacillus. В результате использования методов MALDI-TOF и полногеномного секвенирования установлено, что из 19 штаммов бацилл шесть принадлежат к виду B. paralicheniformis, четыре — к B. pumilus, четыре — к B. subtilis, два — к B. cereus и один — к B. amyloliquefaciens. В соответствии с требованиями и нормами EUCAST 2023 изучена устойчивость полученных из российского сегмента Международной космической станции штаммов бацилл к таким антибиотикам, как имипенем, меропенем, ципрофлоксацин, левофлоксацин, норфлоксацин, ванкомицин, эритромицин, клиндамицин и линезолид. У 11 штаммов бацилл обнаружена резистентность к эритромицину, у пяти штаммов — к клиндамицину. Лишь по одному штамму проявили резистентость к имипенему, левофлоксацину и норфлоксацину соответственно. Анализ полного генома штаммов бактерий, у которых была обнаружена устойчивость к эритромицину и/или клиндамицину, позволил установить, что резистентность к этим антибиотикам у B. paralicheniformis штаммов SE71, SE131, SE181, SE182 и SE183 обеспечивает ген резистентности к антибиотикам ermD. У B. cereus SE43 устойчивость к эритромицину кодирует ген mphL.

Ключевые слова: Российский сегмент Международной космической станции, бактерии рода Bacillus, устойчивость к антибиотикам, гены устойчивости, Bacillus cereus, Bacillus paralicheniformis

DOI: 10.55959/MSU0137-0952-16-78-3-5

Введение

Исследования состояния здоровья космонавтов на Международной космической станции (МКС) показывают, что работа в космосе приводит к потере мышечной массы, ухудшению зрения, снижению иммунитета, стрессам и нарушениям в микробиоме [1]. Важно, что в космосе люди зависят от наземной службы поддержки — в частности, не могут пользоваться клиническим сопровождением, поэтому особенно уязвимы к заболеваниям. МКС представляет собой замкнутое пространство с постоянной температурой, повышенной влажностью, наличием доступных субстратов и является благоприятной средой для развития микроорганизмов. Микробиом МКС напоминает некоторые микробиомы «закрытых помещений» на Земле — домов, офисов, больниц и содержит множество бактерий, грибов и вирусов [2]. Исследования микробиома МКС показало, что там встречаются в основном представители родов Bacillus, Micrococcus и Staphylococcus [3]. Сле-

довательно, на борту МКС особенно важную роль играют спорообразующие представители Bacillus, способные выживать в неблагоприятных условиях среды. При этом известно, что некоторые виды бацилл способны вызывать заболевания [4].

Целями настоящей работы стало выделение с рабочих поверхностей российского сегмента Международной космической станции (РС МКС) изолятов спорообразующих штаммов бактерий рода Bacillus, их идентификация, изучение физио-лого-биохимических свойств, а также определение устойчивости к ряду клинически значимых антибиотиков и выявление возможных механизмов этой резистентности.

Материалы и методы

Отбор проб с поверхностей приборов РС МКС, их доставку на Землю, а также получение первичных изолятов бактерий и чистых культур спорообразующих бактерий осуществляли, как описано ранее [5]. При исследовании морфологи-

ческих, культуральных и физиолого-биохимиче-ских признаков бактерий, а также дифференциация бактерий рода Bacillus от представителей сходных родов бактерий, образующих эндоспоры, основывались на соответствующих руководствах [6]. Первичную идентификацию чистых культур бактерий, по сумме признаков предположительно относящихся к роду Bacillus, осуществляли методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF) на приборе MALDI-TOF autoflex III L200 (Biotyper Bruker, Германия) [7]. Для оценки чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом использовали агар Мюллера-Хинтон состава (г/л): мясной экстракт сухой — 3,0; гидролизат казеина сухой — 17,5; крахмал растворимый — 0,5; агар — 18,0; вода дистиллированная — до 1 л, рН = 7,0 [8]. Суспензию бактерий 0,5 единиц по стандарту мутности Мак-Фарланда наносили на поверхность питательной среды в чашках Петри в количестве 200 мкл и распределяли с помощью стеклянного шпателя. Диски с антибиотиками (Научно-исследовательский центр фармакотерапии, Россия) наносили на поверхность засеянной среды, через 15 мин после инокуляции среды в чашках суспензией бактерий. Через 15 мин чашки с дисками помещали в термостат и инкубировали при 35°С в течение 20 ч [8]. Определяли специфические значения диаметров зон подавления роста бактерий антибиотиками, используемыми для оценки штаммов, в соответствии с клиническими категориями «чувствительный», «резистентный» или «зона технической неопределенности» по таблицам критериев интерпретации результатов, представленным European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) [8]. Выделение ДНК из клеток штаммов, выращенных на жидкой среде с мясопептонным бульоном и 1% глюкозы, проводили с помощью набора реактивов FastDNA Spin Kit (MP Biomedicals, США) по протоколу производителя. Геномную ДНК секвенировали с использованием платформ Illumina MiSeq (Illumina Inc., США). Библиотеки Illumina были подготовлены с использованием набора библиотек Kapa Hyperplus (Roche Molecular Systems Inc., Pleasanton, США) в соответствии с инструкциями производителя. Полученные последовательности были идентифицированы с использованием программы сверхбыстрой классификации метагеном-ных последовательностей Kraken [9]. Установление наличия в геноме штаммов бактерий рода Bacillus генов устойчивости к антибиотикам осуществляли с помощью базы данных The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) [10]. Результаты в их конечном виде получали путем вычисления среднего арифметического (Х) из результатов всех повторностей (Хп) при условии, что они различались не более чем на

10% (/Хп — Х/ < 0,05 Х). При этом расчет среднего арифметического проводили, исключая «сомнительные результаты» («Х»), не входящие в доверительный интервал /Хп — Х/ = t • ст, где Х — среднее арифметическое без учета «сомнительных результатов», t — нормированное отклонение при Р0,95 для малых выборок (п < 30), а ст — среднее квадратичное отклонение без учета «Х»:

КXn - X)2

n -1

Результаты и обсуждение

Получение и первичная характеристика штаммов бактерий. Получение первичных изолятов бактерий осуществляли высевами образцов материалов, отобранных на РС МКС, на поверхность плотных питательных сред — таких как мясопеп-тонный агар с 1% глюкозы и бульон сусло-агар. Из первичных изолятов были получены чистые культуры спорообразующих бактерий. Затем исследовали морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки соответствующих штаммов. Определяли такие свойства выделенных бактерий, как форма и диаметр клеток, образование эндоспор, окраска по Граму, отношение к кислороду, способность синтезировать каталазу и оксидазу, образование кислоты при сбраживании глюкозы, гидролиз крахмала, восстановление нитратов и некоторые другие физиологические и биохимические признаки (табл. 1). По сумме фенотипических признаков осуществлена дифференциация исследуемых штаммов от бактерий сходных родов, образующих эндоспоры, что позволило предположительно отнести 19 штаммов спорообразующих бактерий к роду Bacillus (табл. 1).

Идентификация штаммов с помощью MALDI-TOF. Дальнейшую идентификацию штаммов бактерий, по сумме признаков предположительно отнесенных к роду Bacillus, осуществляли методом MALDI-TOF [7]. Все 19 штаммов бактерий с использованием масс-спектрометрии были отнесены к роду Bacillus и идентифицированы до вида как B. subtilis (четыре штамма), B. pumilus (четыре штамма), B. licheniformis (три штамма), B. cereus (два штамма). При этом шесть штаммов бактерий рода Bacillus из 19 - SE21, SE41, SE71, SE132, SE161, SE183 - методом MALDI-TOF до вида идентифицировать не удалось (табл. 2).

Определение чувствительности к антибиотикам. У идентифицированных с помощью метода MALDI-TOF бактерий изучали устойчивость к действию ряда антибиотиков диско-диффузионным методом [8]. В последнем выпуске EUCAST 2023 [8] присутствуют критерии интерпретации для оценки устойчивости бактерий Bacillus spp. с помощью диско-диффузионного метода для таких антибиотиков, как имипенем, меропенем, ци-

профлоксацин, левофлоксацин, норфлоксацин, ванкомицин, эритромицин, клиндамицин и лине-золид, поэтому именно эти антибиотики были использованы в нашей работе. По размерам зон подавления роста штамма бактерии соответствующим антибиотиком этот штамм, в соответствии с таблицами, представленными в ЕиСАВТ 2023, можно было отнести к категориям чувствитель-

ный (S), резистентный (R) или к категории ATU — зоне технической неопределенности. Изучение устойчивости к перечисленным антибиотикам 19 штаммов бактерий рода Bacillus, выделенных из РС МКС, показало, что почти все 19 штаммов бацилл, выделенных из РС МКС, проявляют чувствительность к первым двум исследуемым антибиотикам — имипенему и меропенему (табл. 2).

Таблица 1

Морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки штаммов бактерий рода Bacillus, выделенных из проб,

доставленных из РС МКС

Параметр Штамм бактерий

SE 12 SE 21 SE 41 SE 42 SE 43 SE 4 SE 62 SE 71 SE 131 SE 132 SE 15 SE 161 SE 171 SE 17 SE 181 SE 182 SE 183 SE 191 SE 192

Диаметр клетки > 1 мкм - - - + +

Форма спор, округлые

Параспоральные кристаллы

Каталаза + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

УР-тест + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Рост при 50°С + + + - - + + + + + + + + + + + + + +

Анаэробный рост - + + + + - - + + + - + - - + + + - -

Образование кислоты при росте на глюкозе + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Образование газа при росте на глюкозе

Гидролиз крахмала + + + + + - + + + + + + - + + + + - -

Восстановление нитратов + + + + + - + + + + + + - + + + + - -

Использование цитрата + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Разложение тирозина - - - + +

Диаметры зон подавления роста штаммов бактерий рода Bacillus (в миллиметрах), выделенных из РС МКС, на среде Мюллера-Хинтон под действием дисков с разными антибиотиками

Идентификация штаммов на основании MALDI-TOF Антибиотик Идентификация штаммов на основании полногеномного секвенирования

Имипенем Меро-пенем Ципроф-локсацин Левофлоксацин Норфлоксацин Ванкомицин Эритромицин Клиндамицин Лине- золид

B. subtilis SE12 40 (S) 40 (S) 35 ATU 35 ATU 28 (S) 25 (S) 30 (S) 30 (S) 40 (S)

Bacillus sp. SE21 40 (S) 40 (S) 35 ATU 36 ATU 25 (S) 20 (S) 22 (R) 30 (S) 26 (S)

Bacillus sp. SE41 32 (S) 32 (S) 30 ATU 30 ATU 25 (S) 18 (S) 21 (R) 30 (S) 40 (S) B. amyloliquefaciens SE41

B. cereus SE42 32 (S) 38 (S) 25 ATU 22 (R) 30 (S) 20 (S) 28 (S) 25 (S) 34 (S) B. cereus SE42

B. cereus SE43 34 (S) 37 (S) 26 ATU 25 ATU 20 (R) 16 (S) 17 (R) 30 (S) 30 (S) B. cereus SE 43

B. pumilus SE4 35 (S) 35 (S) 35 ATU 35 ATU 32 (S) 30 (S) 35 (S) 35 (S) 45 (S)

B. subtilis SE62 40 (S) 40 (S) 35 ATU 38 ATU 30 (S) 19 (S) 20 (S) 30 (S) 29 (S)

Bacillus sp. SE71 32 (S) 30 (S) 32 ATU 30 ATU 30 (S) 20 (S) 16 (R) 11 (R) 35 (S) B. paralicheniformis SE71

B. licheniformis SE131 35 (S) 35 (S) 30 ATU 26 ATU 26 (S) 21 (S) 3 (R) 12 (R) 34 (S) B. paralicheniformis SE131

Bacillus sp. SE132 42 (S) 40 (S) 32 ATU 32 ATU 26 (S) 20 (S) 25 (S) 25 (S) 30 (S)

B. subtilis SE15 35 (S) 35 (S) 35 ATU 30 ATU 30 (S) 26 (S) 2 (R) 25 (S) 35 (S)

Bacillus sp. SE161 40 (S) 37 (S) 25 ATU 29 ATU 30 (S) 24 (S) 4 (R) 13 (R) 40 (S) B. paralicheniformis SE161

B. pumilus SE171 38 (S) 40 (S) 35 ATU 37 ATU 26 (S) 21 (S) 15 (R) 30 (S) 30 (S)

B. subtilis SE17 40 (S) 40 (S) 28 ATU 27 ATU 27 (S) 24 (S) 28 (S) 20 (S) 31 (S)

B. licheniformis SE181 36 (S) 40 (S) 35 ATU 35 ATU 30 (S) 23 (S) 17 (R) 14 (R) 35 (S) B. paralicheniformis SE181

B. licheniformis SE182 30 (S) 30 (S) 34 ATU 29 ATU 24 (S) 20 (S) 20 (R) 21 (S) 30 (S) B. paralicheniformis SE182

Bacillus sp. SE183 40 (S) 40 (S) 31 ATU 32 ATU 31 (S) 22 (S) 20 (R) 15 (R) 28 (S) B. paralicheniformis SE183

B. pumilus SE191 31 (S) 31 (S) 31 ATU 35 ATU 25 (S) 19 (S) 28 (S) 20 (S) 28 (S)

B. pumilus SE192 29 (R) 25 (S) 33 ATU 33 ATU 25 (S) 20 (S) 30 (S) 25 (S) 26 (S)

Примечание: знак В означает чувствительный штамм; К — резистентный; АТи — зона технической неопределенности.

Таблица 2

Только у B. pumilus SE192 обнаружена устойчивость к имипенему. Опыты с еще двумя антибиотиками - ципрофлоксацином и левофлоксаци-ном - показали принадлежность штаммов в основном к категории ATU (табл. 2), когда по зонам подавления роста бактерий на основании имеющихся в литературе данных трудно или невозможно определить клиническую эффективность и возможность практического применения препаратов для лечения больных без получения дополнительных данных [8]. И только один штамм — Bacillus sp. SE42 показал устойчивость к левофлоксацину (табл. 2). К следующим антибиотикам - норфлоксацину и ванкомицину -почти все штаммы также проявили чувствительность, кроме штамма B. cereus SE43, проявившего устойчивость к норфлоксацину (табл. 2). Особенно интересные результаты получились при использовании для подавления роста бактерий дисков с эритромицином. У 11 штаммов из 19 обнаружена резистентность к этому антибиотику (табл. 2). Следующим антибиотиком был клинда-мицин, к которому пять штаммов бацилл показали устойчивость. А к последнему из исследуемых антибиотиков - линезолиду - все 19 штаммов Bacillus проявили чувствительность (табл. 2). Следует отметить, что 5 из 19 штаммов бацилл — SE71, SE131, SE161, SE181 и SE183 проявили устойчивость к двум антибиотикам — эритромицину и клиндамицину (табл. 2).

Полногеномное секвенирование и определение наличия генов устойчивости. С целью уточнения систематического положения штаммов бацилл, проявивших устойчивость к антибиотикам (табл. 2), а также для определения наличия генов устойчивости к этим антибиотикам было проведено полногеномное секвенирование прежде всего условных патогенов B. cereus SE42 и B. cereus SE43, а также штаммов, проявивших устойчивость к эритромицину и клиндамицину (табл. 2). Результаты полногеномного секвенирования подтвердили принадлежность штаммов SE42 и SE43 к виду B. cereus. Установлено также, что штаммы бацилл, идентифицированные по методу MALDI-TOF как B. licheniformis SE131, SE181, SE182, следует отнести к B. paralicheniformis SE131, SE181, SE182. Кроме того, штаммы Bacillus sp. SE71, SE161, SE183 по результатам полногеномного секвенирования также идентифицированы как B. paralicheniformis SE71, SE161, SE183 (табл. 2). Таким образом, в результате использования методов MALDI-TOF и полногеномного секвенирова-ния удалось показать, что из 19 штаммов бацилл шесть принадлежат к виду B. paralicheniformis, по четыре — к B. pumilus и B. subtilis, два — к B. cereus и один — к B. amyloliquefaciens (табл. 2). С помощью данных полногеномного секвенирования штаммов, проявивших устойчивость к рекомендуемым для бацилл антибиотикам (табл. 2), с ис-

пользованием базы данных CARD [10] установлено наличие в геномах большинства штаммов бацилл, резистентных к эритромицину и клинда-мицину, гена ermD (эритромицин-резистентная метилаза), ответственного за устойчивость к макролиду эритромицину и линкозамиду клиндами-цину (табл. 3). Механизмом устойчивости к этим антибиотикам является посттранскрипционная модификация рибосомальной РНК 23 S путем моно/диметилирования остатка аденина. В результате нарушается комплементарность антибиотика к рибосоме и препарат не может ингиби-ровать синтез белка. Все метилазы рРНК метилируют один и тот же остаток аденина, что приводит к фенотипу устойчивости к макроли-дам-линкозамидам-стрептограмину В, при этом было показано, что гены erm обеспечивают перекрестную резистентность к эритромицину и клиндамицину у B. licheniformis и B. paralicheniformis и преобладают у бактерий с высокой муль-тирезистентностью [11, 12]. Полногеномное сек-венирование и фенотипическое тестирование 104 штаммов B. licheniformis и B. paralicheniformis из различных источников показало, что у всех 30 штаммов B. paralicheniformis и у 20 из 74 штаммов B. licheniformis обнаружен хромосомный ген ermD, кодирующий рРНК-аденин-Н6-димети-лазу, состоящую из 286—287 аминокислот [13]. Следовательно, устойчивость к эритромицину у бацилл очень хорошо коррелирует с наличием гена ermD. Ген ermD обнаружен нами у штаммов B. paralicheniformis SE71, SE131, SE181, SE182, SE183 (табл. 3). Показано, что классы генов ermD и ermС локализованы на хромосоме у B. licheniformis, B. paralicheniformis и близкородственных видов Bacillus, резистентных к эритромицину и клиндамицину, при этом они не связаны с какими-либо мобильными генетическими элементами [11, 13]. Кроме генов ermD у бактерий B. paralicheniformis SE71, SE131, SE181, SE182, SE183 обнаружены гены устойчивости к бацитра-цину bcrA, bcrB и bcrC (табл. 3). Эти гены кодируют АТФ-связывающие кассетные транспортеры (ATP-binding cassette), обычно участвующие в транслокации родственных им субстратов, которая управляется гидролизом АТФ. Переносчик BcrABC обеспечивает иммунитет к синтезирующему бацитрацин штамму B. licheniformis [14]. В этой системе белки BcrB и BcrC образуют трансмембранный канал, в то время как два белка BcrA функционируют как АТФазы, обеспечивающие транспорт энергии. Механизм устойчивости к бацитрацину, обеспечиваемый переносчиками Bcr, универсален — он одинаково функционален как у B. subtilis, так и у грамотрицательной кишечной палочки [14].

У резистентного к эритромицину штамма B. cereus SE43, не имеющего генов erm, обнаружен ген mphL (табл. 3). Ген mphL является гомологом

кодируемых хромосомами макролидных фосфо-трансфераз (МрЬБ), которые инактивируют 14-и 15-членные макролиды эритромицин, кларитро-мицин, азитромицин у B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis [15]. Ферменты МрЬБ инактивируют ма-кролид путем его модификации фосфорилирова-нием 2'-ОН незаменимого диметиламиносахара, что предотвращает связывание антибиотика с рибосомой. Существует два функциональных кластера МрИБ в группе бактерий B. cereus. МрИБ кластера А инактивируют только 14—15-членные макролиды, в то время как МрИБ кластера В инактивируют 14-, 15- и 16-членные соединения. Область генома, окружающая ген mph кластера В, связана с различ-

ными плазмидными последовательностями, что позволяет предположить, что этот ген является геном приобретенной резистентности. Напротив, ген mph кластера А расположен в хромосомной области, консервативной среди всех изолятов группы B. cereus, и имеющиеся данные указывают на то, что он был приобретен на ранней стадии эволюции группы. Следовательно, ген mphL, инактивирую-щий только 14- и 15-членные макролиды и относящийся к кластеру А, можно считать геном внутренней резистентности, не связанным с плазмидными последовательностями. У резистентного к эритромицину B. cereus 8Б43 обнаружен также ген ЬЫ-1 (табл. 3), кодирующий хромосомную в-лактамазу

Таблица 3

Гены устойчивости к антибиотикам, обнаруженные у штаммов бактерий рода Bacillus с использованием базы данных CARD

Идентификация штаммов на основании полногеномного Ген Кодирует действие на классы антибиотиков Механизм действия Ссылка

секвенирования

B. cereus SE42 clbA линкозамиды, стрептограмин, стрептограмин А, оксазолидинон, феникол, плевромутилин изменение мишени антибиотика [20]

bcl-1 цефалоспорины, пенициллины инактивация антибиотика [16]

satA нуклеозидные антибиотики инактивация антибиотика [17]

bcl-1 цефалоспорины, пенициллины инактивация антибиотика [16]

B. cereus SE43 bla2 карбапенем, цефалоспорин, пенам инактивация антибиотика [18]

mphL макролиды инактивация антибиотика [15]

fosB фосфомицин инактивация антибиотика [19]