CC BY
9
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 579.65
Механизмы устойчивости к клинически значимым антибиотикам у штаммов бактерий рода Bacillus, выделенных из образцов, полученных из медицинского учреждения
P.P. Еникеев* , Н.Ю. Татаринова , JI.M. Захарчук , E.H. Виноградова
Кафедра микробиологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 *e-mail: radmir.yenikeyev@gmail.com
Получены изоляты штаммов бактерий, доминирующих на поверхностях оборудования медицинской лаборатории для отбора анализов крови. Чистые культуры этих бактерий идентифицированы как Bacillus cereus HSA01, Bacillus cereus HSA12, Bacillus cereus HSA03, Bacillus subtilis HSA06, Bacillus amyloliquefaciens HSA09. Определена устойчивость бактерий к ряду ß-лактамных антибиотиков и спектиномицину. Все штаммы устойчивы к пенициллину и ампициллину со значением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) от 256 до 2048 мкг/мл, а также к антибиотикам цефалоспоринового ряда со значением МИК от 2 до 2048 мкг/мл. Резистентность бактерий к спектиномицину, применяемому у пациентов с аллергией на пенициллины и цефалоспорины, находится в диапазоне МИК от 16 до 256 мкг/мл.
У B. cereus HSA01 устойчивость к ампициллину и цефуроксиму обусловлена работой эф-флюкс-насосов, к цефтазидиму обеспечивается действием металло-Р-лактамаз (МБЛ), а к пенициллину объясняется работой обеих этих систем. Высокая устойчивость к ампициллину B. cereus HSA12 обеспечивается действием МБЛ, к цефуроксиму — активностью эффлюкса, в то время как резистентность к цефтазидиму сопровождается наличием МБЛ и действием эффлюкс-насосов. У B. cereus HSA03 резистентность к пенициллину, ампициллину, цефепиму и цефтазидиму объясняется активностью эффлюкса, к цефазо-лину и цефтазидиму обеспечивается действием МБЛ, а к ампициллину и цефтазидиму обусловлена наличием как МБЛ, так и эффлюкса. Устойчивость B. subtilis HSA06 к пенициллину и ампициллину обеспечивает только активность МБЛ. У B. amyloliquefaciens HSA09 устойчивость к ампициллину объясняется как наличием МБЛ, так и действием эффлюкс-насосов, а к пенициллину обеспечивается только действием эффлюкса. Таким образом, у исследованной группы бацилл резистентность к пенициллину, ампициллину и ряду производных цефалоспорина обеспечивают, в зависимости от штамма и конкретного антибиотика, металло-Р-лактамазы и/или эффлюкс-насосы. Насосы относятся к группе второстепенных транспортеров.
Ключевые слова: бактерии рода Bacillus, устойчивость к антибиотикам, минимальная ингиби-рующая концентрация, эффлюкс-насосы, активность ß-лактамаз, асептические помещения
Любая обитаемая среда на Земле, в которой люди проводят большую часть своего времени, характеризуется определенным микробным сообществом. Воздушное пространство и рабочие поверхности большинства рабочих помещений подвергаются очистке от микроорганизмов с помощью систем естественной вентиляции и влажной уборки с применением моющих веществ. Только в некоторых специальных помещениях — операционных, родильных отделениях, палатах интенсивной терапии, лабораториях для отбора проб крови, асептических комнатах для производства медицинских препаратов количество микроорганизмов в воздухе и на поверхностях оборудования поддерживается на минимальном уровне с помощью бактериальных фильтров, уль-
трафиолетового облучения и дезинфицирующих растворов.
Одним из видов таких асептических помещений являются лабораторные комнаты для отбора проб крови. Эти помещения являются агрессивной для микроорганизмов средой обитания в связи с постоянным воздействием УФ-излучения и регулярным использованием различных дезинфицирующих средств. В основе микробной контаминации таких помещений лежит постоянный приток новых посетителей, как правило, подвергающихся лечению антибиотиками и имеющих низкий иммунный статус. В результате на рабочих поверхностях лабораторных комнат выживают штаммы бактерий, устойчивых к дезинфицирующим растворам и часто обладающие множественной лекарственной
устойчивостью (МЛУ) [1]. Резистентные к УФ-излу-чению и дезинфицирующим средствам (чаще всего спорообразующие) бактерии, способны вызывать множество заболеваний у человека. Так установлено, что бактерии рода Bacillus являются возбудителями многих заболеваний, особенно у людей со сниженным иммунитетом [2—4]. Однако информации о клинических характеристиках бактерий, обитающих в чистых комнатах и асептических помещениях, еще очень мало. Известно, что МЛУ у бактерий может быть обусловлена одним или одновременно несколькими механизмами [1].
Целями работы были выделение из лаборатории для отбора проб крови изолятов бактерий рода Bacillus, их идентификация, изучение устойчивости к ряду клинически значимых ß-лакта-мных антибиотиков и определение возможных механизмов этой резистентности.
Материалы и методы
Исследовали бактерии, выделенные из смывов рабочих поверхностей оборудования больничной лаборатории, предназначенной для отбора проб крови. Отбор проб, получение изолятов и чистых культур выполняли аналогично забору и анализу проб из Российского сегмента международной космической станции [5]. Пробы отбирали до начала работы лаборатории, через 10 мин после ночного УФ-облучения и утренней антисептической обработки рабочих поверхностей дезраство-рами. Идентификацию бактерий осуществляли путем анализа генов 16S рРНК [6]. Выделение ДНК из клеток штаммов, выращенных на жидкой среде с мясо-пептонным бульоном (МПБ) и 1% глюкозы, проводили с помощью комплекта реактивов Genomic DNA Purification Kit KO 512 (Thermo Scientific, США) по методике, рекомендуемой разработчиками этого комплекта реактивов. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием праймеров (Синтол, Россия) B63f (5'-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3) и B1387r (5-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3'). Полученные фрагменты ДНК разделяли в агароз-ном геле с помощью электрофореза (120 В). Ага-розный гель готовили, добавляя агарозу (1—1,2%) в 1х трис-ацетатный (ТАЕ) буфер, нагревали до 90—95 °С, перемешивали до полного растворения агарозы, добавляли 7,5 мкл раствора бромистого этидия на каждые 150 мл раствора, охлаждали до 45—50 °С и заливали в специальную форму. После полимеризации гель переносили в электрофорез-ную горизонтальную камеру Mini-SubCellGT (BioRad, США). В образцы с фрагментами ДНК добавляли буфер в объемном соотношении 1:5. Электрофоретическое разделение проводили в буфере 1 х ТАЕ. Фрагменты нуклеиновых кислот определяли в УФ-свете. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABIPRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 (Thermo
Scientific, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Thermo Scientific, США). Для видовой идентификации проводили сравнение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК с базой данных GenBank. Сходство штаммов с ближайшим гомологом гена 16S рРНК составляло 99,1—99,6%. Для подтверждения данных по идентификации бактерий, полученных анализом генов 16S рРНК, их идентификацию проводили также методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией — MALDI-ToF [7]. Идентификация микроорганизмов была осуществлена на приборе MALDI-Tof autoflex III L200 Biotyper (Bruker, Германия). Определение значения минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков (МИК) проводили методом их последовательных двукратных разведений с использованием 96-луночных планшетов (Eppendorf, Германия), как описано ранее [5]. Получали суточную культуру бактерий в МПБ с 1% глюкозы с оптической плотностью 1,0 (OD 600 нм), затем суспензию клеток разбавляли МПБ до оптической плотности 0,1 (OD 600 нм) и вносили в лунки. Далее в лунки вносили антибиотик так, чтобы его концентрация в лунке первого ряда 12-рядно-го планшета составляла 4096 мкг/мл с последующим двукратным разведением в лунках следующих 11 рядов до концентрации 2 мкг/мл. Для оценки роста бактерий в каждую лунку добавляли резазурин (Sigma, США) до концентрации 50 мкМ. В последнем выпуске The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (http://www.eucast.org. EUCAST, v.12.0. 2022) критерии интерпретации для оценки устойчивости Bacillus spp. к цефалоспоринам отсутствуют, но присутствуют для очень близких по механизму и спектру действия к цефалоспоринам антибиотикам — представителям класса ß-лактамных антибиотиков широкого спектра действия — имипене-му и меропенему (карбапенемы). При этом значения МИК имипенема для устойчивых к нему штаммов комплекса Bacillus cereus приводятся в диапазоне выше 0,5 мкг/мл. Таким образом, в случае цефалоспринов можно считать устойчивыми к ним все штаммы Bacillus spp. со значениями МИК этих антибиотиков выше 2 мкг/мл.
Для определения активности эффлюкса в 96-луночный планшет вносили питательную среду и соответствующий антибиотик в концентрации от 4096 до 1 мкг/мл, а затем в каждую лунку добавляли протонофор — карбонил-цианид-3-хлорфенилгидразон (carbonyl-cyanide-3-chlorophenylhydrazone, CCCP, Sigma, США) в концентрации 2 мкг/мл. В качестве контролей использовали лунки с антибиотиком, но без добавления CCCP и лунки, содержащие только питательную среду с культурой и CCCP. О влиянии
CCCP на рост судили, добавляя резазурин в концентрации 50 мкМ [8]. Активность эффлюкса оценивали по отношению кратности уменьшения (КУ) МИК антибиотиков в культурах без CCCP к значениям МИК при его добавлении. При величине КУ<4 отмечали отсутствие эф-флюкса, при КУ в диапазоне от 4 до 16 регистрировали его умеренную активность, а при КУ>16 фиксировали высокую активность [8].
Для оценки активности металл о-ß-лактамаз (МБЛ) использовали метод дисков с ЭДТА [9, 10]. Суспензию клеток распределяли по поверхности агара Мюллера-Хинтона. Затем в центр среды помещали диск с 10 мкл 0,5 М раствора ЭДТА, а на расстоянии 15 мм от него диски с антибиотиками. Образование зоны подавления роста бактериального газона между диском с ЭДТА и диском, содержащим антибиотик, расценивали как наличие продукции МБЛ у тестируемой бактерии. Гены клинически значимых лактамаз детектировали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-Time PCR, RT-PCR) с помощью набора «Гены VIM, NDM, OXA-48, KPC, обуславливающие резистентность к карбапенемам, природным и полусинтетическим пенициллинам, цефалоспоринам I, II, III и IV поколений» (Литех, Россия), согласно инструкции производителя. Бактериальную ДНК для этого выделяли с помощью набора ДНК-сорб (Интерлабсервис, Россия). Все опыты проводили трехкратно в двух повторностях в каждой серии. Результаты в их конечном виде (приведенные в таблицах) получали путем вычисления среднего арифметического (Х) из результатов всех повторностей (Хп) при условии, что они различались не более чем на 10% (/Хп - Х/ < 0,05 Х). При этом расчет среднего арифметического проводили, исключая «сомнительные результаты» («Х»), не входящие в доверительный интервал /Хп - Х/ = t • о, где Х - среднее арифметическое без учета «сомнительных результатов», t — нормированное отклонение при Р0,95 для малых выборок (п<30), а о - среднее квадратичное отклонение (±У (£(Хп - Х)2/(п-1)) без учета «Х».
Результаты и обсуждение
Получение и идентификация культур. В процессе получения изолятов бактерий по макромор-фологическим (колонии на плотной среде) и микроморфологическим (морфология клеток под микроскопом) характеристикам из двадцати изо-лятов были отобраны пять, доминирующих по частоте встречаемости их колоний на плотных средах. Результаты идентификации чистых культур до вида, которые были осуществлены анализом последовательностей 16S рРНК и анализом белков методом MALDI-ToF, полностью совпали. Бактерии идентифицированы как Bacillus cereus HSA01, Bacillus cereus HSA12, Bacillus cereus HSA03, Bacillus subtilis HSA06 и Bacillus amyloliquefaciens HSA09.
Определение МИК. Исследована устойчивость бактерий к ряду ß-лактамных антибиотиков — пенициллину, ампициллину, производным цефало-спорина I-го (цефазолин), II-го (цефуроксим), III-го (цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидим), IV-го (цефепим) поколений и спектиномицину. Спекти-номицин не относится к ß-лактамным антибиотикам и используется в качестве резервного препарата в случаях невозможности лечения пациентов цефалоспоринами третьего и четвертого поколений из-за аллергических реакций (табл. 1). Три из выделенных штаммов бактерий — B. cereus HSA01, B. cereus HSA12, B. cereus HSA03 показали очень высокую резистентность к пенициллину и ампициллину со значением МИК 2048 мкг/мл (табл. 1). Устойчивость B. subtilis HSA06 и B. amyloliquefaciens HSA09 к пенициллину и ампициллину оказалась ниже. Значения МИК для этих антибиотиков у B. amyloliquefaciens HSA09 составляли 1024 мкг/мл, а у B. subtilis HSA06 — 256 мкг/мл (табл. 1). Устойчивость B. cereus HSA01, B. cereus HSA12, B. cereus HSA03 к антибиотикам цефалоспоринового ряда оказалась в несколько раз ниже, чем к пенициллину и ампициллину, однако значения МИК были достаточно высокими и составляли от 64 до 1024 мкг/мл. В отличие от этого штаммы B. subtilis HSA 06 и B. amyloliquefaciens HSA09 показали устойчивость только к традиционным антибиотикам ампициллину и пенициллину с МИК 1024 мкг/мл, в то время как устойчивость этих штаммов к цефа-лоспоринам I-IV-го поколений цефазолину, цефу-роксиму, цефтриаксону, цефоперазону, цефтази-диму и цефепиму была низкой со значениями МИК 2—4 мкг/мл. Все пять штаммов бацилл показали резистентность к спектиномицину в диапазоне МИК от 16 мкг/мл у B. subtilis HSA06 до 265 мкг/мл у B. cereus HSA01 (табл. 1).
Определение наличия эффлюкса. Эффлюкс является одним из основных механизмов защиты клеток от антибиотиков [11]. Возможность функционирования эффлюкс-насосов определяли для тех антибиотиков, к которым у бактерий была обнаружена высокая резистентность (табл. 1). Установлено, что у B. cereus HSA01 в присутствии пенициллина или ампициллина активность эф-флюкса высокая, так как кратность уменьшения значения МИК каждого из этих антибиотиков в присутствии СССР в среде составляла 32. У B. cereus HSA03 и B. amyloliquefaciens HSA09 активность эффлюкса в присутствии пенициллина или ампициллина умеренная. В то же время у B. cereus HSA12 и B. subtilis HSA06 наличие СССР в среде с этими антибиотиками не выявило функционирования эффлюкса (табл. 2).
Для изучения эффлюкса у B. cereus HSA01 были отобраны также цефуроксим, цефтазидим, цефепим (как цефалоспорины II, III и IV поколений, к которым у штамма HSA01 обнаружена высокая резистентност) и спектиномицин (как
антибиотик, заведомо не подверженный действию в-лактамазы и к которому штамм И8Л01 проявил высокую устойчивость с МИК 256 мкг/мл). Показана умеренная активность эффлюкс-насосов у B. cereus И8Л01 только в отношении цефурокси-ма и полное отсутствие эффлюкса при наличии в среде других антибиотиков (табл. 2).
У B. cereus ШЛ12 действие эффлюкса исследовали в отношении цефепима, цефтазидима и цефуроксима с МИК 1024 мкг/мл, а также цеф-триаксона и цефазолина с МИК 512 и 128 мкг/мл соответственно. Наличие умеренной активности эффлюкса обнаружено только в присутствии цеф-тазидима и цефуроксима (табл. 2).
Действие эффлюкса у B. cereus И8Л03 изучали в вариантах с цефазолином, цефуроксимом, цеф-тазидимом и цефепимом со значениями их МИК 128, 1024, 256 и 1024 мкг/мл соответственно
(табл. 2). Умеренная активность эффлюкс-насо-сов показана только в отношении цефепима и цефтазидима (табл. 2).
Определение активности в-лактамаз. Наряду с системой эффлюкса устойчивость бактерий к в-лактамным антибиотикам может обеспечиваться также наличием у них ферментов в-лактамаз, разрушающих эти антибиотики. Различают сериновые в-лактамазы молекулярных классов С, Л, Б и МБЛ класса В [12]. На рис. 1 показан результат типичного опыта по выявлению МБЛ, относящихся к классу В, по образованию зоны подавления роста бактериального газона B. cereus И8Л03 между диском, содержащим ЭДТА в центре чашки, и дисками, содержащими цефазо-лин и цефтазидим. Исследование наличия МБЛ у B. cereus ШЛ01 с помощью ЭДТА-теста показало наличие МБЛ-активности в отношении пеницил-
Таблица 1
МИК антибиотиков (мкг/мл) у штаммов бактерий рода Bacillus
Штамм Ампи циллин Пенициллин Цефазо-лин Цефурок-сим Цефтри-аксон Цефопе-разон Цефтази-дим Цефепим Спекти-номицин
Bacillus cereus HSA01 2048 2048 64 1024 128 128 512 512 256
Bacillus cereus HSA12 2048 2048 128 1024 512 128 1024 1024 128
Bacillus cereus HSA03 2048 2048 128 1024 256 128 256 1024 64
Bacillus subtilis HSA 06 256 256 2 4 2 2 4 2 16
Bacillus amyloliquefaciens HSA09 1024 1024 2 2 2 2 2 2 64
Таблица 2
Значения МИК антибиотиков, активность эффлюкс-насосов и наличие р-лактамаз у штаммов бактерий для пенициллина,
ампициллина и некоторых цефалоспоринов
Микроорганизм Антибиотик МИК мкг/мл МИК мкг/мл + СССР Кратность уменьшения Активность эффлюкса Металло-р-лак-тамазы (ЭДТА-тест) Лактамазы NDM, VIM (класс B), KPC (класс a), OXA-48 (класс D)
B. cereus HSA01 Ампициллин 2048 64 32 Высокая -
B. cereus HSA01 Пенициллин 2048 64 32 Высокая +
B. cereus HSA01 Цефепим 512 512 1 Отсутствует - Не обнаружено
B. cereus HSA01 Цефтазидим 512 512 1 Отсутствует +
B. cereus HSA01 Цефуроксим 1024 128 8 Умеренная н/о
B. cereus HSA01 Спектиномицин 256 256 1 Отсутствует н/о
B. cereus HSA12 Ампициллин 2048 2048 1 Отсутствует +
B. cereus HSA12 Пенициллин 2048 2048 1 Отсутствует -
B. cereus HSA12 Цефепим 1024 1024 1 Отсутствует -
B. cereus HSA12 Цефазолин 128 128 1 Отсутствует - Не обнаружено
B. cereus HSA12 Цефтазидим 1024 128 8 Умеренная +
B. cereus HSA12 Цефтриаксон 512 512 1 Отсутствует +
B. cereus HSA12 Цефуроксим 1024 128 8 Умеренная н/о
B. cereus HSA03 Ампициллин 2048 128 16 Умеренная +
B. cereus HSA03 Пенициллин 2048 128 16 Умеренная -
B. cereus HSA03 Цефепим 1024 128 8 Умеренная - Не обнаружено
B. cereus HSA03 Цефазолин 128 128 1 Отсутствует +
B. cereus HSA03 Цефтазидим 256 32 8 Умеренная +
B. cereus HSA03 Цефуроксим 1024 1024 1 Отсутствует н/о
B. subtilis HSA06 Ампициллин 256 256 1 Отсутствует + Не обнаружено
B. subtilis HSA06 Пенициллин 256 128 2 Отсутствует +
B. amyloliquefaciens HSA09 Ампициллин 1024 256 4 Умеренная + Не обнаружено
B. amyloliquefaciens HSA09 Пенициллин 1024 128 8 Умеренная -
Знак «н/о» означает, что МБЛ для этих антибиотиков не определяли.
лина и цефтазидима (табл. 2). У В. евгвш И8Л12 тест выявил МБЛ, гидролизующие ампициллин, а также цефалоспорины 111-го поколения цефтази-дим и цефтриаксон с МИК этих антибиотиков 2048, 1024 и 512 мкг/мл соответственно. У В. евгвш И8Л03 МБЛ-активность обнаружена в отношении ампициллина, цефазолина и цефтазидима (табл. 2). Штамм В. subtilis И8Л06 отличается очень низкими значениями МИК в отношении всех исследуемых антибиотиков-цефалоспоринов, но характеризуется достаточно высокой устойчивостью к ампициллину и пенициллину с МИК 256 мкг/мл (табл. 1). У этого штамма ЭДТА-тест показал наличие МБЛ, гидролизующих оба этих антибиотика, в то время как активность эффлюкса у этого штамма в присутствии ампициллина и пенициллина отсутствует (табл. 2). В. amyloliquвfaеiвns И8Л09, характеризующийся очень низкими значениями МИК в отношении исследуемых антибиотиков це-фалоспоринового ряда, но отличающийся высокой устойчивостью к ампициллину и пенициллину с МИК 1024 мкг/мл (табл. 1), показал умеренную активность эффлюкса в отношении этих двух антибиотиков, однако активность МБЛ обнаружена только к ампициллину (табл. 2).
© О
Контроль Опыт
Рисунок. Определение наличия металло-р-лакгамаз. Зона подавления роста B. cereus HSA03 возникла между дисками с ЭДТА, цефазолином и цефтазидимом. Цефепим (ЦПМ); Цефтриаксон (ЦРО); Цефазолин (ЦЗ); Цефтазидим (ЦАЗ).
Кроме методики выявления активности МБЛ (класс В) с помощью ЭДТА-теста, применялась также методика RT-PCR определения как серино-вых ß-лактамаз, так и МБЛ типов KPC (класс A), NDM, VIM (класс B) и OXA-48 (класс D). Однако в группе исследуемых бактерий ни один из перечисленных типов ß-лактамаз выявить не удалось (табл. 2).
Исследование микробного состава замкнутых помещений выявило преобладание в них бактерий родов Staphylococcus и Bacillus [5, 13-15]. Наличие бацилл связано с их способностью образовывать эндоспоры, что объясняет чрезвычайно высокую устойчивость к высушиванию, обработке дезра-створами, УФ-излучению и недостатку питатель-
ных веществ [16]. Многие виды бацилл, кроме B. anthracis, являются оппортунистическими и даже патогенными [2—4]. Бациллярные инфекции разделяют на три группы. Первая и вторая группы болезней вызываются в основном B. cereus, B. sphaericus и B. thuringiensis. Это поражения глаз и инфекции глубоких тканей. Третью группу заболеваний представляют инфекции, вызванные дис-семинированием клеток бацилл из очага поражения лимфогенным или гематогенным путями по всему организму. Возникают бактериемия, эндокардит, менингит и другие формы генерализованной бактериальной инфекции. Основным видом, вызывающим такие инфекции, является B. cereus. [3, 17, 18]. Следовательно, B. cereus является наиболее опасным для человека, за исключением B. anthracis, видом бацилл. При этом B. cereus формирует особую группу, включающую B. cereus, B. thuringiensis, B. weihenstephanensis, B. mycoides и B. anthracis [4, 18]. Показано, что некорректная антибиотикотерапия вызывает высокий уровень смертности у пациентов с бактериемией, вызванной B. cereus [3, 19]. Антимикробные препараты для эмпирической терапии должны выбираться в соответствии с чувствительностью к ним возбудителя. Однако еще мало данных о клинических характеристиках штаммов B. cereus, вызывающих инфекции системы кровообращения (bloodstream infections, BSI) и их эмпирической терапии. BSI-инфекции чаще всего связаны с такими факторами передачи, как аппараты искусственной вентиляции легких и венозные внутрисосудистые катетеры [17]. Таким образом, наш выбор в качестве объекта исследования поверхностей оборудования лаборатории для забора проб крови был оправданным.
Причиной появления в медицинской лаборатории бактерий, резистентных к антибиотикам, могут быть мутации, появившиеся в результате обработки оборудования различными дезинфек-тантами и УФ-лучами. Очень высока вероятность попадания в лабораторию устойчивых к противо-микробным препаратам бактерий также с потоком посетителей, особенно с низким иммунным статусом, подвергавшихся в течение долгих лет лечению антибиотиками в неконтролируемых дозах [3, 13]. Устойчивость к антибиотикам у попадающих в лабораторию с посетителями штаммов бацилл могла появиться и в результате переноса в них генов с помощью плазмид — в частности от стафилококков [13, 14, 20, 21]. Исследованные нами штаммы бактерий могли приобрести один из известных механизмов защиты от антибиотиков. Мы исследовали возможность функционирования у наших штаммов двух механизмов защиты — эффлюкс и в-лактамазная активность.
У бактерий гены, кодирующие эффлюкс-ные белки, находятся в хромосомах или плазми-дах, поэтому способны передаваться в результате
горизонтального переноса. А возникающие мутации приводят к повышенной экспрессии генов, кодирующих эффлюкс-насосы для выведения из клетки часто нескольких препаратов [22]. Различают семейства первичных и второстепенных насосов. Первичные транспортеры включают семейство ABC, которое действует за счет гидролиза АТФ, а в группу второстепенных эффлюкс-насо-сов входят семейства MFS, SMR, RND, MATE, функционирующие за счет мембранного электрохимического потенциала [21, 22]. У представителей рода Bacillus обнаружены насосы всех известных семейств [23]. Изучение структуры эффлюкс-насосов у бактерий группы B. cereus, три из которых — B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis являются патогенами людей, животных и насекомых, показало, что у штаммов этих видов функционирует, соответственно, по 93, 93 и 103 системы эффлюкса из всех известных семейств. Однако большинство идентифицированных систем оттока антибиотиков были классифицированы в пределах семейств MFS (более 50 насосов у каждого из трех штаммов) или ABC (до 35 транспортных систем) и всего от 3 до 5 эффлюкс-насосов каждого из семейств RND, MATE и SMR [22]. Характер влияния СССР на действие антибиотиков (табл. 2) и данные литературы позволяют считать, что транспортеры, обнаруженные у исследованных нами штаммов бацилл, вероятно, относятся к второстепенным транспортерам семейства MFS. Результаты, свидетельствующие о том, что функционирование эффлюкс-систем, регистрируемое в присутствии одного антибиотика не обнаруживается при действии других препаратов с аналогичным механизмом действия (табл. 2), можно объяснить тем, что у каждого штамма B. cereus могут функционировать одновременно десятки систем эффлюкса. У B. cereus ATCC 14579 в геноме обнаружено 28, 53, 4, 4, и 3 системы насосов, принадлежащих к семействам ABC, MFS, MATE, SMR, и RND соответственно. У исследуемых бактерий не определяли наличие первичных насосов семейства ABC [23]. Количеством, разнообразием и соотношением разных семейств эффлюкса у каждого штамма бацилл, функционирующих одновременно и с разной эффективностью в отношении разных по структуре антибиотиков, может быть обусловлено также наличие или отсутствие эффлюкса по отношению к определенному антибиотику у разных штаммов B. cereus. Кроме того, у каждого штамма, кроме эффлюкса, могут работать и другие механизмы защиты, действующие одновременно с оттоком.
Определение активности МБЛ с помощью ЭДТА-теста показало, что она выявлялась чаще всего в отношении ампициллина — у B. cereus HSA12, B. cereus HSA03, B. subtilis HSA06 и B. amy-loliquefaciens HSA09 и реже в присутствии пенициллина — у B. cereus HSA01 и B. subtilis HSA06
(табл. 2). ЭДТА-тест обнаружил действие МБЛ также в отношении цефтазидима у B. cereus HSA01, B. cereus HSA12, B. cereus HSA03, а при наличии цефтриаксона у B. cereus HSA12 и цефазо-лина - у B. cereus HSA03 (табл. 2). B. cereus, B. anthracis и B.licheniformis являлись одними из первых объектов биохимических исследований ß-лактамаз, на результатах которых были основаны будущие исследования ß-лактамаз и их классификация [12]. Были описаны четыре молекулярных класса ß-лактамаз (A, B, C и D) на основе размера молекулы и гомологии между аминокислотными последовательностями активного центра, и считалось, что ферменты класса D существуют только у грамотрицательных бактерий. Но недавно ферменты класса D были обнаружены у B. pumilus, В. subtilis и B. atrophaeus [24]. Общее количество всех уникальных лактамаз, принадлежащих к более чем 20 семействам и 4 классам, составляет около 2800 [12]. Идентификация ß-лактамаз до класса возможна на основе реакций с ингибитором лактамаз класса A клавулановой кислотой, ингибитором серин-лактамаз широкого спектра действия авибактамом и хелатором ионов металлов ЭДТА для идентификации МБЛ [12]. У штаммов бацилл, исследуемых с помощью ЭД-ТА-теста, показана активность МБЛ, относящихся к классу В (табл. 2). Однако методом RT-PCR обнаружить ß-лактамазы определенных семейств - NDM, VIM, (класс В), KPC (класс А) и OXA-48 (класс D) не удалось ни у одной из исследуемых бактерий (табл. 2). МБЛ сгруппированы в соответствии со сходством последовательностей и координацией цинка в три подкласса: B1, B2 и B3. Показано, что МБЛ BcII у B. cereus относится к подклассу B1, куда входят также ферменты семейств BcII, CcrA, IMP-1, BlaB, SPM-1, VIM-2 и NDM-1 [12, 25]. Следовательно, МБЛ этих семейств и семейства IMP, наличие которых мы еще не исследовали методом RT-PCR, необходимо в дальнейшем изучить у выделенных бацилл. С помощью ЭДТА-теста МБЛ (класс В) обнаружены у всех штаммов исследуемых бацилл (табл. 2). Однако отсутствие активности МБЛ у этих бацилл в присутствии некоторых антибиотиков (табл. 2), свидетельствует о необходимости применять наряду с ЭДТА-тестом другие методики обнаружения МБЛ, поскольку чувствительность этого метода может зависеть как от особенностей штамма бактерий, так и от свойств конкретного антибиотика, например, в присутствии цефепима ни у одного штамма бацилл действие МБЛ обнаружить не удалось. Следует отметить, что у бактерий рода Bacillus наряду с действием эффлюкса и ß-лактамазами, в отношении ß-лактамов может функционировать и такой механизм антибиотико-устойчивости, как модификация мишени [26, 27]. В вегетативных и спорулирующих клетках B. cereus было обнаружено 8 основных типов пе-
нициллинсвязывающих белков (ПСБ) бактериальных мембран. Изучено сродство этих ПСБ к ß-лактамам цефалоспоринового ряда цефалек-сину, цефокситину и цефотаксиму [26]. Следовательно, у бактерий рода Bacillus могут одновременно функционировать по крайней мере несколько механизмов защиты от антибиотиков — действие эффлюкса, ß-лактамаз и модификация мишени. Эти механизмы могут функционировать одновременно, но вклад каждого из них зависит как от штамма бактерий, так и конкретного антибиотика.
Таким образом, среди штаммов бактерий рода Bacillus, выделенных с поверхностей оборудования медицинской лаборатории для отбора анализов крови, преобладали известные способностью вызывать ряд заболеваний человека штаммы B. cereus. Все три представителя B. cereus показали высокую устойчивость к ампициллину и пенициллину со значением МИК 2048 мкг/мл и ряду ß-лактамных антибиотиков цефалоспоринового ряда I—IV-го поколений в диапазоне
64—1024 мкг/мл (табл. 1). В отличие от этого, штаммы В. subtilis И8Л06 и В. amyloliquвfaеiвns И8Л09 показали устойчивость только к традиционным антибиотикам ампициллину и пенициллину с МИК 1024 мкг/мл, в то время как значения МИК для цефазолина, цефуроксима, цефтриаксона, цефоперазона. цефтазидима и це-фепима составляли только 2—4 мкг/мл. У исследованной группы бацилл резистентность к пенициллину, ампициллину и ряду производных цефалоспорина обеспечивают, в зависимости от штамма и конкретного антибиотика, МБЛ и/или эффлюкс-насосы. Насосы относятся к группе второстепенных транспортеров.
Исследование осуществлялось в рамках научного проекта по выполнению государственного задания МГУ № 23-1-21 (регистрационный номер ЦИТИС 121032300094-7) без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nikaido H. Multidrug resistance in bacteria // Annu. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78. P. 119-146.
2. Farrar W.E., Reboli A.C. The genus Bacillus— Medical // The Prokaryotes. Handbook on the biology of bacteria, vol. 4. Bacteria: Firmicutes, Cyanobacte-ria / Eds. M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt. N.Y.: SpringerVerlag, 2006. P. 609-630.
3. Bianco A., Capozzi L., Monno M.R., Del Sam-bro L., Manzulli V., Pesole G., Loconsole D., Parisi A. Characterization of Bacillus cereus group isolates from human bacteremia by whole-genome sequencing // Front. Microbiol. 2021. Vol. 11: 599524.
4. Ehling-Schulz M., Koehler T.M., Lereclus D. The Bacillus cereus Group: Bacillus species with pathogenic potential // Gram-positive pathogens. 3rd Ed. / Eds. V.A. Fischetti, R.P. Novick, J.J. Ferretti, D.A. Portnoy, M. Braunstein, and J.I. Rood. Washington: ASM Press, 2019. P. 875-902.
5. Yenikeyev R.R., Tatarinova N.Y., Zakhar-chuk L.M. Mechanisms of resistance to clinically significant antibiotics of strains of bacteria of the genus Bacillus isolated from samples delivered from the International Space Station // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2020. Vol. 75. N 4. P. 224-230.
6. Janda J.M., Abbot S.L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls // J. Clin. Microbiol. 2007. Vol. 45. N 9. P. 2761-2764.
7. Hrabak J., Chudackova E., Walkova R. Matrixassisted laser desorption ionization time- of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for detection of antibiotic resistance mechanisms: from research to
routine diagnosis // Clin. Microbiol. Rev. 2013. Vol. 26. N 1. P. 103-114.
8. Ardebili A., Lari A.R., Talebi M. Correlation of ciprofloxacin resistance with the AdeABC efflux system in Acinetobacter baumannii clinical isolates // Ann. Lab. Med. 2014. Vol. 34. N 6. P. 433-438.
9. Aoki N., Ishii Y. , Tateda K., Saga T., Kimura S., Kikuchi Y., Kobayashi T., Tanabe Y., Tsukada H., Ge-jyo F., Yamaguchi K. Efficacy of calcium-EDTA as an inhibitor for metallo-ß-lactamase in a mouse model of Pseudomonas aeruginosa pneumonia // Antimicrob. Agents Chemother. 2010. Vol. 54. N 11. P. 4582-4588.
10. Лазарева А.В., Крыжановская О.А., Бочарова Ю.А., Чеботарь И.В., Маянский Н.А. Распространенность металл^-лактамаз и эффлюкс-ме-ханизмов у карбапенемрезистентных госпитальных штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных в г. Москве в 2012-2015 гг. // Вестн. РАМН. 2015. Т. 70. № 6. С. 679-683.
11. Li X.Z., Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria // Drugs. 2004. Vol. 64. N 2. P. 159-204.
12. Bush K. Past and present perspectives on ß-lactamases // Antimicrob. Agents Chemother. 2018. Vol. 62. N 10: e01076-18.
13. Timmery S., Hu X., Mahillon J. Characterization of bacilli isolated from the confined environments of the Antarctic Concordia station and the International Space Station // Astrobiology. 2011. Vol. 11. N 4. P. 323-334.
14. Coil D.A., Neches R.Y., Lang J.M., Brown W.E., Severance M., Cavalier D.D., Eisen J.A. Growth of 48 built environment bacterial isolates on
board the International Space Station (ISS) // Peer J. 2016. Vol. 4: e1842.
15. Moissl-Eichinger C., Cockell C., Rettberg P. Venturing into new realms? Microorganisms in space // FEMS Microbiol. Rev. 2016. Vol. 40. N 5. P. 722-737.
16. Horneck G., Moeller R., Cadet J., Douki T., Roc-co L., Mancinelli R.L., Wayne L, Nicholson W.L., Panitz C., Rabbow E, Rettberg P., Spry A., Stackebrandt E., Vaishampayan P., Venkateswaran K.J. Resistance of bacterial endospores to outer space for planetary protection purposes - Experiment PROTECT of the EXPOSE-E Mission // Astrobiology. 2012. Vol. 12. N 5. P. 445-456.
17. Uchino Y., Iriyama N., Matsumoto K., Hira-bayashi Y., Miura K., Kurita D., Kobayashi Y., Yagi M., Kodaira H., Hojo A., Kobayashi S., Hatta Y., Takeu-chi J. A case series of Bacillus cereus septicemia in patients with hematological disease // Intern. Med. 2012. Vol. 51. N 19. P. 2733-2738.
18. Schmid P.J., Maitz S., Kittinger C. Bacillus cereus in packaging material: Molecular and pheno-typical diversity revealed // Front. Microbiol. 2021. Vol. 12: 698974.
19. Dellinger R.P., Levy M.M., Rhodes A., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012 // Crit. Care Med. 2013. Vol. 41. N 2. P. 580-637.
20. Nolivos S., Cayron J., Dedieu A., Page A., Delolme F., Lesterlin C. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer // Science. 2019. Vol. 364. N 6442. P. 778-782.
21. Foster T.J. Antibiotic resistance in Staphylococ-cus aureus. Current status and future prospects // FEMS Microbiol. Rev. 2017. Vol. 41. N 3. P. 430-449.
22. Baranova N., Elkins C.A. Antimicrobial drug efflux pumps in other gram-positive bacteria // efflux-mediated antimicrobial resistance in bacteria. Mechanisms, regulation and clinical implications / Eds. X. Li, C.A. Elkins, and H.I. Zgurskaya. Springer Publ., 2016. P. 197-218.
23. Hassan K.A., Fagerlund A., Elbourne L.D.H., Voros A., Kroeger J.K., Simm R., Tourasse N.J., Fin-ke S., Henderson P.J.F., Okstad J.A., Paulsen I.T., Kols-to A. The putative drug efflux systems of the Bacillus cereus group // PLoS One. 2017. Vol. 12. N 5. P. 35.
24. Stewart N.K., Bhattacharya M., Toth M., Smith C.A., Vakulenko S.B. A surface loop modulates activity of the Bacillus class D в-lactamases // J. Struct. Biol. 2020. Vol. 211. N 2: 107544.
25. Karsisiotis A.I., Damblon C.F. Gordon C.K. Roberts G.C.K. Solution structures of the Bacillus cereus metallo-P-lactamase Bcll and its complex with the broad spectrum inhibitor R-thiomandelic acid // Biochem J. 2013. Vol. 456. N 3. P. 397-407.
26. Miyamoto T, Sukimoto K, Sayed A., Kim S., Honjoh K., Hatano S. Detection of penicillin-binding proteins in Bacillus cereus by using biotinylated в-lactams // J. Fac. Agric. Kyushu Univ. 2000. Vol. 44. N 3. P. 299-307.
27. van Duijkeren E., Schink A.K., Roberts M.C., Wang Y., Schwarz S. Mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents // Microbiol. Spectr. 2017. Vol. 6. N 2. DOI: https://doi.org/10.1128/micro-biolspec.ARBA-0019-2017.
Поступила в редакцию 21.12.2022 После доработки 16.04.2022 Принята в печать 13.05.2022
RESEARCH ARTICLE
Mechanisms of resistance to clinically significant antibiotics in strains of bacteria of the genus Bacillus isolated from samples obtained from a medical institution
R.R. Yenikeyev* , N.Y. Tatarinova , L.M. Zakharchuk , E.N. Yinogradova
Department of Microbiology, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1—12 Leninskie gory, Moscow, 119234, Russia *e-mail: radmir.yenikeyev@gmail.com
Isolates of bacterial strains dominating on the surfaces of medical laboratory equipment for the selection of blood tests were obtained. Pure cultures of these bacteria are identified as Bacillus cereus HSA01, Bacillus cereus HSA12, Bacillus cereus HSA03, Bacillus subtilis HSA06, Bacillus amyloliquefaciens HSA09. The resistance of bacteria to a number P-lactam antibiotics and spectinomycin was determined. All strains are resistant to penicillin and ampicillin with a minimum inhibitory concentration (MIC) from 256 to 2048 ^g/ml, as well as to cephalosporin antibiotics with a MIC value from 2 to 2048 ^g/ml. Bacterial resistance to spectinomycin used in patients with allergy to penicillins and cephalosporins is in the MIC range from 16 to 256 ^g/ml.
In B. cereus HSA01, resistance to ampicillin and cefuroxime is due to the operation of efflux pumps, to ceftazidime is provided by the action of metal-P-lactamases (MBL), and to penicillin is explained by the operation of both these systems. High resistance to ampicillin B. cereus HSA12 is provided by the action of MBL, to cefuroxime - by efflux activity, while resistance to ceftazidime is accompanied by the presence of MBL and the action of efflux pumps. In B. cereus HSA03, resistance to penicillin, ampicillin, cefepime, and ceftazidime is explained by efflux activity, to cefazolin and ceftazidime is provided by MBL, and to ampicillin and ceftazidime is due to the presence of both MBL and efflux. The resistance of B. subtilis HSA06 to penicillin and ampicillin is provided only by MBL activity. In B. amyloliquefaciens HSA09, resistance to ampicillin is explained by both the presence of MBL and efflux pumps, and to penicillin is provided only by the action of efflux.
Thus, in the studied group of bacilli, resistance to penicillin, ampicillin and a number of cephalosporin derivatives is provided, depending on the strain and the specific antibiotic, of metal-P-lactamase and/or efflux pumps. Pumps function due to the electrochemical potential of the cell membrane and belong to the group of secondary transporters.
Keywords: Bacteria of the genus Bacillus, antibiotic resistance, minimum inhibitory concentration, efflux pumps, fi-lactamase activity, aseptic rooms
Сведения об авторах
Еникеев Радмир Рустамович — аспирант кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42 23; e-mail: radmir.yenikeyev@gmail.com; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8467-9051
Татаринова Наталья Юрьевна — канд. биол. наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42 23; e-mail: nata.tatarinova53@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9883-5780
Захарчук Леонид Михайлович — докт. биол. наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42 23; e-mail: zakharchuk@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3783-3279
Виноградова Елизавета Николаевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42 23; e-mail: lizavin@yandex. ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4936-2593
