CC BY
41
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 579.65
Механизмы устойчивости к клинически значимым антибиотикам штаммов бактерий рода Bacillus, выделенных из образцов, доставленных с международной космической станции
P.P. Еникеев*©, Н.Ю. Татаринова ©, JI.M. Захарчук ©
Кафедра микробиологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12; *e-mail: radmir.yenikeyev@gmail.com
Российский сегмент Международной космической станции, как закрытая среда обитания, является благоприятной средой для развития микроорганизмов. Там встречаются бактерии и грибы разных систематических групп, некоторые из которых могут приводить к возникновению инфекций. Так, опасность представляют отдельные виды споро-образующих бактерий рода Bacillus. У семи штаммов бактерий этого рода, выделенных из проб, полученных на станции, определена устойчивость к таким ß-лактамным антибиотикам, как пенициллин, ампициллин, меропенем, ряду производных цефалоспорина I-го (цефазолин), II-го (цефуроксим), III-го (цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидим), IV-го (цефепим) поколений, а также аминоциклитольному антибиотику спектиномици-ну. Установлено, что все эти штаммы устойчивы к пенициллину и ампициллину со значением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) от 16 до 2048 мкг/мл, а также к антибиотикам цефалоспоринового ряда и меропенему со значением МИК от 2 до 2048 мкг/мл. Резистентность бактерий к спектиномицину, применяемому у пациентов с аллергией на ß-лактамы пенициллины и цефалоспорины, находится в диапазоне МИК от 32 до 2048 мкг/мл. Отсутствие активных эффлюкс-насосов у B. licheniformis 7-12 с высокими значениями МИК к пенициллину и ампициллину, позволило предположить наличие у этого штамма механизма ß-лактамазной защиты от этих антибиотиков. Еще у трех штаммов, устойчивых к пенициллину и ампициллину (B. subtilis 14-12, Bacillus sp. R2HG21, Bacillus sp. HEP3B2) функционирует другой механизм защиты — активный транспорт антибиотика из клетки, опосредованный наличием эффлюкс-насосов, функционирующих за счет электрохимического потенциала клеточной мембраны. Показано, что у шести штаммов исследованных бацилл резистентность к производным цефалоспо-рина III-IV-го поколений цефтриаксону, цефтазидиму, цефепиму и аминоциклитольно-му антибиотику спектиномицину также очевидно обеспечивается системами активного оттока ксенобиотиков, относящимися к группе второстепенных транспортеров.
Ключевые слова: Российский сегмент Международной космической станции, бактерии рода Bacillus, устойчивость к антибиотикам, минимальная ингибирующая концентрация, эффлюкс-насосы, замкнутая среда обитания
Российский сегмент Международной космической станции (РС МКС) представляет собой уникальную замкнутую среду обитания, которая отличается постоянной температурой (около 22°С), повышенной влажностью, более высокими, чем на Земле, уровнями космического излучения и углекислого газа, наличием доступных органических субстратов, микрогравитацией и постоянным проживанием людей. Совокупность этих условий является благоприятной средой для развития микроорганизмов [1]. Наряду с различными видами грибов на РС МКС встречаются и прокариоты различных систематических групп [2]. Грибы и бактерии, обитающие на борту МКС, могут нарушать работу систем жизнеобеспечения, представлять опасность для здоровья космонавтов
и вызывать коррозию оборудования, поэтому на пилотируемых космических аппаратах большое внимание уделяется постоянному мониторингу состава микробных сообществ [3]. Причиной микробной контаминации РС МКС является смена экипажей, осуществление доставки с Земли заменяемого оборудования и расходуемых материалов, а также использование систем, обеспечивающих регенерацию продуктов жизнедеятельности людей на орбите. Большинство микроорганизмов, обнаруженных на борту РС МКС, связаны с человеком, а микробиом РС МКС напоминает микробиом некоторых замкнутых помещений на Земле [4—5] и может содержать условно-патогенные микроорганизмы [2, 6, 7]. Некоторые виды бактерий могут приводить к воз-
никновению инфекций. Особенную опасность представляют спорообразующие бактерии, в частности — представители рода Bacillus, которые могут долгое время выживать в окружающей среде при низком содержании влаги и питательных веществ [8]. Постоянное наблюдение за микро-биомом на РС МКС позволяет оценить факторы риска для здоровья экипажа, целостности МКС и функционирования ее систем. Так, Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства США (НАСА) определило, что исследование микробиома Международной космической станции (МКС) является основной целью текущих и будущих исследований на орбите [1].
Целью настоящей работы было изучение устойчивости штаммов бактерий рода Bacillus, выделенных из проб, доставленных из РС МКС, к ряду клинически значимых антибиотиков и определение возможных механизмов этой устойчивости.
Материалы и методы
В работе использовали бактерии рода Bacillus — B. licheniformis 7-12, B. pumilus 8-12, B. subtilis 14-12, выделенные из образцов, доставленных из РС МКС в 2012—2014 гг. и идентифицированные до вида с применением молекулярных методов [3], а также бактерии, выделенные и идентифицированные нами в настоящей работе из образцов, доставленных из РС МКС в 2018 г. Для сравнительного изучения были использованы штаммы трех видов бактерий рода Bacillus из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ: B. licheniformis КМ-МГУ 14, B. pumilus КМ-МГУ 364 и B. subtilis КМ-МГУ 25.
Идентификацию бактерий, выделенных в 2018 г., осуществляли путем анализа генов 16S рРНК [9]. Выделение ДНК из клеток штаммов, выращенных на жидкой среде с мясо-пептонным бульоном (МПБ) с 1% глюкозы, проводили с помощью комплекта реактивов Genomic DNA Purification Kit KO 512 (Thermo Scientific, США) по методике, рекомендуемой разработчиками этого комплекта реактивов. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием праймеров (Синтол, Россия) B63f (5'-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3) и B1387r (5-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3'). Полученные фрагменты ДНК разделяли в агарозном геле с помощью электрофореза (120 В). Агарозный гель готовили, добавляя агарозу (1—1,2%) в 1x трис-ацетатный (ТАЕ) буфер, нагревали до 90-95°С, перемешивали до полного растворения агарозы, добавляли 7,5 мкл раствора бромистого этидия на каждые 150 мл раствора, охлаждали до 45—50°С и заливали в специальную форму. После полимеризации гель переносили в электрофорезную горизонтальную ка-
меру Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad, США). В образцы с фрагментами ДНК добавляли буфер в объеме 1:5. Электрофоретическое разделение проводили в буфере 1x ТАЕ. Фрагменты нуклеиновых кислот определяли в УФ-свете. Секвениро-вание ДНК проводили с помощью набора реактивов ABIPRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 (Thermo Scientific, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секве-наторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Thermo Scientific, США).
Определение значения минимальной ингиби-рующей концентрации антибиотиков (МИК) проводили методом их последовательных двукратных разведений с использованием 96-луночных планшетов (Eppendorf, Германия). Для этого выращивали суточную культуру бактерий в МПБ с 1% глюкозы до оптической плотности 1,0 (OD 600 нм), после чего культуру клеток разбавляли средой МПБ до оптической плотности 0,1 (OD 600 нм) и вносили в лунки. Затем в лунки вносили антибиотик таким образом, чтобы его концентрация в первой лунке составляла 4096 мкг/мл с последующим двукратным разведением до концентрации 2 мкг/мл. В работе использовали 9 ß-лактамных антибиотиков и аминоциклитоль-ный антибиотик спектиномицин. Рост бактерий оценивали, добавляя в лунки резазурин (Sigma, США) до концентрации 50 мкМ [10].
Для оценки активности эффлюкс-систем в 96-луночный планшет вносили питательную среду и соответствующий антибиотик в концентрации от 4096 до 2 мкг/мл, как описано выше, а затем в каждую лунку добавляли протонофор — карбонил-цианид-3-хлорфенилгидразон (carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone, CCCP, Sigma, США) в концентрации 2 мкг/мл. В качестве контролей использовали лунки с антибиотиком, но без добавления CCCP и лунки, содержащие только питательную среду с культурой и CCCP. Планшеты инкубировали в течение суток при 37° С. О влиянии CCCP на рост судили, добавляя резазу-рин в концентрации 50 мкМ [10]. Все опыты проводили в трехкратной повторности. Активность эффлюкса определяли по отношению кратности уменьшения (КУ) МИК антибиотиков в культурах без CCCP к значениям МИК при его добавлении. При величине КУ<4 регистрировали отсутствие эффлюкса, при КУ в диапазоне от 4 до 16 отмечали его умеренную активность, а при КУ>16 фиксировали высокую активность [11].
Результаты и обсуждение
Идентификация культур. В ходе настоящей работы были использованы штаммы бактерий рода Bacillus, выделенные ранее и идентифицированные до вида [3], а также новые штаммы споро-образующих бактерий, выделенных из проб, полу-
ченных из РС МКС и идентифицированных нами уже в ходе настоящей работы. Все четыре новых исследованных штамма на основании анализа последовательностей 16S рРНК были отнесены к роду Bacillus и обозначены как штаммы PWN2D, DLA64, LR2HG21 и HEP3B2. Так как последовательности гена 16S рРНК исследуемых штаммов оказались одновременно близки к нескольким видам рода Bacillus, то их не удалось однозначно отнести к конкретному виду.
Определение МИК. Изучена устойчивость штаммов бактерий рода Bacillus, полученных из РС МКС, к ряду клинически значимых антибиотиков, действующих на грамположительные бактерии. В качестве культур для сравнения исследовались некоторые штаммы бацилл, полученные из музея кафедры микробиологии МГУ. Проанализирована устойчивость исследуемых штаммов к таким ß-лактамным антибиотикам, как пенициллин, ампициллин, меропенем, производным цефалоспорина I-го (цефазолин), II-го (цефурок-сим), III-го (цефтриаксон, цефоперазон, цеф-тазидим) и IV-го (цефепим) поколений, а также аминоциклитольному антибиотику спек-тиномицину (табл. 1). Благодаря высокой эффективности действия, низкой токсичности и наличию разработанных технологий получения ß-лактамные антибиотики нашли наиболее широкое применение в современной медицине. Спектиномицин является единственным в ряду использованных нами антибиотиков, не относящийся к ß-лактамным. Его часто назначают в качестве резервного препарата для пациентов, которых нельзя лечить цефалоспоринами третьего и четвертого поколений.
Штамм B. licheniformis 7-12, выделенный из РС МКС, показал очень высокую устойчивость к пенициллину, ампициллину и цефтриаксону — 1024 мкг/мл (табл. 1). Высокая резистентность была обнаружена у этого штамма также ко всем другим изученным антибиотикам. Штамм B. licheniformis КМ-МГУ 14 из коллекции кафедры микробиологии МГУ показал наличие устойчиво-
сти только к пенициллину, ампициллину и спек-тиномицину с МИК 128, 256 и 256 мкг/мл соответственно.
Штамм B. pumilus 8-12 также показал очень высокую устойчивость ко всем исследуемым антибиотикам, причем особенно высокие значения были получены при использовании ампициллина и цефтазидима — МИК 2048 мкг/мл (табл. 1). Высокая резистентность показана также к цефопера-зону и цефепиму с МИК 1024 мкг/мл. Наиболее эффективными ингибиторами показали себя це-фуроксим и цефтриаксон с МИК 64 и 128 мкг/мл, являющиеся цефалоспоринами II-го и III-го поколения, и меропенем с МИК 16 мкг/мл (табл. 1). Штамм B. pumilus КМ-МГУ 364, подобно B. pumilus 8-12, показал высокую устойчивость в отношении цефтазидима и цефепима — 1024 и 512 мкг/мл соответственно, но, по сравнению со штаммом 8-12, устойчивость штамма КМ-МГУ 364 была ниже ко всем исследованным антибиотикам, особенно к пенициллину, ампициллину и цефоперазону (табл. 1). Штамм B. subtilis 14-12 показал значительную устойчивость только к четырем исследуемым антибиотикам — пенициллину, ампициллину, цефуроксиму и спектиномици-ну — со значениями МИК 2048, 2048, 16 и 32 мкг/мл соответственно (табл. 1). Устойчивость к антибиотикам цефалоспоринового ряда, причем практически всех поколений, у B. subtilis 14-12 была низкой. Штамм B. subtilis КМ-МГУ 25 показал сходную с B. subtilis 14-12 картину резистентности (табл. 1) за исключением более высокой устойчивости к спектиномицину, МИК которого составила 2048 мкг/мл.
Из четырех выделенных и идентифицированных в ходе данной работы штаммов бактерий рода Bacillus максимальные значения МИК для изученных антибиотиков показал штамм Bacillus sp. HEP3B2 (табл. 1). Штамм был устойчив ко всем исследуемым антибиотикам, причем не только к пенициллину и ампициллину, но и к цефало-споринам I-го и III-го поколений — цефазолину и цефтриаксону, а также меропенему с уровнем
Таблица 1
Минимальная ингибирующая концентрация антибиотиков (мкг/мл) у штаммов бактерий рода Bacillus
Штамм Пени- Ампи- Цефазо- Цефу- Цефтри- Цефопе- Цефта- Цефепим Меропе- Спектино-
циллин циллин лин роксим аксон разон зидим нем мицин
B. licheniformis 7-12 1024 1024 128 64 1024 512 128 128 16 512
B. licheniformis КМ-МГУ 14 128 256 4 16 2 2 4 2 4 256
B. pumilus 8-12 256 2048 256 64 128 1024 2048 1024 16 256
B. pumilus КМ-МГУ 364 16 64 32 8 64 32 1024 512 8 64
B. subtilis 14-12 2048 2048 2 16 2 4 4 2 2 32
B. subtilis КМ-МГУ 25 2048 2048 2 - 2 4 4 2 - 2048
Bacillus sp. HEP3B2 1024 512 1024 128 1024 16 128 128 1024 256
Bacillus sp. PWN2D 256 256 2 32 2 2 2 2 4 256
Bacillus sp. DLA64 256 256 2 32 2 2 2 2 4 256
Bacillus sp. LR2HG21 512 2048 2 1024 16 16 512 64 1024 512
Примечание:«—» — минимальную ингибирующую концентрацию для этих антибиотиков не определяли
МИК 1024 мкг/мл (табл. 1). Штаммы Bacillus sp. PWN2D и Bacillus sp. DLA64 показали одинаковые значения МИК ко всем исследуемым антибиотикам (табл. 1). Оба штамма были устойчивы к пенициллину, ампициллину и спектиномицину со значением МИК 256 мкг/мл. У штамма Bacillus sp. LR2HG21 максимальная резистентность обнаружена к ампициллину со значением МИК 2048 мкг/мл. Значение МИК для цефуроксима и меропенема составляло 1024 мкг/мл, а для пенициллина, спектиномицина и цефалоспоринового антибиотика цефтазидима — по 512 мкг/мл (табл. 1).
Следует отметить, что в данной работе определение МИК выполняли с использованием методов последовательных разведений в микропланшете, а большинство экспериментов по определению значения МИК в отношении бактерий рода Bacillus выполнены методом градиентной диффузии, поэтому прямое сравнение полученных результатов с литературными данными было бы некорректно, хотя в ряде работ была отмечена устойчивость штаммов рода Bacillus к пенициллину и некоторым другим антибиотикам [2].
Определение наличия эффлюкса. Основным параметром, определяющим эффективность антимикробных препаратов по отношению к штамму микроорганизма, является величина МИК антибиотика, которая может определяться, в том числе, и наличием у клеток активных насосов, откачивающих антибиотик из клетки и функционирующих за счет электрохимического потенциала мембраны [12]. Вклад системы эффлюкса в устойчивость исследуемых нами штаммов была оценена путем измерения значения МИК для
антибиотиков до и после воздействия ингибитора эффлюксного насоса CCCP. Было показано, что внесение CCCP в питательную среду без антибиотиков не приводило к подавлению роста культур. Добавление CCCP к засеянной в питательную среду культуре в присутствии антибиотика приводит к беспрепятственному накоплению этого антибиотика в клетке и, следовательно, к снижению МИК у бактерий, которые обладают активными откачивающими насосами.
Все изучаемые нами штаммы бактерий показали высокую устойчивость к действию пенициллина и ампициллина (табл. 1). Наличие эффлюкс-насо-сов, активных в отношении этих антибиотиков, исследовали у B. licheniformis 7-12, B. licheniformis КМ-МГУ 14, B. subtilis 14-12, Bacillus sp. R2HG21 и Bacillus sp. HEP3B2 (табл. 2). Установлено, что у B. licheniformis 7-12 и B. licheniformis КМ-МГУ 14 в присутствии пенициллина или ампициллина механизм эффлюкса отсутствует. Это свидетельствует о том, что у этих штаммов устойчивость к исследованным антибиотикам обусловлена, видимо, только активностью ß-лактамазы, разрушающей антибиотик. В то же время у штаммов B. subtilis 14-12, Bacillus sp. R2HG21 и Bacillus sp. HEP3B2 в присутствии пенициллина или ампициллина отмечена очень высокая активность эффлюкса (табл. 2).
Кроме пенициллина и ампициллина для изучения эффлюкса у B. licheniformis 7-12 были отобраны цефтазидим как цефалоспориновый антибиотик III-го поколения, к которому уровень устойчивости бактерий еще относительно низкий (значение МИК 128 мкг/мл), а механизм этой устойчивости видимо только начал формировать-
Таблица 2
Значения минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков и активность эффлюкс-насосов у штаммов бактерий рода Bacillus для пенициллина, ампициллина, некоторых цефалоспоринов и спектиномицина
Микроорганизм Антибиотик МИК антибиотика (мкг/мл) МИК в присутствии CCCP (мкг/мл) Кратность уменьшения МИК Активность эффлюкса
B. licheniformis 7-12 Пенициллин 1024 1024 1 Отсутствует
B. licheniformis 7-12 Ампициллин 1024 1024 1 Отсутствует
B. licheniformis КМ-МГУ 14 Пенициллин 128 128 1 Отсутствует
B. licheniformis КМ-МГУ 14 Ампициллин 256 256 1 Отсутствует
B. subtilis 14-12 Пенициллин 2048 16 128 Высокая
B. subtilis 14-12 Ампициллин 2048 16 128 Высокая
Bacillus sp. R2HG21 Пенициллин 2048 2 1024 Высокая
Bacillus sp. R2HG21 Ампициллин 2048 2 1024 Высокая
Bacillus sp. HEP3B2 Пенициллин 1024 2 512 Высокая
Bacillus sp. HEP3B2 Ампициллин 512 16 32 Высокая
B. licheniformis 7-12 Цефтазидим 128 16 8 Умеренная
B. licheniformis 7-12 Спектиномицин 512 32 16 Умеренная
B. pumilus 8-12 Цефтриаксон 128 6 8 Умеренная
B. pumilus 8-12 Цефепим 1024 64 16 Умеренная
Bacillus sp. LR2HG21 Цефепим 64 16 4 Умеренная
Bacillus sp. LR2HG21 Спектиномицин 512 32 16 Умеренная
Bacillus sp. HEP3B2 Цефепим 128 2 64 Высокая
Bacillus sp. HEP3B2 Спектиномицин 256 2 128 Высокая
Bacillus sp. PWN2D Спектиномицин 256 8 32 Высокая
Bacillus sp. DLA64 Спектиномицин 256 2 128 Высокая
ся, и спектиномицин как антибиотик, заведомо не подверженный действию в-лактамазы и к которому B. licheniformis 7-12 проявил высокую устойчивость с МИК 512 мкг/мл. В присутствии цефтази-дима или спектомицина у B. licheniformis 7-12 проявлялась умеренная активность эффлюкса.
Для определения наличия эффлюкс-насосов у B. pumilus 8-12 были отобраны цефалоспорины III-го и IV-го поколений цефтриаксон и цефепим со значениями МИК 128 и 1024 мкг/мл соответственно (табл. 2). Значения МИК этих антибиотиков в присутствии CCCP указывают на умеренную активность эффлюкс-насосов (табл. 2).
Наличие эффлюкс-насосов у штаммов Bacillus sp. LR2HG21 и Bacillus sp. HEP3B2 изучали с применением цефепима и спектиномицина, а у штаммов PWN2D и DLA64 только с использованием спектиномицина. Цефепим был взят как цефало-спорин IV-го поколения, представляющий наибольший интерес ввиду его новизны, а спектино-мицин использовался как антибиотик, заведомо не разрушающийся в-лактамазой. У Bacillus sp. LR2HG21 выявлена умеренная, а у Bacillus sp. HEP3B2 высокая активность эффлюкс-насосов в отношении как цефепима, так и спектиномици-на (табл. 2). У двух штаммов бацилл — PWN2D и DLA64 — была обнаружена высокая активность эффлюксных насосов в отношении спектиноми-цина (табл. 2).
В результате многолетнего изучения микро-биома МКС было установлено, что среди бактерий доминировали по частоте обнаружения виды рода Staphylococcus, а на втором месте были бактерии рода Bacillus [3, 13]. И если преобладание стафилококков можно объяснить их связью с человеком [4, 5], то высокая встречаемость представителей рода Bacillus связана с их чрезвычайно высокой устойчивостью к высушиванию и недостатку питательных веществ [14]. Бактерии рода Bacillus встречаются повсеместно, число их видов уже превышает 200. Однако на МКС видовое разнообразие изученных бацилл составляет не более двух десятков видов, и доминируют B. licheniformis, B. pumilus, B. subtilis. [2, 3, 13]. Исторически B. anthracis был признан единственным патогенным видом рода, однако некоторые штаммы B. cereus, B. megaterium, B. thuringiensis, B. licheniformis, B. pumilus, B. subtilis и B. alvei были описаны как оппортунистические и даже патогенные [8].
Штаммы B. licheniformis 7-12 и B. pumilus 8-12 продемонстрировали намного более высокую устойчивость к пенициллину и ампициллину, чем штаммы B. licheniformis КМ-МГУ 14 и B. pumilus КМ-МГУ 364, взятые для сравнительного анализа из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Многие штаммы бацилл, выделенных с РС МКС, проявили высокую устойчивость к цефалоспори-нам I-IV поколений и меропенему (табл. 1). В то же время все штаммы, взятые из коллекции
МГУ - B. licheniformis КМ-МГУ 14, B. pumilus КМ-МГУ 364, B. subtilis КМ-МГУ 25, а также некоторые «космические» штаммы бацилл — Bacillus sp. PWN2D и Bacillus sp. DLA64 — показали очень низкую устойчивость к цефалоспоринам поколений I-IV и меропенему (табл. 1). И если низкую устойчивость коллекционных культур можно объяснить их многолетним хранением в коллекции, в результате чего устойчивость к антибиотикам у них не успела сформироваться, то причины и механизмы резистентности к антибиотикам у «космических» штаммов могут быть различными.
Первой предполагаемой причиной появления в космосе штаммов бацилл, устойчивых к ряду антибиотиков, могут быть, прежде всего, мутации, вызванные предполетной стерилизацией оборудования и приборов с помощью УФ-облучения, перекиси водорода или других дезинфектантов, а также мутации, обусловленные воздействием специфических условий космоса — космическим излучением и микрогравитацией. Не исключено попадание на МКС устойчивых штаммов бацилл и с космонавтами, поскольку эти бактерии являются частью микробиоты человеческой кожи и кишечника [15]. В любом случае клинически значимая устойчивость к противомикробным препаратам появившихся на МКС штаммов может распространяться путем горизонтального переноса генов — например, с помощью плазмид [13, 16]. Так, у большинства из 40 штаммов бацилл, выделенных из проб исследовательской станции в Антарктике и МКС, обнаружили одну или две плазмиды, некоторые из которых были связаны с репликонами элементов вирулентности B. anthracis pXO1 и pXO2. Кроме того, было установлено, что шесть из 25 протестированных штаммов приобрели чужеродную ДНК путем конъюгации [13, 16]. Как уже говорилось, доминирующим родом бактерий на МКС является Staphylococcus. Известно также, что стафилококки оказались первыми микроорганизмами, среди которых широкое распространение получила устойчивость к ß-лактамным антибиотикам, что привело к существенному снижению эффективности традиционной терапии [17]. Вероятно, исследуемые нами бациллы могли приобрести ß-лактамазную устойчивость от стафилококков, что привело к повышению их устойчивости к антибиотикам.
И наконец, исследованные нами штаммы бацилл могли приобрести один из механизмов защиты от антибиотиков, среди которых — модификация мишени действия антибиотика, его инактивация, активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс), нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки. Все эти механизмы способны функционировать как по отдельности, так и в комплексе. Мы исследовали возможность функционирования у наших штаммов эффлюкса. Этот механизм возник в ходе
эволюции для защиты от веществ, ингибирующих метаболизм микроорганизма.
Полученные данные указывают на отсутствие у B. licheniformis 7-12 и B. licheniformis КМ-МГУ 14, показывающих высокие значения МИК к пенициллину и ампициллину, активных эффлюкс-систем (табл. 2). Высокая устойчивость к данным антибиотикам у этих штаммов, по-видимому, связана с инактивацией их ß-лактамазами. В то же время у выделенных из проб МКС штаммов B. subtilis 14-12, Bacillus sp. R2HG21 и Bacillus sp. HEP3B2 в присутствии пенициллина или ампициллина отмечена очень высокая активность эффлюкса. Следовательно, механизм устойчивость к пенициллину или ампициллину у разных штаммов бацилл может различаться.
В присутствии цефтазидима, цефтриаксона, цефепима и спектиномицина у B. licheniformis 7-12, B. pumilus 8-12 и Bacillus sp. LR2HG21 обнаружена умеренная активность эффлюкс-насосов (табл. 2), что позволяет предположить присутствие у этих штаммов дополнительных к эффлюкс-системам механизмов устойчивости — например, ß-лактамазной активности. Установленная нами высокая активность эффлюксных насосов у штамма HEP3B2 по отношению к цефе-пиму и спектиномицину, а у штаммов PWN2D и DLA64 — к спектиномицину позволяет считать, что у этих штаммов основным механизмом устойчивости к исследованным антибиотикам является эффлюкс (табл. 2).
Эффлюкс-насосы встречаются практически у всех видов бактерий, гены, кодирующие этот класс белков, могут быть расположены на хромосомах или плазмидах и передаваться путем горизонтального переноса [18, 19]. Эффлюксные насосы можно разделить на две группы: первичные и второстепенные транспортеры. Семейство транспортеров ABC относится к первой группе. Для функционирования эти транспортеры используют энергию гидролиза АТФ. Второстепенные транспортеры включают семейства MFS, SMR, RND, MATE и функционируют за счет электрохимического потенциала мембраны
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mora M., Mahnert A., Koskinen K., Pausan M.R., Oberauner-Wappis L., Krause R., Perras A.K., Gorkiewicz G., Berg G., Moissl-Eichinger C. Microorganisms in confined habitats: microbial monitoring and control of intensive care units, operating rooms, cleanrooms and the International Space Station // Front Microbiol. 2016. Vol. 7: 1573.
2. Mora M., Perras A., Alekhova T., Wink L., Krause R., Aleksandrova A., Novozhilova T., Moissl-Eichinger C. Resilient microorganisms in dust samples of the International Space Station-survival of the adaptation specialists // Microbiome. 2016. Vol. 4. N 1. P. 65-85.
3. Alekhova T.A.,Zakharchuk L.M., Tatarinova N.Y., Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Ravin N.V. Skryabin K.G.
[17, 20]. Одним их самых распространенных способов подавления эффлюкс-насосов, относящихся к второстепенным транспортерам, является применение CCCP. Этот разобщитель процесса окислительного фосфорилирования нарушает протонный градиент мембран, необходимый для активности эффлюкс-насосов [12, 21, 22].
Активность эффлюкс-насосов может меняться за счет возникновения различных мутаций, которые в некоторых случаях приводят к повышению эффективности выброса антибиотика из клетки [22]. Для грамположительных бактерий клинически значимыми эффлюксными насосами, определяющими устойчивость к широкому спектру антибиотиков, являются транспортеры, входящие в семейство MFS [18]. Лучше всего структура эффлюкс-насосов среди грамположительных бактерий изучена у B. subtilis. У них обнаружены транспортеры, относящиеся к семействам MFS и SMR [18, 21, 23, 24]. Основываясь на данных литературы и действию CCCP в отношении исследуемых штаммов (табл. 2), можно полагать, что обнаруженные нами системы активного оттока антибиотиков у штаммов бацилл относятся к группе второстепенных транспортеров семейств MFS или SMR, описанных для рода Bacillus [12, 18, 21, 23, 24].
До сих пор не сообщалось о серьезных инфекциях или вспышках болезней на МКС [25]. Однако обнаруженные штаммы бактерий, обладающие высокой устойчивостью в отношении некоторых антибиотиков, требуют дальнейшего скрининга микробиоты МКС для своевременного предупреждения возможных потенциальных рисков, которые могут представлять некоторые из этих микроорганизмов для здоровья людей с ослабленным иммунитетом - например, космонавтов -в результате их работы в экстремальных условиях длительного космического полета.
Работа финансировалась за счет собственных средств авторов. Исследования выполнены без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station // Dokl. Biochem. Biophys. 2015. Vol. 465. N 1. P. 104-107.
4. Coil D.A., Neches R.Y., Lang J.M., Brown W.E., Severance M., Cavalier D.D., Eisen J.A. Growth of 48 built environment bacterial isolates on board the International Space Station (ISS) // Peer J. 2016. Vol. 4: e1842.
5. Moissl-Eichinger C., Cockell C., Rettberg P. Venturing into new realms? Microorganisms in space // FEMS Microbiol. Rev. 2016. Vol. 40. N 5. P. 722-737.
6. Checinska A., Probst A.J., Vaishampayan P., White J.R., Kumar D., Stepanov V.G., Fox G.E., Nilsson H.R., Pierson D.L., Perry J., Venkateswaran K
Microbiomes of the dust particles collected from the International Space Station and Spacecraft Assembly Facilities // Microbiome. 2015. Vol. 3. N 1. P. 50-68.
7. Vaishampayan K.P., Cisneros J., Pierson D.L., Rogers S.O., Perry J. International Space Station environmental microbiome-microbial inventories of ISS filter debris // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. Vol. 98. N 14. P. 6453-6466.
8. Farrar W.E., Reboli A.C. The genus Bacillus— Medical // The Prokaryotes. Handbook on the biology of bacteria, vol. 4. Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria / Eds. M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt. N.Y.: Springer-Verlag, 2006. P. 609-630.
9. Janda J.M., Abbot S.L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls // J. Clin. Microbiol. 2007. Vol. 45. N 9. P. 2761-2764.
10. Elshikh M., Ahmed S, Funston S., Dunlop P., McGaw M., Marchant R., Banat I.M. Resazurin-based 96-well plate microdilution method for the determination of minimum inhibitory concentration of biosurfactants // Biotechnol. Lett. 2016. Vol. 38. N 6. P. 1015-1019.
11. Ardebili A., Lari A.R., Talebi M. Correlation of ciprofloxacin resistance with the AdeABC efflux system in Acinetobacter baumannii clinical isolates // Ann. Lab. Med. 2014. Vol. 34. N 6. P. 433-438.
12. Li X.Z., Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria // Drugs. 2004. Vol. 64. N 2. P. 159-204.
13. Timmery S, Hu X., Mahillon J. Characterization of Bacilli isolated from the confined environments of the Antarctic Concordia station and the International Space Station // Astrobiology. 2011. Vol. 11. N 4. P. 323-334.
14. Horneck G., Moeller R., Cadet J., Douki T., Rocco L., Mancinelli R.L., Wayne L., Nicholson W.L., Panitz C., Rabbow E., Rettberg P., Spry A., Stackebrandt E., Vaishampayan P., Venkateswaran K.J. Resistance of bacterial endospores to outer space for planetary protection purposes - Experiment PROTECT of the EXPOSE-E Mission // Astrobiology. 2012. Vol. 12. N 5. P. 445-456.
15. Gaci N., Borrel G, Tottey W., O'Toole P.W., Brugere J-F. Archaea and the human gut: new beginning of an old story // World J. Gastroenterol. 2014. Vol. 20. N 43. P. 16062-16078.
16. Nolivos S., Cayron J., Dedieu A., Page A., Delolme F., Lesterlin C. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer // Science. 2019. Vol. 364. N 6442. P. 778-782.
17. Foster T.J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects // FEMS Microbiol. Rev. 2017. Vol. 41. N 3. P. 430-449.
18. Piddock L.J.V. Multidrug-resistance efflux pumps? Not just for resistance // Nat. Rev. Microbiol. 2006. Vol. 4. N 8. P. 629-636.
19. Poole K. Efflux pumps as antimicrobial resistance mechanisms // Ann. Med. 2007. Vol. 39. N 3. P. 162-176.
20. Blair J.M.A., Richmond G.E., Piddock L.J.V. Multidrug efflux pumps in gram-negative bacteria and their role in antibiotic resistance // Future Microbiol. 2014. Vol. 9. N 10. P. 1165-1177.
21. Peleg A.Y., Adams J., Paterson D.L. Tigecycline efflux as a mechanism for nonsusceptibility in Acinetobacter baumannii // Antimicrob. Agents Chemother. 2007. Vol. 51. N 6. P. 2065-2069.
22. Baranova N., Elkins C.A. Antimicrobial drug efflux pumps in other gram-positive bacteria // Efflux-mediated antimicrobial resistance in bacteria. Mechanisms, regulation and clinical implications / Eds. X. Li, C.A. Elkins, and H.I. Zgurskaya. Cham: Springer, 2018. P. 197-218.
23. Masaoka Y., Ueno Y., Morita Y., Kuroda T., Mizushima T., Tsuchiya T. A two-component multidrug efflux pump, EbrAB, in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. N 8. P. 2307-2310.
24. ZhangZ.C., Pornillos M.O., ChangX.G., Saier M.H. Functional characterization of the heterooligomeric EbrAB multidrug efflux transporter of Bacillus subtilis // Biochemistry. 2007. Vol. 46. N 17. P. 5218-5225.
25. Van Houdt R., Mijnendonckx K., Leys N. Microbial contamination monitoring and control during human space missions // Planet Space Sci. 2012. Vol. 60. N 1. P. 115-120.
Поступила в редакцию 08.09.2020 г. После доработки 10.10.2020 г. Принята в печать 15.10.2020 г.
RESEARCH ARTICLE
Mechanisms of resistance to clinically significant antibiotics of strains of bacteria of the genus Bacillus isolated from samples delivered from the International Space Station
R.R. Yenikeyev ©, N.Y. Tatarinova ©, L.M. Zakharchuk ©
Department of Microbiology, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: radmir.yenikeyev@gmail.com
The Russian segment of the International Space Station, as a closed habitat, is a favorable environment for the development of microorganisms. There are bacteria and fungi of various systematic groups, some of which can lead to infections. Thus, certain species of spore-forming bacteria of the genus Bacillus are dangerous In seven strains of bacteria of this genus,
isolated from samples obtained at the station, resistence to such P-lactam antibiotics as penicillin, ampicillin, meropenem, a number of cephalosporin derivatives I (cefazolin), II (cefuroxime), III (ceftriaxone, cefoperazone, ceftazidime), IV (cefepime) generations, as well as the aminocyclitol antibiotic spectinomycin. It was found that all these strains are resistant to penicillin and ampicillin with a minimum inhibitory concentration (MIC) from 16 to 2048 M-g/ml, as well as to cephalosporin antibiotics and meropenem with a MIC value from 2 to 2048 Mg/ml. Bacterial resistance to spectinomycin used in patients with allergy to P-lactams penicillins and cephalosporins is in the MIC range from 32 to 2048 Mg/ml. The absence of active efflux pumps in B. licheniformis 7-12 with high MIC values for penicillin and ampicillin suggested that this strain has a P-lactamase defense mechanism against these antibiotics. In three more strains resistant to penicillin and ampicillin — B. subtilis 14-12, Bacillus sp. R2HG21, Bacillus sp. HEP3B2 functions another defense mechanism — active transport of the antibiotic from the cell, mediated by the presence of efflux pumps, functioning due to the electrochemical potential of the cell membrane. It has been shown that, in six strains of the studied bacilli, resistance to cephalosporin derivatives of the 3rd-4th generations of ceftriaxone, ceftazidime, cefepime and the aminocyclitol antibiotic spectinomycin is also apparently provided by systems of active outflow of xenobiotics belonging to the group of secondary transporters.
Keywords: Russian Segment of the International Space Station (ISS RS), bacteria of the genus Bacillus, antibiotic resistance, minimum inhibitory concentration, efflux pumps, closed habitat
Сведения об авторах
Еникеев Радмир Рустамович — аспирант кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42 23; e-mail: radmir.yenikeyev@gmail.com; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-8467-9051
Татаринова Наталья Юрьевна — канд. биол. наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42 23; e-mail: nata.tatarinova53@mail.ru; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9883-5780
Захарчук Леонид Михайлович — докт. биол. наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42 23; e-mail: zakharchuk@mail.ru; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-3783-3279
