CC BY
144
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
1
УДК 579.262
03.00.00 Биологические науки
РОСТОСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BACILLUS ФИЛЛОПЛАНА ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ Г. СТАВРОПОЛЯ
Коптева Т атьяна Сергеевна
Ерина Надежда Викторовна
Заикина Ирина Аркадьевна
ФГАОУ ВПО Северо-Кавказский федеральный
университет, Россия
В статье представлены результаты изучения ростостимулирующей активности микроорганизмов рода Bacillus филлоплана древесных растений г. Ставрополя. Выделены и идентифицированы штаммы эпифитных микроорганизмов рода Bacillus с листовой пластинки растений: Quercus robur L., Carpinus caucasica Grossh., Fraxinus excelsior L., Acer campestre L.. Изучены ростостимулирующие свойства 43 штаммов аэробных спорообразующих бактерий: Bacillus subtilis, Bac. megaterium, Bac. pumilis, Bac. cereus, Bac. licheniformis. Отобранные штаммы являются потенциально перспективными в разработке микробиологических препаратов для растений. Создана региональная коллекция штаммов эпифитных микроорганизмов
Ключевые слова: ЭПИФИТНЫЕ БАКТЕРИИ, АЭРОБНЫЕ СПОРООБРАЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ, ФИЛЛОПЛАН, РОД BACILLUS, БАКТЕРИИ, СТИМУЛИРУЮЩИЕ РОСТ РАСТЕНИЙ, ПОВЕРХНОСТЬ ЛИСТОВОЙ ПЛАСТИНКИ
UDC 579.262 Biological sciences
GROWTH PROMOTING ACTIVITY OF SOME MEMBERS OF THE GENUS BACILLUS OF LEAF SURFACE MICROFLORA ARBOREAL PLANTS IN STAVROPOL
Kopteva T atiana Sergeevna
Erina Nadezhda Viktorovna
Zaikina Irina Arcadievna
Northern Caucasus Federal University, Russia
The article presents the results of studying the growth-stimulating activity of the microorganisms of the genus Bacillus of leaf surface microflora arboreal plants in Stavropol. Isolated and identified strains of epiphytic microorganisms of the genus Bacillus with the leaf surface of plants: Quercus robur L., Carpinus caucasica Grossh., Fraxinus excelsior L., Acer campestre L.. Growth stimulating properties of 43 strains of aerobic spore-forming bacteria (Bacillus subtilis, Bac. megaterium, Bac. pumilis, Bac. cereus, Bac. Licheniformis) are researched. Selected strains are potentially promising in the development of microbial preparations for plants. A regional collection of strains of epiphytic organisms was formed
Keywords: EPIPHYTIC BACTERIA, AEROBIC SPORE-FORMING BACTERIA, LEAF SURFACE MICROFLORA, GENUS BACILLUS, РLANT GROWTH PROMOTION BACTERIA, LEAF SURFACE
Plant growth promotion bacteria (PGPB) - ризосферные, эпифитные и эндофитные бактерии, благоприятно воздействующие на рост и развитие своих хозяев. Они используют сходные механизмы стимуляции роста растения-хозяина. PGPB влияют на развитие растений прямо или косвенно. Влияние, связанное с продукцией метаболитов, таких как антибиотики, токсины, гидролитические ферменты, сидерофоры, которые снижают развитие фитопатогенов, называют косвенным. Прямой эффект наблюдается в улучшении минерального питания растения, синтезе
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
2
гормонов роста и витаминов ассоциативными бактериями. Синтезируя все важнейшие фитогормоны - ауксины (индолил-3-уксусная кислота), гибберелины, цитокинины, этилен, микроорганизмы оказывают
положительное влияние на рост растения [3, 9, 10].
Некоторые микросимбионты являются представителями сразу нескольких экологических групп. К числу таких микроорганизмов относят представителей рода Bacillus в связи с тем, что эти бактерии являются доминирующими видами в ризосфере, во внутренних частях растений и по данным ряда исследователей, типичными обитателями эпифитной микрофлоры [1, 2, 4, 10]. Наиболее изученными являются ризосферные микроорганизмы. Представители рода Bacillus отличаются от других бактерий высокой выживаемостью во внешней среде и толерантностью к антропогенным воздействиям.
Этому способствует разнообразная биологическая активность бацилл, выраженная в продуцировании фитогормонов, антибиотиков, ферментов, токсинов и других метаболитов. Способность к
спорообразованию, высокая приспособляемость к условиям внешней среды, в том числе и абиотическим, обуславливают
конкурентоспособность бацилл в ризо- и филлосфере и в тканях растения-хозяина.
Эпифитные бациллы способны синтезировать индолил-3-уксусную кислоту, с синтезом которой связано накопление в растении триптофана-предшественника ИУК [9].
Обладая высокой физиологической активностью, они составляют значительную часть микрофлоры «здорового» растения, участвуют в стимуляции роста своих хозяев, улучшают их водное и минеральное снабжение, а также способствуют появлению у растительных партнеров устойчивости к фитопатогенам [3]. Перечисленные положительные
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
3
свойства штаммов рода Bacillus позволяют рассматривать их в качестве перспективных объектов при разработке микробиологических препаратов.
Поэтому выделение и идентификация эпифитных аэробных спорообразующих бактерий филлосферы древесных растений г. Ставрополя для тестирования на ростостимулирующие свойства представляется актуальным.
Цель исследования: выделение, идентификация и поиск
перспективных штаммов эпифитных микроорганизмов в условиях города Ставрополя.
Задачи исследования:
- выделить штаммы эпифитных микроорганизмов рода Bacillus с листовой пластинки исследуемых растений методом отпечатка;
- идентифицировать штаммы аэробных спорообразующих бактерий, выделенных с филлоплана некоторых древесных растений г. Ставрополя;
- изучить ростостимулирующие свойства некоторых штаммов эпифитных микроорганизмов.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования послужили микроорганизмы, выделенные с листовых пластинок древесных растений: Quercus robur L. (Дуб
черешчатый), Carpinus caucasica Grossh. (Граб кавказский), Fraxinus excelsior L. (Ясень обыкновенный), Acer campestre L. (Клен полевой).
Выделение эпифитов производили методом отпечатка с поверхности филлоплана. Культивирование бациллярной флоры проводили при t=28±2°Q 35±2°С, 42±2°С, в течение 24-48 часов в аэробных условиях на питательных средах: МПА, Питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры (Патент № 2366701, Заикина И. А., Мануйлов И. М.).
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
4
При описании и идентификации бактерий изучали следующие параметры: культуральные и тинкториальные свойства, морфологические характеристики, физиолого-биохимические свойства.
Идентификация микроорганизмов проводилась в ФГБУ «Ставропольская межобластная ветеринарная лаборатория» классическими и инструментальными методами (Экспертиза № 8218-8277 от 28.05.2012), а также руководствуясь методическими рекомендациями [5, 6, 7, 8].
Применяли стерилизацию семян 96%-м этанолом в течении 5 мин. После стерилизации семена отмывали от 3 до 5 раз стерильной дистиллированной водой [5].
В качестве модельного объекта исследования фитостимулирующей активности представителей рода Bacillus были использованы семена пшеницы Triticum aestivum L. Бактеризацию проводили с помощью суспензии бактерий в концентрации 106 кл/мл. Зерна раскладывали в чашки Петри (20 зерен в каждую чашку) на слой фильтровальной бумаги, смоченной 10 мл культуральной жидкости и оставляли в термостате на 3 суток при 28 еС.
О наличии или отсутствии фитостимулирующей способности штаммов бацилл судили при сравнении длины надземной части и длины корней проростков, обработанных соответствующим разведением в опытном и контрольном вариантах.
Экспериментальная часть
C поверхностей листовых пластинок древесных растений были выделены эпифиты, идентифицированные как аэробные спорообразующие бактерии, принадлежащие к 5 видам: Bacillus subtilis, Bac. megaterium, Bac. pumilis, Bac. cereus, Bac. licheniformis.
Всего было протестировано 43 штамма эпифитов, из них - 19 штаммов - Bacillus subtilis, 14 штаммов - Bacillus pumilis, 6 штаммов -Bacillus licheniformis и по 2 штамма - Bacillus megaterium и Bacillus cereus.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
5
Данные по опыту представлены в таблице 1.
Таблица 1
Ростостимулирующая активность эпифитных представителей рода Bacillus в отношении семян пшеницы (на 3 сутки)
№ штамма средняя длина надземной части, мм Xср± mx средняя длина подземной части, мм Xср± mx
Bacillus subtilis
1 21,6± 1,07 28,5±3,14
13 33,8±2,58 40,8±0,50
20 24,0±1,47 29,6±4,63
21 24,3±3,65 26,1±1,0
34 21,3±2,22 27,9±4,25
40 27,4±2,93 36,7±4,55
41 22,0±1,84 26,8±4,11
46 23,1±4,14 26,3±1,21
49 19,5±3,74 26,6±2,62
50 29,6±4,37 34,0±5,86
52 11,1±0,90 2,5±4,62
55 27,4±3,68 28,8±4,82
58 23,5±3,56 32,9±5,42
59 19,4±5,20 21,1±3,23
60 36,7±3,82 31,2±4,39
63 22,5±3,30 14,2±3,12
66 21,2±5,08 12,6±2,64
73 41,8±3,82 31,9±3,05
79 27,7±5,28 26,9±4,51
Bacillus pumilis
10 35,4±3,67 23,6±4,12
14 17,2±5,41 10,3±3,23
43 40,1±4,41 26,1±5,16
44 39,8±3,43 27,3±4,34
48 26,9±2,36 23,0±4,52
51 9,9±4,98 5,0±3,47
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
6
53 19,3±2,79 13,4±3,88
56 21,8±1,86 18,3±5,06
57 25,2±1,84 23,6±4,35
68 22,1±3,06 21,0±4,60
69 22,3±4,56 17,0±4,58
70-1 41,1±4,27 28,6±3,66
74 22,1±1,68 19,1±3,34
75 19,2±3,95 13,8±4,81
Bacillus licheniformis
8 28,1±3,19 23,9±4,75
22 47,6±5,14 45,1±3,08
31 36,7±4,45 25,4±3,94
47 15,7±4,98 10,8±3,86
62 41,4±2,92 34,2±4,29
67 38,9±4,23 33,8±3,62
Bacillus megaterium
3 39,7±3,48 35,7±2,55
32 10,3±3,23 6,3±4,5
Bacillus cereus
17 38,2±3,79 30, 9±3,14
65 17,7±3,98 11,7±1,51
контроль 24,4±1,66 26,0±3,25
Фитостимулирующая активность эпифитных представителей рода
Bacillus
Из представленных в таблице данных видно, что только семь штаммов Bacillus subtilis (№ 13, 40, 50, 55, 60, 73, 79) проявляли фитостимулирующее действие. Показатели активности остальных культур были ниже контроля. В отношении подземной части семян пшеницы проявляли фитостимулирующее действие 14 штаммов Bacillus subtilis. Штаммы № 21, 41, 46, 49, 52, 59, 63, 66 не обладают данными свойствами в отношении подземной части семян пшеницы.
В отношении надземной части семян пшеницы семь штаммов Bacillus pumilis (№ 10, 43, 44, 48, 57, 70-1) проявляли фитостимулирующее действие. Показатели активности остальных культур оказались ниже
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
7
контроля. Ростостимулирующая активность эпифитных Bacillus pumilis в отношении подземной и надземной части семян пшеницы сильно отличается. Только два штамма (№ 44, 70-1) обладают изучаемыми свойствами.
Анализируя результаты эксперимента видно, что пять штаммов Bacillus licheniformis (№ 8, 22, 31, 62, 67) оказывали положительное влияние на рост надземной части семян пшеницы. Показатель активности штамма № 47 значительно отличался от контроля. Фитостимулирующая активность Bacillus licheniformis в отношении подземной и надземной части семян пшеницы не одинакова, т. е. только три штамма (№ 22, 62, 67) проявляли фитостимулирующее действие.
В ходе эксперимента ростостимулирующие свойства выявлены так же у штамма № 3 Bacillus megaterium и штамма № 17 Bacillus cereus в отношении подземной и надземной части семян пшеницы.
Некоторые культуры ингибировали развитие растений. Это может быть связано с накоплением активных метаболитов, высокие концентрации которых подавляют прорастание семян и развитие корневой системы.
Выводы
На основании полученных результатов можно сделать заключение о том, что эпифитные штаммы № 13, 40, 50, 55, 60, 73, 79 (Bac. subtilis), штаммы № 44, 70-1 (Bac. pumilus) и штаммы № 22, 62, 67 (Bac. licheniformis), а также № 3 (Bac. megaterium) и № 17 (Bac. cereus) обладают ростостимулирующей активностью как в отношении подземной, так и надземной частей семян модельного растительного объекта.
Часть штаммов проявляли фитостимулирующие свойства только в отношении надземной - штаммы № 10, 43, 48, 57 (Bac. pumilus), № 8, 31 (Bac. licheniformis), или подземной - штаммы Bac. subtilis № 1, 20, 34, 41, 46, 49, 58, частей пшеницы.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
8
Из 43 протестированных штаммов, проявили фитосмулирующую активность в отношении подземной и надземной частей семян пшеницы 14 штаммов всех видов бацилл. Положительно оказывали влияние на рост только надземной части растений - 6 штаммов (4 штамма - Bac. pumilus, 2 штамма - Bac. licheniformis), на рост только подземной части - 7 штаммов (Bac. subtilis).
Выделение фитогормонов бактериальными клетками в окружающую среду считается одним из важнейших составляющих эффективного растительно-бактериального симбиоза. Стимулирующий эффект
выражается в том, что фитогормоны вызывают усиленный рост надземной части, корневой системы растения, что в свою очередь приводит к улучшению минерального питания. На основании результатов эксперимента in vitro, целесообразно отобрать эти штаммы для дальнейших опытов in vivo.
Таким образом, были выделены и идентифицированы некоторые представители рода Bacillus филлоплана древесных растений г. Ставрополя, обладающие ростостимулирующими свойствами.
Отобранные штаммы являются потенциально перспективными в разработке микробиологических препаратов для растений.
Создана региональная коллекция штаммов эпифитных
микроорганизмов, осуществляется формирование фонда перспективных штаммов с фиторегуляторной активностью, способных к синтезу индольных соединений, витаминов, активно колонизирующих ткани растений.
Экспериментальная проверка и реализация свойств и активности микроорганизмов перспективна в традиционных и новых областях биотехнологии.
Библиографический список:
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
9
1. Возняковская Ю.М. Микрофлора здоровых растений: дис. ... докт. биол. наук. М., 1964. 568 с.
2. Заикина И.А. Экологическая роль бактериального сообщества эпифитов филлосферы в жизнедеятельности растений: автореф. дис....канд. биол. наук. Ставрополь, 2008. 21 с.
3. Мелентьев А.И. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn. в агроэкосистемах. - Москва Наука, 2007. 121 с.
4. Недорезков В. Д. Биологическая защита пшеницы от болезней в условиях Южного Урала . - М.: Изд-во МСХА, 2002. - 172 с.
5. Нетрусов А. И. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / А.И. Нетрусов, Е. А. Бонч-Осмоловская, В. М. Горленко и др.; Под ред. А. И. Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.
6. Определитель бактерий Берджи. В 2 - х т. Т. 1, 2: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. 432 с., ил.
7. Пивоваров Ю.Н., Королик В.В. Санитарно-значимые микроорганизмы
(таксономическая характеристика и дифференциация). - М.: Издательство ИКАР, 2000. 268 с.
8. Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. М.: Изд- во Моск. ун-та, 1983. 26 с.
9. Холмецкая М. О., Лобанок Е. В. Продукция ИУК бактериями,
взаимодействующими с растениями // Тез. докл. Всерос. конф.
«Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках», 14-19 июня, 2001, Санкт-Петербург. - С.-Пб., 2001. - С. 78-79.
10. Compant S., Duffy B., Nowak J., Clement C., Barka E.A. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V.71. - P.495U1959.
References
1. Voznyakovskaya Yu.M. Mikroflora zdorovyih rasteniy: dis. ... dokt. biol. nauk. M., 1964. 568 s.
2. Zaikina I.A. Ekologicheskaya rol bakterialnogo soobschestva epifitov fillosferyi v zhiznedeyatelnosti rasteniy: avtoref. dis....kand. biol. nauk. Stavropol, 2008. 21 s.
3. Melentev A.I. Aerobnyie sporoobrazuyuschie bakterii roda Bacillus Cohn. v agroekosistemah. - Moskva Nauka, 2007. 121 s.
4. Nedorezkov V. D. Biologicheskaja zashhita pshenicy ot boleznej v uslovijah Juzhnogo Urala . - M.: Izd-vo MSHA, 2002. - 172 s.
5. Netrusov A. I. Ekologiya mikroorganizmov: Ucheb. dlya stud. vuzov / A.I. Netrusov, E. A. Bonch-Osmolovskaya, V. M. Gorlenko i dr.; Pod red. A. I. Netrusova. - M.: Izdatelskiy tsentr «Akademiya», 2004. - 272 s.
6. Opredelitel bakteriy Berdzhi. V 2 - h t. T. 1, 2: Per. s angl./ Pod red. Dzh. Houlta, N. Kriga, P. Snita, Dzh. Steyli, S. Uillyamsa. - M.: Mir, 1997. 432 s., il.
7. Pivovarov Yu.N., Korolik V.V. Sanitarno-znachimyie mikroorganizmyi (taksonomicheskaya harakteristika i differentsiatsiya). - M.: Izdatelstvo IKAR, 2000. 268 s.
8. Skvortsova I.N. Identifikatsiya pochvennyih bakteriy roda Bacillus. M.: Izd- vo Mosk. un-ta, 1983. 26 s.
9. Holmeckaja M. O., Lobanok E. V. Produkcija IUK bakterijami,
vzaimodejstvujushhimi s rastenijami // Tez. dokl. Vseros. konf.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
10
«Sel'skohozjajstvennaja mikrobiologija v XIX-XXI vekah», 14-19 ijunja, 2001, Sankt-Peterburg. - S.-Pb., 2001. - S. 78-79.
10.Compant S., Duffy B., Nowak J., Clement C., Barka E.A. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V.71. - P.495U1959.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/08.pdf
