CC BY
161
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
1
УДК 579.26
03.00.00 Биологические науки
ВИДОВОЙ СОСТАВ ЭПИФИТНОЙ МИКРОФЛОРЫ НЕКОТОРЫХ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА GROSSULARIACEAE И РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
Ерина Надежда Викторовна
Коптева Т атьяна Сергеевна
Заикина Ирина Аркадьевна
ФГАОУВПО Северо-Кавказский федеральный
университет, Россия
В статье представлены результаты исследований, проведенных в 2007-2014 годах. Целью изучения стал состав микрофлоры филлоплана некоторых растений семейства Grossulariaceae. На основе полученных данных авторы выделяют типичных представителей микрофлоры филлоплана. Авторы изучают особенности взаимодействий выделенных штаммов микроорганизмов
Ключевые слова: ФИЛЛОПЛАН, ЭПИФИТНАЯ МИКРОФЛОРА, ЭПИФИТНЫЕ БАКТЕРИИ, ЭПИФИТНЫЕ МИКРОМИЦЕТЫ, ЭПИФИТНЫЕ ДРОЖЖИ, АНТАГОНИЗМ, МУТУАЛИЗМ, НЕЙТРАЛИЗМ, СИМБИОЗ, ЧЕРНАЯ СМОРОДИНА, БЕЛАЯ СМОРОДИНА, КРАСНАЯ СМОРОДИНА, КРЫЖОВНИК
НОС 579.26 Biological sciences
SPECIES’ COMPOSITION OF EPIPHYTIC MICROFLORA OF SOME PLANTS OF GROSSULARIACEAE FAMILY AND VARIOUS TYPES OF THEIR INTERACTIONS
Erina Nadezhda Viktorovna
Kopteva T atiana Sergeevna
Zaikina Irina Arkadievna North-Caucasus federal university, Russia
The article presents the results of the research carried out in 2007-2014. The aim of the study was the composition of the microflora of the leaf surface of some plants of the family Grossulariaceae. Based on these data, the authors distinguish the typical representatives of the leaf surface microflora. The authors study the features of isolated strains interactions
Keywords: SURFACE OF LEAF, EPIPHYTIC MICROFLORA, EPIPHYTIC BACTERIA, EPIPHYTIC MICROMYCETES, EPIPHYTIC YEAST, ANTAGONISM, MUTUALISM, NEUTRALISM, SYMBIOSIS, BLACK CURRANT, WHITE CURRANT, RED CURRANT, GOOSEBERRY
Растения являются неотъемлемой частью всех биосистем. При этом все растения сосуществуют с микроорганизмами. Сложные комплексы растения - микрофлора сосуществуют в виде мутуалистических, антагонистических и нейтральных взаимоотношений. При этом подобного рода взаимодействия происходят как между микроорганизмами, так и сообществ микроорганизмов с растением. В литературе все больше накапливается фактов о влиянии микроорганизмов на рост растений, полнее познается видовой состав, глубже изучаются свойства отдельных микроорганизмов, становится понятной роль этой микрофлоры [1,2,3,4,9,10,11].
Любой вид эпифитного микроорганизма обнаруживается и способен жить на поверхности самых различных видов растений. Часто
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
2
при анализах микрофлоры растений наблюдаются очень существенные различия. Эти различия могут выражаться в присутствии совершенно разных микроорганизмов или в различном сочетании одних и тех же видов
[1].
В то же время в литературе содержатся данные об относительно стабильном составе эпифитной микрофлоры многих растений [2,3,4]. Исходя из этого можно предположить, что микроорганизмы, постоянно обитающие на поверхности растений, формируют относительно стабильные сообщества, для которых условия этой экологической ниши оптимальны.
Целью исследования было изучение микробных сообществ эпифитной микрофлоры филлоплана здоровых растений семейства Крыжовниковые (Grossulariaceae) и особенностей взаимодействия выделенных культур.
Для решения поставленной цели были определены задачи:
• Изучение состава микробных сообществ филлоплана растений семейства Grossulariaceae;
• выявление наиболее распространенных микроорганизмов филлоплана изучаемых растений;
• Выявление типов взаимоотношений выделенных культур.
Материалы и объекты исследований
Наши эксперименты были направлены на изучение эпифитного микробиологического комплекса поверхности растений семейства Grossulariaceae (Ribes nigrum, R. rubrum, R. niveum, Grossularia reclinata). Изучение состава эпифитной микрофлоры проводили с 2007 по 2014 год на базе лаборатории кафедры ботаники, зоологии и общей биологии СКФУ в летний, осенний, весенний периоды. Для проведения работы был выбран опытный участок в г. Ставрополе, на котором все исследуемые растения содержались в идентичных условиях.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
3
Отбор проб проводили с филлоплана методом отпечатка листовой пластинки (верхняя и нижняя поверхности). Забор материала производили 1 раз в месяц при соблюдении определенных правил: от момента изъятия листовой пластинки до отпечатка его на питательную среду проходило не более 3 часов, забор материала производился не менее чем через 3 дня после дождя, либо очень влажной погоды, при транспортировке биологического материала соблюдалась стерильность.
Культивирование микроорганизмов проводили при 28±2°C, 37±2°C, 45±2°C в течение 2-9 суток на ГРМ - агаре и среде Сабуро. Выделенные культуры бактерий, плесневых и дрожжеподобных грибов
идентифицировали, пользуясь стандартными методиками [6,7,8,12]. Видовой состав микроорганизмов, полученный при исследовании, отражен в таблице 1.
Таблица 1
Состав микрофлоры филлоплана растений семейства Grossulariaceae
Вид растения Бактерии Грибы
Грамм положительные Грамм отрицательные дрожжи плесневые
Ribes nigrum Bacillus subtilis, B. cereus, B. polymyxa, B. pumilis, B. megaterium; Paenibacillus polymyxa, P. macerans, P. durus, P. humicus; Lactobacillus plantarum; Kocuria rhizophila, K. rosea, K. kristinae, Arthrobacter flavescens, A. album, Rhodococcus flavum, Sarcina maxima Pseudomonas putida, Ps. fluorescens, Ps. syringae; Ps. liquefaciens,, Pantoae agglomerans, P. dispersa;, Escherichia coli, Hafnia alvei Cryptococcus albidus, C. gatti; Candida tolerans, С. oleophila; Aerobasidium pullulans, Rhodotorula glutinis Aspergillus niger, Mucor racemosus, M. oblongata, M. mucedo, Mycosphaerella ribis
R. rubrum Bacillus subtilis, Pseudomonas Cryptococcus Aspergillus
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
4
B. cereus, B. pumilis, B. mycoides, B. megaterium; Paenibacillus polymyxa, P. macerans, P. humicus; Lactobacillus plantarum; putida, Ps. chlororaphis, Ps. syringae; Ps. aeruginosa, Pantoae agglomerans, P. dispersa; Escherichia coli, Hafnia alvei albidus, C. magnus, С. glutinis, C. gatti; Pichia anomala; Candida tolerans, С. oleophila; Aerobasidium pullulans, Rhodotorula glutinis niger, Mucor racemosus, M. oblongata, M. mucedo,
R. niveum Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. mycoides, B. megaterium; Paenibacillus polymyxa, P. macerans, P. durus, P. humicus; Lactobacillus plantarum; Kocuria rhizophila, K. rosea, Pseudomonas putida, Ps. chlororaphis, Ps. aureofaciens, Ps. fluorescens, Ps. liquefaciens, Ps. aeruginosa, Ps. desmolytica, Pantoae agglomerans, Escherichia coli, Hafnia alvei Cryptococcus albidus, С. glutinis, C. gatti; Candida tolerans, С. oleophila; Aerobasidium pullulans, Rhodotorula glutinis Aspergillus niger, Mucor mucedo
Gmssularia reclinata Bacillus subtilis, B. cereus, B. polymyxa, B. pumilis, B. mycoides, Paenibacillus polymyxa, P. maceransP. humicus; Lactobacillus plantarum; Kocuria rosea, K. kristinae, Arthrobacter flavescens, A. album Pseudomonas putida, Ps. chlororaphis, Ps. fluorescens, Ps. syringae; Ps. desmolytica, Pantoae agglomerans, P. dispersa; Erwinia amylovora, Escherichia coli, Hafnia alvei Cryptococcus albidus, C. magnus, С. glutinis, C. gatti; Pichia anomala; Candida tolerans, Aerobasidium pullulans, Rhodotorula glutinis, Rh. rubra Aspergillus niger, Mucor mucedo, Mycosphaerella ribis
Полученные данные позволили нам определить виды,
встречающиеся в составе эпифитной микрофлоры большинства изученных растений на протяжении всего срока изучения. Их мы отнесли к типичным представителям микрофлоры филлоплана. Грамполоджительные бактерии: Bacillus spp, Paenibacillus spp, Lactobacillusplantarum; грамотрицательные бактерии: Pseudomonas spp., Pantoae spp.; дрожжи и дрожжеподобные организмы: Aerobasidium pullulans, Rhodotorula spp., Candida spp..
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
5
Плесневые грибы выделяли не каждый месяц, но к наиболее часто выявляемым видам эпифитов можно отнести: Mucor mucedo и Aspergillus niger.
Анализ полученных данных позволил определить стабильность микробных сообществ в сезонной и годовой динамике. Это позволяет говорить о постоянстве видового состава типичных эпифитных бактерий, которые сосуществуют с растением-хозяином на протяжении длительного времени.
Важным аспектом нашего исследования являлось изучение различных бактериально - фунгальных и межбактериальных взаимодействий выделенных эпифитных штаммов.
При изучении межбактериальных взаимодействий использовали метод перпендикулярных штрихов. На питательный агар в чашке Петри высевают штрихом предполагаемый продуцент антибиотического вещества. Посев штрихом делают по диаметру чашки Петри. Время инкубации продуцента зависит от скорости его роста. После того как продуцент вырастет и образует антибиотическое вещество,
диффундирующее в толщу агара, перпендикулярно к его штриху подсевают штрихами тест-организмы, начиная от периферии чашки. Для посева используют густые суспензии тест-организмов в стерильной водопроводной воде. Чашки выдерживают в термостате при 28-30°С в течение 2-8 суток в зависимости от скорости роста тест-организмов. Нечувствительные к антибиотическому веществу тест-организмы растут вблизи штриха продуцента. Если антибиотик оказывает действие на тесторганизм, то рост последнего будет наблюдаться вдали от штриха продуцента[6,7].
Для изучения бактериально-фунгальных взаимоотношений
пользовались методом агаровых блочков. Метод предусматривает использование разных питательных сред для выращивания продуцента
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
6
антибиотика и тест-организмов. После застывания агара продуцент антибиотического вещества высевают сплошным газоном. Для этого споры переносят петлей на агаровую пластинку, распределяют по всей поверхности шпателем и инкубируют при 28-30°С в течение 8-10 суток. Затем стерильным пробочным сверлом (диаметр 6-8 мм) вырезают агаровые блочки с газоном исследуемой культуры и переносят их на поверхность агаризованной среды, например, МПА, только что засеянной тест-организмом. Агаровые блочки раскладывают по шаблону на равном расстоянии один от другого и на расстоянии 1,5-2,0 см от края чашки мицелием вверх и плотно прижимают к агаровой пластинке. Для лучшей диффузии антибиотических веществ в толщу питательной среды, засеянной тест-организмом, блочки можно закладывать непосредственно в лунки, предварительно вырезанные тем же сверлом. На одной чашке можно разместить 4-5 агаровых блочков с различными продуцентами антибиотиков. Чашки выдерживают 1 ч при комнатной температуре для диффузии антибиотических веществ в толщу агара, затем помещают в термостат при температуре, благоприятной для развития тест-организма на сутки и более в зависимости от скорости его роста. Если тест-организм чувствителен к антибиотическому веществу продуцента, то после инкубации вокруг агаровых блочков образуются зоны отсутствия его роста. Чем больше выделяется антибиотика и чем он активнее, тем больше будет диаметр зоны отсутствия роста тест-организма. Тест-организм, не чувствительный к антибиотическому веществу данного продуцента, растет по всей поверхности среды и даже вблизи блочка продуцента.
Используя описанные выше методы, мы выявили штаммы бактерий, которые не проявляли антагонистическое влияние на остальные штаммы бактерий, а также не обладали фунгицидным действием. К этой группе мы отнесли следующие виды: Paenibacillus. macerans, P. durus,
P.humicus;Lactobacillus plantarum;Kocuria rhizophila, K. rosea, K. kristinae,
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
7
Pseudomonas putida, Ps. syringae; Ps. liquefaciens, Pantoae agglomerans, P. dispersa; Escherichia coli, Hafnia alvei, Arthrobacter flavescens, A. album, Rhodococcus flavum, Sarcina maxima.
Другую группу бактерий образуют штаммы, обладающие мутуалистическим взаимодействием - при их совместном росте наблюдалось усиление роста двух штаммов. В состав этой группы вошли: Pseudomonas liquefaciens, Bacillus. cereus Arthrobacter flavescens, A. album.
Третью группу составили бактерии, обладающие выраженным антибиотическим или фунгицидным действием. В эту группу вошли следующие штаммы бактерий, относящиеся к видам: Bacillus subtilis, Bac. pumilis, Bac. polymyxa, Bac. megaterium, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescens. Результаты
эксперимента отражены в таблице 2 .
Таблица 2
Фунгицидные свойства микроорганизмов филлоплана
Наименование штамма Тестируемая культура, зоны подавления роста, мм
Aspergillus niger Mucor racemosus M. oblongata M. mucedo Mycosphaerella ribis
В. subtilis-34 21 17 26 28 0
В. subtilis-41 17 15 13 10 7
В. subtilis-49 37 57 33 37 42
В. subtilis-82 12 16 21 25 28
В. subtilis-112 31 45 33 27 33
В. subtilis-136 26 24 20 18 18
B. pumilus-155 27 23 17 15 12
В. subtilis-187 34 53 33 35 28
B. polymyxa-133 35 31 15 13 13
B. megaterium-156 33 17 12 11 18
B.megaterium-176 11 13 9 14 11
Paenibacillus polymyxa-123 12 10 16 12 0
Paenibacillus polymyxa-131 28 22 26 18 15
Pseudomonas aureofaciens-88 19 22 31 37 26
Pseudomonas aureofaciens-79 39 56 29 33 38
Pseudomonas fluorescens-139 17 19 0 0 48
Pseudomonas fluorescens-146 33 42 17 19 10
Pseudomonas fluorescens-153 21 17 15 16 8
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
8
Эксперимент позволил выявить бактериальные штаммы, обладающие наиболее выраженной и широко представленной фунгицидной активностью. К ним можно отнести штаммы Bacillus subtilis - 49, Bac. subtilis - 112, Bac.subtilis - 187, Pseudomonas aureofaciens- 79 и Ps. fluorescens-146. Эти бактерии выполняют в сложном комплексе эпифитной микрофлоры роль стабилизатора роста микромицетных форм.
Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу, что в состав комплекса эпифитных микроорганизмов растений семейства Grossulariaceae входит большое количество бактериальных, дрожжевых и плесневых грибов. Они сосуществуют в составе микрофлоры филлоплана и представляют собой сложный экологический комплекс, представители которого взаимодействуют по типу взаимовыгодных, нейтральных и антагонистических отношений.
Литература
1. Возняковская, Ю.М. Микрофлора растений и урожай / Ю.М. Возняковская. — Л.: Изд-во «Колос», 1969. 240 с.
2. Возняковская, Ю.М. Видовой состав эпифитной микрофлоры живых растений / Ю.М. Возняковская, Я.П. Худяков // «Микробиология». 1960. - т. XXIX. - вып. 1.-С. 124-125.
3. Делова, Г.Д. Микробные ценозы на листьях растений / Г.Д. Делова, Т.Т. Кузнецова // Микрофлора растений и почв. Новосибирск: Наука, 1973. - С. 3245.
4. Звягинцев, Д.Г. Растения как центры формирования бактериальных сообществ / Д.Г. Звягинцев, Т.Г. Добровольская, JI.B. Лысак // Журнал общей биологии, 1993. Т. 54. - № 2. - С. 183-199.
5. Сидоренко, О.Д. Лабораторный практикум по микробиологии / О.Д. Сидоренко. М.: МСХА, 1999. - 119 с.
6. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З.Теппер, В.К. Шильникова, К.И. Переверзева. - М.: Колос, 1994. - 326 с.
7. Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений/ А.И. Нетрусов, М.А.Егорова, Л.М.Захарчук и др., Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.
8. Бабьева, И.П. Методы выделения и идентификации дрожжей / И.П. Бабьева, В.И. Голубев. - М.: Пищевая промышленность, 1979. 120 с.
9. Делова, Г.В. Ультратонкая структура слизистых капсул желтопигментных эпифитных бактерий / Г.В. Делова // Структурные и функциональные связи высших растений и микроорганизмов. - Новосибирск: Наука, 1977. - С. 189- 203.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
Научный журнал КубГАУ, №114(10), 2015 года
9
10. Бабаджанова В.А. Калимбетова Р.Ю. Биологические особенности эпифитной (дрожжевой) микрофлоры в Каракалпакстане// Труды второй международной научнопрактической конференции молодых ученых «Индикация состояния окружающей среды: теория, практика, образование»/.25-28 апреля 2013 года: сборник статей. - М.: ООО «Буки Веди», 2013.
11. Торопова, Г.В. Особенности жизнедеятельности комнатных растений в сезонной динамике по индикаторным симбиотрофным бактериям: Дис.... канд. биол. наук / Г.В. Торопова. - Москва, 2005. - 124 с.
12. Определитель бактерий Берджи. В 2 - х т. Т. 1, 2: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Хоулта,
H. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. 432 с., ил.
REFERENCES:
I. Voznyakovskaya, YU.M. Mikroflora rastenij i urozhaj / YU.M. Voznyakovskaya. — L.: Izd-vo «Kolos», 1969. 240 s.
2. Voznyakovskaya, YU.M. Vidovoj sostav ehpifitnoj mikroflory zhivyh rastenij / YU.M. Voznyakovskaya, YA.P. Hudyakov // «Mikrobiologiya». 1960. - t. XXIX. - vyp. 1.-S. 124125.
3. Delova, G.D. Mikrobnye cenozy na list'yah rastenij / G.D. Delova, T.T. Kuznecova // Mikroflora rastenij i pochv. Novosibirsk: Nauka, 1973. - S. 3245.
4. Zvyagincev, D.G. Rasteniya kak centry formirovaniya bakterial'nyh soobshchestv / D.G. Zvyagincev, T.G. Dobrovol'skaya, JI.B. Lysak // ZHurnal obshchej biologii, 1993. T. 54. - № 2. - S. 183-199.
5. Sidorenko, O.D. Laboratornyj praktikum po mikrobiologii / O.D. Sidorenko. M.: MSKHA, 1999. - 119 s.
6. Tepper, E.Z. Praktikum po mikrobiologii / E.Z.Tepper, V.K. SHil'nikova, K.I. Pereverzeva. - M.: Kolos, 1994. - 326 s.
7. Praktikum po mikrobiologii: Ucheb. Posobie dlya stud. vyssh. ucheb. zavedenij/ A.I. Netrusov, M.A.Egorova, L.M.Zaharchuk i dr., Pod red. A.I. Netrusova. - M.: Izdatel'skij centr «Akademiya», 2005. - 608 s.
8. Bab'eva, I.P. Metody vydeleniya i identifikacii drozhzhej / I.P. Bab'eva, V.I. Golubev. -M.: Pishchevaya promyshlennost', 1979. 120 s.
9. Delova, G.V. Ul'tratonkaya struktura slizistyh kapsul zheltopigmentnyh ehpifitnyh bakterij / G.V. Delova // Strukturnye i funkcional'nye svyazi vysshih rastenij i mikroorganizmov. - Novosibirsk: Nauka, 1977. - S. 189- 203.
10. Babadzhanova V.A. Kalimbetova R.YU. Biologicheskie osobennosti ehpifitnoj (drozhzhevoj) mikroflory v Karakalpakstane// Trudy vtoroj mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii molodyh uchenyh «Indikaciya sostoyaniya okruzhayushchej sredy: teoriya, praktika, obrazovanie»/.25-28 aprelya 2013 goda: sbornik statej. - M.: OOO «Buki Vedi», 2013.
11. Toropova, G.V. Osobennosti zhiznedeyatel'nosti komnatnyh rastenij v sezonnoj dinamike po indikatornym simbiotrofnym bakteriyam: Dis.... kand. biol. nauk / G.V. Toropova. -Moskva, 2005. - 124 s.
12. Opredelitel bakteriy Berdzhi. V 2 - h t. T. 1, 2: Per. s angl./ Pod red. Dzh. Houlta, N. Kriga, P. Snita, Dzh. Steyli, S. Uillyamsa. - M.: Mir, 1997. 432 s., il.
http://ej.kubagro.ru/2015/10/pdf/07.pdf
