Автоматизированная регистрация спонтанной двигательной активности зародышей Danio rerio в биотестировании факторов окружающей среды Текст научной статьи по специальности «Медицинские технологии»

УДК 57.087.31/37

A. В. Трушин, инженер,

И. А. Габай, старший научный сотрудник,

Е. В. Мухачев, канд. биол. наук, начальник лаборатории,

К. Г. Лямов, канд физ.-мат. наук, начальник лаборатории,

B. Н. Носов, д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник,

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт прикладных проблем» (ГосНИИПП), Санкт-Петербург

Автоматизированная регистрация спонтанной двигательной активности зародышей Danio rerio в биотестировании факторов окружающей среды

Ключевые слова: спонтанная двигательная активность, биотестирование, электромагнитное излучение. Keywords: spontaneous locomotion, bioassay test, electromagnetic irradiation.

Разработан и применен метод автоматизированной регистрации спонтанной двигательной активности Костистых рыб Danio rerio на стадии 35 пар сомитов. Реализованный программный продукт обеспечил возможность тонкой настройки чувствительности анализа и его синхронизации в пределах всей популяции эмбрионального материала. В результате экспериментальной апробации метода показано повышение эффективности биотестирования, основанного на оценке воздействия факторов окружающей среды на реактивность нервной системы на стадиях ее становления.

В настоящее время степень экологической опасности традиционно оценивают путем определения в окружающей среде отдельных потенциально вредных воздействий и сравнения полученных результатов с нормативно установленными для них предельно допустимыми значениями. Такой способ контроля имеет ряд существенных недостатков. Аналитические методы, как правило, трудоемки, продолжительны в своей реализации, зачастую требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, высококвалифицированного обслуживающего персонала. Главный недостаток этих методов заключается в том, что они не могут гарантировать достоверной оценки экологической опасности, сколь широким ни был спектр анализируемых факторов [1].

Показатели, используемые в практике экологического нормирования, как правило базирующие-

ся на исследованиях с отдельными биообъектами, не могут учитывать изменений токсичности загрязнителей за счет эффектов синергизма или антагонизма при сочетанном действии антропогенных факторов. Поэтому наряду с физико-химическими методами следует использовать методы биологического контроля и диагностики — биоиндикацию и биотестирование, дающие объективные интегральные оценки качества среды и основание для прогноза состояния экосистем.

Таким образом, интегральная оценка качества окружающей среды является актуальной прикладной научной задачей [2], а к особенно востребованным следует отнести способы и подходы интегральной оценки качества экологической обстановки путем биотестирования.

Решение актуальных проблем современной экологии, касающихся изучения биологического действия факторов различной природы и интенсивности, требует разработки тест-систем, отличающихся простотой, экономичностью и быстротой получения результата [3], что, как правило, подразумевает использование простых по уровню организации организмов. Так, среди методов биотестирования абиотических факторов среды выделяют так называемые экспресс-тесты [4], позволяющие не только быстро оценить степень воздействия, но и определить биологический процесс — мишень воздействия фактора.

Конечной целью биотестирования является оценка безопасности исследуемого фактора на модельных объектах с последующим прогнозированием реакции организма человека, а потому главным требо-

ванием подобных систем биотестирования является их экологический реализм [5], т. е. теоретически обоснованная возможность экстраполяции полученных результатов на биологические системы более высоких уровней.

Однако при повышении экологического реализма теста (как правило, за счет применения интегральных тест-реакций) снижаются его чувствительность и оперативность. Так, функциональные параметры являются более лабильными, чем структурные, а параметры клеточного и молекулярного уровней обладают меньшей экологической информативностью, но более предпочтительны в отношении чувствительности, оперативности и воспроизводимости.

Таким образом, существует научная проблема совмещения чувствительности и оперативности интегрального метода биотестирования факторов окружающей среды в пределах одной тест-модели, соответствующей критерию экологического реализма и пригодной для экстраполяции на физиологически значимые процессы в организме человека.

Модели на основе зародышей Костистых рыб (чаще всего Башо гегю) используются для решения широкого круга задач биотестирования [5], связанных с предварительной проверкой качества условий среды и фармакологических препаратов [6]. Выбор эмбриональных стадий для решения поставленных задач является предпочтительным из-за их крайне высокой чувствительности к абиотическим факторам среды ввиду недостаточного развития компенсаторных систем.

В рамках данной работы впервые проводилась автоматизированная оценка спонтанной двигательной активности зародышей на стадии сомитогенеза в нормальных условиях при воздействии электромагнитного излучения портативной ПЭВМ.

Спонтанная двигательная активность является мерой реактивности нервной системы на стадиях ее становления, а ее регистрация позволяет оценить степень воздействия исследуемого фактора на соотношение процессов возбуждения и торможения.

Регистрация спонтанной двигательной активности зародышей рыб, как и других микроскопических объектов, традиционным образом представляет собой заполнение лаборантом-оператором таблицы наблюдений. Недостатками такого подхода являются ограниченная чувствительность и избирательность зрительного анализатора человека, его утомляемость. Невозможность одновременного наблюдения за популяцией требуемого объема приводит к вынужденному последовательному анализу зародышей, находящихся на различных стадиях развития и подвергающихся экспериментальному воздействию в неравные промежутки времени.

Так, исходя из требуемой продолжительности наблюдения 5 мин, оператору необходимо не менее 5 ч для анализа двух выборок объемом по 30 особей в каждой — минимального с точки зре-

ния достоверной статистической обработки на уровне p = 0,05.

Однако за требуемые 5 ч естественный уровень спонтанной двигательной активности зародышей будет изменяться в соответствии со сменяющимися стадиями эмбрионального развития. Это является основной причиной того, что описываемый параметр не используется в качестве тест-функции в процедурах биотестирования.

Для устранения описанных выше недостатков метода и повышения эффективности технологии биотестирования в целом был разработан и применен метод автоматизированной регистрации спонтанной двигательной активности зародышей Danio rerio на стадии 35 пар сомитов.

Материалы и методы

Для автоматизации биотестирования был разработан программный продукт с условным названием Caviar. Целью разработки приложения является автоматизированный расчет следующих характеристик для каждого зародыша исследуемой группы:

1) количество движений K (число актов спонтанной двигательной активности);

2) полное время движения (Ta, c; Aa = 100 х X Ta / T, %);

3) полное время покоя (T0, c; А0 = 100 х T0 / T, %);

4) среднее время движения (ta = Ta / K, c; da = = 100 X ta / T, %);

5) среднее время покоя (ta = T0 / (K + 1), c; da = = 100 X t0 / T, %).

Расчетные параметры характеризуют катаболи-ческую активность зародышей, смещение уровня которой в ту или иную сторону относительно нормы является экологически обоснованной реакцией модели для биотестирования.

Первый параметр позволяет грубо ранжировать исследуемые объекты. Второй и третий параметры очевидным образом взаимосвязаны. Они позволяют оценить преимущественный характер поведения каждого зародыша за время наблюдения. Усредненные величины, указанные в п. 4 и 5, позволяют получить более объективную картину поведения зародыша за счет уменьшения влияния слишком длинных и слишком коротких по продолжительности движений, если их количество невелико.

Для удобства интерпретации временные характеристики представлены как в абсолютных единицах измерения, так и в относительных. В перечисленных характеристиках проценты рассчитываются от общей продолжительности эксперимента Т, вводимой исследователем.

Изначально была предпринята попытка максимально автоматизировать эксперимент, с тем чтобы приложение автоматически определяло и количество исследуемых зародышей, и их местоположение. Однако апробация первой версии такого

приложения в различных условиях (с различными видеокамерами, при различном размещении экспериментального стенда, при различной освещенности) с «ручной» проверкой результатов показала, что в определении количества исследуемых объектов и их двигательной активности возможны пропуски, что недопустимо снижает достоверность разработанной методики биотестирования.

Поэтому в итоговой версии экспериментального приложения действия оператора-исследователя и автоматическая обработка сбалансированы. Общая последовательность проведения одной автоматизированной итерации состоит из этапов:

1) подготовки экспериментального стенда;

2) запуска приложения, настройки параметров видеокамеры, ввода описательных данных;

3) калибровки видеокамеры для определения показателя шумности в пустой капле среды;

4) размещения зародышей;

5) записи экспериментального видео;

6) ручного выделения объектов на изображении;

7) автоматической обработки экспериментального видео, формирования отчета с расчетными характеристиками.

Интерфейс пользователя после запуска приложения показан на рис. 1.

Принципиальным является то, что калибровка, запись и обработка результатов являются независимыми этапами. В случае нарушения хода эксперимента исследователь может повторить каждый из них. Размещать экспериментальный стенд необходимо в равномерно освещенном месте с отсутствующей вибрацией. Чтобы исключить случайные вибрации во время эксперимента, которые могут быть восприняты процедурой анализа как движение зародышей, исследователь указывает подходящее значение таймера, за время которого он должен достаточно удалиться от экспериментального стенда после запуска процедуры записи.

Для анализа видеокадры переводятся в яркост-ное представление. Показатель шумности предназначен для учета цифрового шума видеокамеры и оценивается по формуле

x =

3

TF -1

TF

ps i=1

12»i.

где

N M

СТ,- =

2 2(di,n,m - di) '

n =1 m=1

NM -

n, m = Vi+1 , n,

m •'i, n, m

i = 1, ..., ТЕ -1, п = 1, ..., Ы, т = 1, ..., М;

рь

Т — заданная длительность наблюдения, с; ¥рь — частота записи видео, кадров/с; ЫМ — размер кадра; у^ п т — пиксель i-го кадра с координатами п, т в яркостном представлении; — разностный кадр (абсолютная разность двух смежных кадров).

Таким образом, показатель шумности есть троекратное усредненное среднеквадратичное отклонение, рассчитанное по разностным кадрам. На основе экспериментальной апробации длительность оценки показателя шумности задавалась равной 20 с при частоте записи 25 кадров/с.

После оценки показателя шумности происходит запись экспериментального видео. Оба процесса должны протекать в одинаковых условиях: при одних и тех же местоположении и освещенности. Как правило, в затемненных помещениях цифровой шум видеокамеры проявляется больше.

После завершения записи оператору-исследователю предлагается вручную выделить прямоугольные области зародышей, используя в качестве основы первый кадр видео, отображаемый на дополнительной панели. Неверно выделенные области могут быть скорректированы. Предельно точного выделения зародышей не требуется, так как введено пороговое значение площади, содержащей движение зародыша. На рис. 2 представлена панель с изображениями зародышей, выделенных исследователем.

Рис. 1

Графический интерфейс приложения Caviar после запуска

2

Рис. 2 | Панель приложения для выделения зародышей (пример)

Процесс анализа экспериментального видео заключается в определении изменений в каждой области, расцениваемых как движения зародышей. Подход с фиксированным пространственным местоположением допустим, так как движения зародышей имеют вращательный характер.

Решающее правило для определения движения в у-й области очередного (А-го) кадра:

100Uk

> 5,

где NjMj — размеры j-й области; Uk — количество пикселей j-й области, абсолютное изменение которых относительно предыдущего кадра превышает Х-

Для принятия решения о движении j-го зародыша используется дополнительное ограничение на длительность. Движение засчитывается, только если оно происходит не менее чем за FpsTmin кадров подряд, где Tmin — минимальное время движения, задаваемое в основном окне приложения. Варьируя этот параметр для одной и той же экспериментальной видеозаписи, можно «отфильтровать» двигательную активность зародышей по величине.

Завершающей стадией экспериментальной обработки является формирование текстового отчета в формате CSV для последующего анализа (например, в приложении MS Excel).

Разработанный программный продукт предназначен для ОС семейства Windows и позволяет работать с любым источником видео, подключаемым по интерфейсу USB. В большинстве проведенных экспериментов использовался микроскоп с видеокамерой Lieca ES 2.

Получение и инкубирование зародышей Danio rerio производились в соответствии с рекомендациями работы [7].

На стадии 75%-ной эпиболии эмбриональный материал разделяли на две группы: физиологический контроль и экспериментальную, по 30 зародышей в каждой. Условия экспозиции групп сравнения были идентичными, за исключением наличия ПЭВМ в 0,3 м от чашки Петри с экспериментальной выборкой.

При экспериментальной экспозиции ПЭВМ работала от электросети напряжением 220 В в стандартном режиме загрузки программных и аппаратных средств на базе операционной системы Windows Vista с заставкой «Пустой экран».

Характеристики ПЭВМ (по техническому паспорту): производитель — Asus, ЦПУ — Intel 1,5 ГГц, частота ОЗУ — 1066 МГц.

Характеристики электромагнитного поля ПЭВМ по результатам измерений в экранированной без-эховой камере:

• напряженность магнитного поля в диапазоне 1-30 МГц — 1,3 • 10-1 А/м;

• напряженность электрического поля в диапазоне 1-300 МГц — 1,1 • 10-1 В/м;

• интенсивность ППЭ (более 300 МГц) — 8,2 х х 10-7 Вт/м2.

При достижении стадии 35 пар сомитов [7] зародыши размещались в капле воды в поле зрения стереоскопического микроскопа с видеокамерой. В течение 5 мин производилась видеорегистрация популяции зародышей, после чего полученный видеофайл подвергался машинной обработке.

Материалы исследования подвергнуты статистическому анализу. Выборки оценивались с позиции распределения. Нормальность распределения оценивалась по параметрам описательной статистики и методу Шапиро—Уилка. Минимальный объем выборок определялся с использованием быстрых формул и таблиц. При нормальном распределении сравнение средних значений производилось по методам Стью-дента и Фишера, при ненормальном распределении — с использованием критерия Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

Таким образом, разработанная технология анализа видеоизображения, помимо возможности синхронного анализа популяции объектов требуемого объема, позволила решить проблему большой прозрачности эмбрионального материала Костистых рыб. Так, малопигментированные зародыши являются оптически слабой мишенью для анализа с использованием коммерческих пакетов анализа фото- и видеоизображения для решения задач в области биологии и медицины.

Экспериментальная группа

Физиологический контроль

Рис. 3

Повышение частоты спонтанной двигательной активности зародышей Danio гегю на стадии 35 пар сомитов после 24-часового воздействия электромагнитного излучения ПЭВМ. Данные представлены в виде т ± С1

В процессе обработки полученных результатов было показано, что выбранный экспериментальный параметр, при условии реализованной технологии анализа, является чувствительным к сверхслабому электромагнитному излучению ПЭВМ.

На рис. 3 представлены данные, полученные путем автоматизированного анализа спонтанной двигательной активности зародышей на стадии 35 пар сомитов, когда у них обнаруживаются движения по типу дрожания и подергивания отдельных частей тела, возникающие спонтанно на эндогенной основе. Движения по типу вращения и змеевидного изгибания к этому времени не проявляются.

Показано значительное повышение уровня спонтанной двигательной активности эмбрионов, подвергшихся суточному воздействию электромагнитного излучения ПЭВМ. Подобное отличие от нормы представляет собой пример отклонения в распределении катаболической активности в процессе онтогенеза. Наблюдаемый эффект не является проявлением онтогенетической стабильности популяции; напротив, впоследствии в экспериментальной выборке наблюдаются задержка вылупляемости и повышенная смертность на предличиночных и личиночных стадиях развития [5], что может быть связано с перерасходом питательных веществ или избыточным возбуждением моторных центров на стадиях их становления.

Экологический реализм данного метода подтверждается тем, что электромагнитные излучения с приведенными характеристиками проявляются на различных уровнях организации живой материи. Эти изменения фиксируются с клеточного уровня организации в форме снижения пролиферативного пула популяции, проявляются в виде падения уровня эмоциональной реактивности у млекопитающих и, наконец, представлены реакцией целостного организма человека-пользователя. Так, показан парасимпатический сдвиг регуляции вегетативной нервной системы [5].

Заключение

Таким образом, автоматизация процесса регистрации спонтанной двигательной активности зародышей Костистых рыб на стадиях сомитогенеза позволяет использовать этот интегральный параметр биотестирования с высоким экологическим реализмом для решения задач комплексного контроля вредных факторов окружающей среды.

Разработанный программный продукт позволил заменить наиболее рутинные и утомительные действия исследователя автоматически выполняемыми операциями, повысив производительность и эффективность процедуры биотестирования за счет синхронного анализа популяции статистически обоснованного объема.

Литература

1. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование / Под ред. О. П. Мелехова, Е. И. Са-рапульцева. 3-е изд. М.: Академия, 2010. 288 с.

2. Черемных Е. Г. Биотестирование, или биологическая оценка безопасности в настоящем и будущем // Экология и промышленность России 2003. № 10. С. 44—46.

3. Установка для прижизненной морфометрии регенириру-ющей планарии / В. Г. Вишневский, М. М. Махонина, Н. А. Демцун, Н. А. Темурьянц // Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского. Сер. «Биология, химия». 2007. Т. 20, № 4. С. 18-21.

4. Носов В. Н., Мухачев Е. В., Габай И. А. Возможность экспресс-анализа воздействия абиотических факторов на биологиче-

ские системы, основанная на использовании зародышей Danio rerio (Teleostei) // Материалы 3-й Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека». Ульяновск, 2009. С. 226-227.

5. Мухачев Е. В., Носов В. Н. Методы биотестирования электромагнитного излучения в зоне рабочего места пользователя персональных компьютеров // Актуальные вопросы экологии и природопользования: Сб. тр. / Отв. ред. Н. А. Черных. М., 2013. Вып. 15. С. 451-454.

6. Kamman U.,Vobach M., Wosniok W. Toxic effects of brominated indoles и phenols on Zebrafish embryos // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2006. Vol. 51. P. 97-102.

7. Kimmel C. B., Ballard W. W., Kimmel S. R. Stages of embryonic development of the zebrafish // Developmental Dynamics. 1995. Vol. 203. P. 253-310.

УДК 612

С. П. Кропотов, канд. мед. наук, заместитель начальника Центра, А. Ю. Токарев, научный сотрудник, А. В. Вьюшина, канд. биол. наук, научный сотрудник, А. С. Головина, научный сотрудник,

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт прикладных проблем» (ГосНИИПП), Санкт-Петербург

А. В. Притворова, младший научный сотрудник,

ФГБУН «Институт физиологии им. И. П. Павлова» РАН, Санкт-Петербург

Е. Б. Филиппова, канд. биол. наук, старший преподаватель,

ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова», Санкт-Петребург

Определение гипоксической устойчивости человека по спектрофотометрическим показателям окислительного стресса

Ключевые слова: спектрофотометрия, гипоксия, окислительная модификация белков, восстановленные тиолы. Keywords: spectrophotometry, hypoxia, oxidizing modification of proteins, reduced thiols.

Спектрофотометрическое исследование показателей окислительного стресса позволяет спрогнозировать гипоксическую резистентность. Исследованы окислительная модификация белков как индикатор окислительного стресса и уровень восстановленных тиолов как показатель антиоксидантной системы.

Введение

Одним из методов определения устойчивости к гипоксической нормобарической гипоксии является выполнение гипоксической пробы с контролем

сатурации крови, пульса, электрокардиограммы и оценкой самочувствия обследуемого [1]. Гипоксиче-ская проба проводится под контролем врача, имеющего соответствующую квалификацию, и требует наличия комплекса определенного оборудования. Несмотря на широкое использование гипоксической пробы, методика недостаточно формализована, а при ее проведении возникает риск развития вегетативных и неврологических нарушений вплоть до полной потери сознания.

В то же время известно, что любое гипоксиче-ское состояние аэробных организмов приводит к развитию окислительного стресса [2], пусковым механизмом которого является генетически детерминированное повышение уровня активных форм кис-