CC BY
93
УДК 574.24 ББК 28.0
Е.В. Мухачев, К.А. Михайлова, И.А. Габай, В.Н. Носов
метод биотестирования влияния электромагнитного излучения увч диапазона с использованием модели ингибируемого роста колоний дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE S288C
Предложен оригинальный метод биотестирования электромагнитного излучения (ЭМИ) с использованием модели ингибированного роста дрожжей Saccharomyces. Суть метода состоит в сочетанном воздействии на растущую колонию дрожжей двух факторов - ЭМИ и ингибитора роста. Воздействие ЭМИ может повысить проницаемость мембраны, а ингибитор роста, проникая в клетку в больших количествах, дополнительно снижает скорость роста колонии. В качестве подтверждения работоспособности метода приведена его апробация.
Ключевые слова:
биотестирование, дрожжи, проницаемость клеточной мембраны, чувствительность, электромагнитное излучение.
Уровень электромагнитных полей (ЭМП) искусственного происхождения, количество которых в окружающей среде неуклонно повышается, и напряжённость которых превышает напряженность естественных на несколько порядков, вызывает нарушения адаптационно-компенсаторных возможностей организма, а в некоторых случаях приводит к их истощению, что является причиной необратимых последствий на системном уровне [1; 3]. Электромагнитная среда обитания может рассматриваться как источник помех жизнедеятельности человека и биоэкосистем. Возникает проблема биоэлектромагнит-ной совместимости - проблема взаимного влияния живых организмов и технических средств - источников ЭМП [20], в том числе, персональных электронно-вычислительных машин (ПЭВМ).
В настоящее время особое внимание уделяется вопросам нормирования электромагнитной нагрузки на человека, однако используемые технические средства не обладают необходимой чувствительностью. Таким образом, разработка методов биотестирования, чувствительных к электромагнитному излучению (ЭМИ) информационных (нетепловых) уровней интенсивности, является актуальной проблемой экологии и медицины.
Среди методов биотестирования абиотических факторов среды, помимо классических хронических экспериментов, выделяют так называемые экспресс тесты [5], позволяющие не только быстро оценить степень воздействия, но и определить биологический процесс - мишень воздействия ЭМИ. Общепризнанных биоиндикаторов
электромагнитной среды в настоящее время не существует [6], однако одним из самых распространенных объектов исследования в области биотестирования являются дрожжи [16; 18; 23]: они сочетают преимущества прокариотических моделей (скорость роста колоний, меньшая сложность генетической модификации) и эукариотических организмов, изучение которых позволяет экстраполировать полученные данные для организма человека [10; 14].
Для использования дрожжей разработаны различные тест-системы [18], однако область их применения, как правило, ограничивается фармакологическими исследованиями и биотестированием различных химических соединений. Для биотестирования ЭМИ дрожжи практически не используются, так как в [12; 13] показано, что, при поддержании оптимальных для Saccharomyces cerevisiae условий внешней среды, эффекты воздействия неионизирующего ЭМИ, исследуемые на физиологическом уровне по стандартным показателям ростовых процессов, не выявляются. Для визуализации возможных скрытых эффектов ЭМИ на биологические системы было предложено [8; 19] совместное или последовательное воздействие ЭМИ и стрессового фактора с известным механизмом действия, причем определенный стрессовый фактор позволит выявить воздействие ЭМИ на конкретную единичную функцию или группу функций в клетке [7].
Таким образом, в настоящее время не выработан экспериментальный подход оценки влияния сверхслабого электро-
Среда обитания
Terra Humana
магнитного излучения УВЧ диапазона с использованием систем экспресс биотестирования. В настоящей статье изложены алгоритм метода биотестирования с использованием дрожжей Saccharomyces cere-visiae S288C и его апробация для оценки воздействия ЭМИ ПЭВМ.
Область применения метода. Представленный ниже метод позволяет производить оценку биологического эффекта ЭМИ на проницаемость цитоплазматической мембраны. Основным действующим веществом ^метил-^(1-нафтилме-тил)-3 -фенил-2-пропен-1-амина является нафтифин, который относится к классу аллиламинов и связан с ингибированием биосинтеза эргостерола [4] - регулятора жидкостности мембраны. При недостатке эргостерола в мембране частично нарушается её барьерная функция, что приводит к нерегулируемым прямому и обратному транспорту, в результате чего частота клеточных делений понижается.
Метод разработан для анализа ЭМИ ПЭВМ нового поколения, для которых характерны следующие параметры: частота ЭМИ - 1-3 ГГц, переносимая эффективная мощность излучения (ПЭМИ) - 0,001-0,01 Вт. В исследованиях с применением дополнительного стрессового фактора [7; 22] с целью исследования влияния ЭМИ на те или иные физиологические функции дрожжей параметры ЭМИ сходны по своей частоте [7], однако уровень ПЭМИ на несколько порядков выше требуемого: 0,5 Вт [7] и 15-30 Вт [22]. Подобные системы биотестирования с необходимой чувствительностью (ПЭМИ от 0,001 Вт) в настоящий момент не разработаны.
Материалы биотестирования. Объектом исследований являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, штамм S288C. Хранение культуры осуществляется при стандартных условиях [23] .
Порядок и условия проведения исследований. Для проведения биотестирования необходимы два типа питательной среды: жидкая и твердая.
Для приготовления одного литра жидкой среды необходимо 20 г пептона, 10 г дрожжевого экстракта, 10 г глюкозы и 1 литр воды. Все реактивы смешиваются в лабораторной посуде, и полученная смесь нагревается с постоянным перемешиванием, до зрительной однородности.
Для приготовления твердой среды в жидкую среду добавляется агар из расчета 20 г на один литр жидкой среды. Среда с агаром нагревается при непре-
рывном перемешивании до зрительной однородности.
Из культуры дрожжей бактериологической петлей берется проба и помещается в стеклянную пробирку с 1 мл жидкой среды с добавлением 200 мкл ^метил-^(1-нафтилметил)-3 -фенил-2-пропен-1-амина. Пробирки следует накрыть светонепроницаемым колпаком и поставить на нагревательный столик с постоянной температурой поверхности 21° С.
Группы сравнения формируются следующим образом: экспериментальный
материал находится в помещении с источником ЭМИ (продолжительность экспозиции - 24 часа), биологический контроль дополнительным воздействиям не подвергается при прочих не отличных условиях экспозиции.
За сутки дрожжи в пробирке делятся, и достигается предельная плотность популяции, после чего 10 мкл суспензии следует перенести на поверхность твердой среды в чашке Петри (диаметр 40 мм) и растереть шпателем по поверхности до полного впитывания. Рост колоний происходит на нагревательном столике с постоянной температурой поверхности 23°С.
Через 72 часа после посева на твердую среду следует производить подсчет колоний и вносить данные в протокол эксперимента.
Анализ результатов исследований.
Оцениваемой характеристикой данного метода биотестирования является количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в жидкой среде по окончании воздействия.
Показателем, выражающим оцениваемую характеристику, является число КОЕ в пробе на твердой среде.
Для оценки достоверности отличий следует применять непараметрический критерий Манна-Уитни [2].
Апробация метода. Для апробации метода провели экспериментальное исследование влияния ЭМИ ПЭВМ **** (1,5 ГГц) на ингибируемый ^метил^-(1-на-фтилметил)-3-фенил-2-пропен-1-амином рост дрожжей. Предварительные исследования позволили выявить рабочий диапазон концентраций ^метил^-(1-на-фтилметил)-3-фенил-2-пропен-1-амина -100-300 мкг/мл.
Результаты эксперимента представлены в табл. 1.
В результате проведенных исследований показаны достоверные отличия между контрольными и экспериментальными
Таблица 1
Влияние электромагнитного излучения ПЭВМ **** на ингибируемый рост дрожжевых колоний
выборками. Выявлено замедление (в 2,33 раза) роста колоний, подвергавшихся экспозиции ЭМИ ПЭВМ на фоне воздействия антифугального агента ^метил^-(1-нафтилметил)-3 -фенил-2-пропен-1 -амина. Выявленные отличия, по всей видимости, отражают влияние ЭМИ ПЭВМ на механизмы избирательной проницаемости клеточной мембраны.
Заключение. В соответствии с результатами апробации разработанный метод, представляющий собой использование ингибируемого роста дрожжевых колоний в качестве объекта биотестирования, обладает достаточной чувствительностью к нетепловому (ПЭМИ 0,001-0,01 Вт)
Описок литературы:
Рис. 1. Влияние электромагнитного излучения ПЭВМ **** на ингибируемый рост дрожжевых колоний
воздействию ЭМИ УВЧ диапазона, что достигается подбором качественных и количественных параметров воздействия стресс-агента. Такая чувствительность метода является его основной отличительной особенностью в ряду современных методов биотестирования и биоиндикации.
Практическая значимость метода заключается в возможности проведения относительно быстрого и недорогого биотестирования, позволяющего оценить степень электромагнитного загрязнения окружающей среды, в том числе, его нетепловые эффекты.
Дополнительно метод позволяет выявить воздействие электромагнитного излучения на механизмы избирательной проницаемости клеточной мембраны, что в свете исследований [9; 11; 15; 17; 21], показавших электромагнитную природу нарушения проницаемости мембраны нейронов в качестве причины ряда ней-родегенеративных заболеваний, является актуальным направлением перспективных исследований.
№ пробы Опыт Контроль
1 69 159
2 74 160
3 66 159
4 70 162
Число КОЕ 5 76 171
6 65 156
7 68 160
8 67 159
медиана 68,5 159,5
Критерий Манна-Уитни p < 0,05; отличия достоверны
[1] Василевский Н.Н. Экологическая физиология мозга. - Л.: Медицина, 1979. - 200 с.
[2] Вукулов Э.А. Основы статистического анализа. Практикум по статистическим методам и исследованию операций с использованием пакетов STATISTIKA и EXCEL. - М.: ФОРУМ: ИНФРА-М, 2004. -464 с.
[3] Григорьев Ю.Г., Григорьев О.А., Мендес Н., Григорьев К.А., Васин А.Л. Мобильная связь - реальный источник воздействия ЭМИ на население (телефоны и базовые станции) // Электромагнитные поля и население: сборник статей под общей ред. проф. Ю. Г. Григорьева и А.Л. Васина. - М.: изд-во РУДН, 2003. - С. 29-75.
[4] Лекарственные препараты в России: справочник. - М.: АстраФармСервис, 1998. - 1600 с.
[5] Носов В.Н., Мухачев Е.В., Габай И.А. Возможность экспресс-анализа воздействия абиотических факторов на биологические системы, основанная на использовании зародышей Danio rerio (Teleostei) // Материалы 3-й Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека», 2009. - С. 226-227.
[6] Остроумов А.А., Палатная С.А. Использование семян яровой пшеницы для мониторинга влияния сверхширокополосных импульсов электромагнитного излучения на биосферу // Труды МФТИ. Т.1. -2009, №2. - С. 92-97.
Опыт
Контроль
Среда обитания
Terra Humana
[7] Щеголева Т.Ю., Громозова Е.М., Войчук С.И., Брюзгинова Н.В., Масюк Б.Р., Красов П.С. Разработка тест-систем для изучения влияния электромагнитного излучения на биологические объекты // Радиофизика и электроника. Т. 13. - 2008, № 3. - C. 568-571.
[8] Ager D.D., Radu J.A. Effects of 60-Hz magnetic fields on ultraviolet light-induced mutation and mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae / Mutat. Res. V. 283. - 1992, № 4. - P. 279-286.
[9] Blasberg R.G. Problems of quantifying effects if microwave irradiation on the blood-brain barrier / Radio Sci. V. 14. - 1979, № 6. - P. 335-344.
[10] Botstein D., Fink G.R. Yeast: an experimental organism for modern biology // Science. - 1988, V. 240. -P. 1439-1443.
[11] Finnie J.W. Effect of long-term mobile communications microwave exposure of vascular permeability of mouse brain / Pathology. - 2002, V. 34. - P. 344-347.
[12] Goodman Е.М., Greenebaum B., Marron M.T. Effects of electromagnetic fields on molecules and cells / Int. Rev. Cytol. - 1995, V.158. - P. 279-338.
[13] Havas M. Biologycal effects of non-ionizing electromagnetic energy. А critical review of the reports by the US National Research Council and the US National institute of Environmental Health Sciences as they relate to the broad realm of EMF bioeffects / Environ. Rev. - 2000, V. 8. - P. 173-253.
[14] Hrenovich J., Stilinovich B., Dvorachek L. Use of prokariotic and eukaryotic biotests to assess toxicity of wastewater from pharmaceutical sources / Acta Chim. Slov. - 2005, V. 52. - P. 119-125.
[15] Justen D.R. Microwave irradiation and blood-brain barrier / Proc IEEE. - 1980, V. 68. - P. 60-67.
[16] Koch H.P. The yeast test: an alternative method for determination of acute toxicity of drugs and environmental chemicals / Pharmazie. V. 3. - 1992, № 1. - P. 55-60.
[17] Leszczinski D., Joenvaara S., Reivinen J., Kuokka R. Non-thermal activation of hsp27/p38MAPK stress pathway by mobile phone radiation in human endothelial cells: Molecular mechanism of cancer- and blood-brain barrier-related effects / Differentiation. - 2002, V. 70. - P. 49-57.
[18] Maureen M. Barr Super models / Physiologycal Genomics. - 2003, V. 13. - P. 15-24.
[19] Miyakoshi J., Koji Y., Wakasa T., Takebe H. Long-term exposure to a magnetic field (5 mT at 60 Hz) increases X-ray-induced mutations / J. Radiat. Res. (Tokyo). V. 40. - 1999, № 1. - P. 13-21.
[20] Sage C., Johansson O., Sage S.A. Personal digital assistant (PDA) cell phone units produce elevated extremely low frequency electromagnetic field emissions // Bioelectromagnetics. 2007. DOI 10/1002/bem.20315 интернет-публикация Wiley InterScience.
[21] Salford L.G. Nerve cell damage in mammalian brain after exposure to microwaves from GSM mobile phones / Environ Health Persp. - 2003, V. 111. - P. 881-883.
[22] Voichuk S.I., Gromozova E.N. Effect of radiofrequency of electromagnetic radiation on yeast sensivity to fungicide antibiotics / Mikrobiol Z. - 2004. - V. 66. № 4. - P. 69-77.
[23] Vrhovac I., Hrascan R., Franekic J. Effect of 905 MHz microwave radiation on colony growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae strains FF18733, FF1481 and D7 // Radiol Oncol. V. 44. - 2010. - № 2. - P. 131134.
