CC BY
106
Литература
1. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование / Под ред. О. П. Мелехова, Е. И. Са-рапульцева. 3-е изд. М.: Академия, 2010. 288 с.
2. Черемных Е. Г. Биотестирование, или биологическая оценка безопасности в настоящем и будущем // Экология и промышленность России 2003. № 10. С. 44—46.
3. Установка для прижизненной морфометрии регенириру-ющей планарии / В. Г. Вишневский, М. М. Махонина, Н. А. Демцун, Н. А. Темурьянц // Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского. Сер. «Биология, химия». 2007. Т. 20, № 4. С. 18-21.
4. Носов В. Н., Мухачев Е. В., Габай И. А. Возможность экспресс-анализа воздействия абиотических факторов на биологиче-
ские системы, основанная на использовании зародышей Danio rerio (Teleostei) // Материалы 3-й Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека». Ульяновск, 2009. С. 226-227.
5. Мухачев Е. В., Носов В. Н. Методы биотестирования электромагнитного излучения в зоне рабочего места пользователя персональных компьютеров // Актуальные вопросы экологии и природопользования: Сб. тр. / Отв. ред. Н. А. Черных. М., 2013. Вып. 15. С. 451-454.
6. Kamman U.,Vobach M., Wosniok W. Toxic effects of brominated indoles и phenols on Zebrafish embryos // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2006. Vol. 51. P. 97-102.
7. Kimmel C. B., Ballard W. W., Kimmel S. R. Stages of embryonic development of the zebrafish // Developmental Dynamics. 1995. Vol. 203. P. 253-310.
УДК 612
С. П. Кропотов, канд. мед. наук, заместитель начальника Центра, А. Ю. Токарев, научный сотрудник, А. В. Вьюшина, канд. биол. наук, научный сотрудник, А. С. Головина, научный сотрудник,
ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт прикладных проблем» (ГосНИИПП), Санкт-Петербург
А. В. Притворова, младший научный сотрудник,
ФГБУН «Институт физиологии им. И. П. Павлова» РАН, Санкт-Петербург
Е. Б. Филиппова, канд. биол. наук, старший преподаватель,
ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова», Санкт-Петребург
Определение гипоксической устойчивости человека по спектрофотометрическим показателям окислительного стресса
Ключевые слова: спектрофотометрия, гипоксия, окислительная модификация белков, восстановленные тиолы. Keywords: spectrophotometry, hypoxia, oxidizing modification of proteins, reduced thiols.
Спектрофотометрическое исследование показателей окислительного стресса позволяет спрогнозировать гипоксическую резистентность. Исследованы окислительная модификация белков как индикатор окислительного стресса и уровень восстановленных тиолов как показатель антиоксидантной системы.
Введение
Одним из методов определения устойчивости к гипоксической нормобарической гипоксии является выполнение гипоксической пробы с контролем
сатурации крови, пульса, электрокардиограммы и оценкой самочувствия обследуемого [1]. Гипоксиче-ская проба проводится под контролем врача, имеющего соответствующую квалификацию, и требует наличия комплекса определенного оборудования. Несмотря на широкое использование гипоксической пробы, методика недостаточно формализована, а при ее проведении возникает риск развития вегетативных и неврологических нарушений вплоть до полной потери сознания.
В то же время известно, что любое гипоксиче-ское состояние аэробных организмов приводит к развитию окислительного стресса [2], пусковым механизмом которого является генетически детерминированное повышение уровня активных форм кис-
лорода [3]. Окислительный стресс в здоровом организме служит одним из центральных механизмов общей системы адаптации к экстремальным условиям, обычно развивается вследствие активации митохондриального дыхательного цикла и выражается в усилении функционирования антиокси-дантной и прооксидантной систем, поддерживая их баланс на более высоком уровне [4]. Исходя из этого можно предположить, что показатели метаболических изменений при окислительном стрессе могут явиться критериями гипоксической устойчивости. К числу таких показателей относят степень окислительной модификаций белков (ОМБ), отражающую интенсивность прооксидантных процессов [5, 6], и уровень восстановленных тиолов (ВТ), характеризующий активность антиоксидантной системы [7]. Особый интерес данные показатели представляют также и потому, что для их оценки достаточно иметь минимальный недорогой набор лабораторного оборудования и реактивов.
Материалы и методы
Для верификации высказанного выше предположения исследовали степень ОМБ и уровень ВТ у 25 молодых мужчин в возрасте от 18 до 20 лет, ведущих сходный здоровый образ жизни. По результатам гипоксической пробы обследуемые на основе традиционных критериев были разделены на две группы: устойчивых (п = 11) и неустойчивых (п = 14) к гипоксии.
Для определения показателей ОМБ и ВТ использовали двухлучевой спектофотометр Shimadzu иУ-1800 с возможностью фотометрии в ультрафиолетовой (стабильный монохромный дейтериевый источник световых волн в диапазоне 180—340 нм), видимой и низкоинфракрасной (галогеновый йодидный источник световых волн в диапазоне 340—1100 нм) областях спектра.
Продукты ОМБ определяли в сыворотке крови спектрофотометрически по методу Ъеуте et а1. в модификации Е. Е. Дубининой с соавторами [8]. Результаты выражали в условных единицах (у. е.) в расчете на 1 мг белка. Предварительно с препаратов сыворотки крови были сняты спектры в ультрафиолетовом и видимом диапазонах длин волн, где выявлены пики максимальной оптической плотности, наблюдаемые в области 270 и 363 нм, что соответствует данным других авторов [8]. Эти длины волн соответствуют максимумам поглощения карбонильных производных белков с разными аминокислотными остатками, образовавшихся на стадии инициации свободнорадикального окисления (270 нм) и его элонгации (363 нм) соответственно [9]. Содержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом.
При определении ОМБ использовали два показателя: спонтанную ОМБ и ОМБ, индуцированную
реактивом Фентона (смесь ионов двухвалентного железа и перекиси водорода, генерирующая ОН -радикалы). Спонтанная ОМБ является показателем, характеризующим базальный уровень окисленных белков, присутствующих в 1 мг белка сыворотки крови. Индуцированное окисление рассматривается как показатель наличия субстрата для свободно-радикальных процессов и в целом как показатель способности системы к переокислению [10].
Показатели антиоксидантной системы оценивали по уровню ВТ методом Эллмана в модификации В. В. Соколовского [11]. Принцип метода основан на способности низкомолекулярных тиоловых соединений взаимодействовать с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой, при этом продукты реакции имеют максимум поглощения в области 412 нм. Результаты вычисляли с использованием коэффициента молярной экстинкции, равного в условиях метода 13 600 моль/(г • см), и выражали в мкМ/мл сыворотки крови.
При проведении гипоксической пробы использовали пульсоксиметр «Элокс-01» с пальцевым датчиком. Измерение сатурации крови методом пульсо-ксиметрии основано на различии спектральных характеристик насыщенного и ненасыщенного кислородом гемоглобина. Определение относительной амплитуды пульсовой волны на двух длинах волн позволяет вычислить значение сатурации в диапазоне 50—99 %. Гипоксию вызывали вдыханием на протяжении 15 мин гипоксической газовой смеси с 10%-ным содержанием кислорода (ГГС-10). Для ее создания применяли гипоксикатор «Эверест», обеспечивающий минутный поток гипоксической смеси от 30 до 47 л/мин с возможностью плавной регулировки концентрации кислорода от 10 до 16 %. Содержание кислорода в газовой смеси контролировали с помощью газоанализатора «ПКГ-4-К».
Первоначально на 5—6-й минуте практически у всех испытуемых наблюдалось снижение сатурации крови до 85—90 %. В дальнейшем у устойчивых к гипоксии лиц уровень сатурации оставался стабильным и колебался около 90 %, а у неустойчивых продолжал снижаться и к концу экспозиции составлял около 75 % [12].
Результаты и обсуждение
Показатели ОМБ у устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых до и после проведения ги-поксической пробы представлены в табл. 1.
Как видно из представленной таблицы, в состоянии физиологического покоя показатели спонтанной ОМБ, определяемые методом спектрофотометрии как при 270, так и при 363 нм, значимо различаются у обследуемых, разделенных по традиционным критериям на устойчивых и неустойчивых к гипоксии. Уровни же продуктов индуцированной ОМБ у устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых
биотехносфера
| № 1-2(31-323/2014
ОМБ Я, нм Условия исследования Устойчивые Неустойчивые
Спонтанная 270 До гипоксической пробы 0,053 ± 0,010 0,019 ± 0,005#
После гипоксической пробы 0,025 ± 0,007* 0,013 ± 0,003
363 До гипоксической пробы 0,037 ± 0,008 0,018 ± 0,003#
После гипоксической пробы 0,014 ± 0,002* 0,024 ± 0,004#
Индуцированная 270 До гипоксической пробы 0,120 ± 0,012 0,125 ± 0,010
После гипоксической пробы 0,108 ± 0,017 0,169 ± 0,017*#
363 До гипоксической пробы 0,187 ± 0,019 0,149 ± 0,013
После гипоксической пробы 0,188 ± 0,019 0,158 ± 0,022
Таблица 1
Содержание продуктов ОМБ до и после проведения гипоксической пробы в сыворотке крови устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых, у. е./мг белка (М ± т)
П р и м е ч а н и е. Знаком * обозначены достоверные (р < 0,05) изменения показателей в одной группе под воздействием гипоксии, знаком # — достоверные (р < 0,05) различия между группами устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых. Достоверность различий между группами определена по критериям Манна—Уитни и Вилкоксона.
в состоянии физиологического покоя достоверно не различались.
Показатели ВТ у устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых до и после проведения ги-поксической пробы представлены в табл. 2.
Как видно из представленных данных, значения показателя ВТ в группах устойчивых и неустойчивых к гипоксии лиц в состоянии физиологического покоя также достоверно различны. Таким образом, в качестве маркеров устойчивости к гипоксии можно использовать как показатели спонтанной ОМБ, определяемые спектрофотометрически при 270 нм и более четко дифференцирующие обследуемые группы, так и показатели спонтанной ОМБ (при 363 нм) и ВТ (при 412 нм), не требующие для своего определения сложного спектрофотометрического оборудования.
Определенный интерес также представляют результаты, характеризующие активность про- и анти-
оксидантных систем у обследуемых лиц после проведения гипоксической пробы. Данные, приведенные в табл. 1 и 2, показывают, что у устойчивых к гипоксии гипоксическая проба вызывает активацию антиоксидантной системы, в то время как у неустойчивых этого не происходит. Также следует отметить, что в группе неустойчивых к гипоксии отмечается увеличение показателя индуцированной ОМБ (при 270 нм) после гипоксической пробы. Это может свидетельствовать о разных генетических механизмах срочной адаптации к гипоксии в обследуемых группах, имеющих различный адаптационный потенциал. Подтверждением этого являются и результаты оценки влияния курса интервальных гипоксических тренировок (ИГТ) на устойчивость к гипоксии.
Курс ИГТ состоял из 20 тренировок, в ходе которых обследуемые дышали ГГС-10 по 5 мин с 5-минутным нормоксическим интервалом в течение 1 ч. После данного курса переносимость гипоксиче-ской пробы, определенная по традиционным критериям, в группе неустойчивых возросла и при-
Таблица 2 Показатели ВТ до и после проведения гипоксической пробы в сыворотке крови устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых, мкМ/мл сыворотки крови (М ± т)
Группа До гипоксической пробы После гипоксиче-ской пробы
Неустойчивые 0,573 ± 0,021 0,564 ± 0,024
Устойчивые 0,473 ± 0,008# 0,562 ± 0,025*
П р и м е ч а н и е. Знаком * обозначены достоверные (р < 0,05) изменения показателей в одной группе под воздействием гипоксии, знаком # — достоверные (р < 0,05) различия между группами устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых. Достоверность различий между группами определена по критериям Манна—Уитни и Вилкоксона.
Таблица 3 Содержание восстановленных тиолов в сыворотке крови у обследуемых после курса ИГТ, мкМ/мл сыворотки крови (М ± т)
Группа До гипоксической пробы После гипоксиче-ской пробы
Неустойчивые 0,508 ± 0,028 0,516 ± 0,020
Устойчивые 0,474 ± 0,043 0,566 ± 0,025*#
П р и м е ч а н и е. Знаком * обозначены достоверные (р < 0,05) изменения показателей в одной группе под воздействием гипоксии, знаком # — достоверные (р < 0,05) различия между группами устойчивых и неустойчивых к гипоксии обследуемых. Достоверность различий между группами определена по критериям Манна—Уитни и Вилкоксона.
близилась к уровню устойчивых к гипоксии лиц. Спектрофотометрические показатели уровня ВТ после курса ИГТ (табл. 3) у неустойчивых к гипоксии обследуемых также приблизились к показателям устойчивых, но не возрастали в ответ на гипоксическую пробу.
Таким образом, исследования подтвердили наше предположение о возможности использования спектрофотометрических методов для скринингово-го предварительного выявления лиц, устойчивых и неустойчивых к гипоксии. Данный подход является весьма актуальным для прогноза возможности развития гипоксического состояния как у здоровых лиц в ходе специфической профессиональной деятельности, так и у пациентов при определенных заболеваниях.
Полученные данные также подтверждают наличие генетической гетерогенности популяции по устойчивости к гипоксии, выраженной в биохимических механизмах срочной адаптации.
Литература
1.
Колчинская А. З., Цыганова Т. Н., Остапенко Л. А. Нор-мобарическая интервальная гипоксическая тренировка в медицине и спорте. М.: Медицина, 2003. 407 с.
2. Перекисное окисление и стресс / В. А. Барабой, И. И. Брех-ман, В. Г. Голотин, Ю. Б. Кудряшов. СПб.: Наука, 1992. 148 с.
3. Handy D. E., Loscalzo J. Redox Regulation of Mitochondrial Function // Antioxidats & Redox Signaling. 2012. Vol. 16. N 11. P. 1324-1367.
4. Imnoff B. R., Hansen J. M. Extracellular redox status regulates Nrf 2 activation through mitochondrial reactive oxygen species // J. Biochem. 2009. Vol. 424. P. 491-500.
5. Cell Signaling by Protein Carbonylation and Decarbonyla-tion /Wong Chi Ming, L. Marcocci, Liu Lingling, Yuichiro, Suzuki J. // Antioxidats & Redox Signaling. 2010. Vol. 12. N 3. P. 393-404.
6. Chevion M., Berenshtein E., Stadman E. R. Human studies related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage // Free Radical research. 2000. N 33. P. 99-108.
7. Oxidized Forms of Glutathione in Peripheral Blood as Bio-markers of Oxidative Stress / R. Rossi, I. Dalle-Donne, A. Mil-zani, D. Giustarini // Clinical Chemistry. 2006. Vol. 52. N 7. P. 1406-1414.
8. Окислительная модификация белков в плазме крови у больных с сосудистой деменцией / Е. Е. Дубинина, С. В. Ков-ругина, П. В. Коновалов [и др.] // Укр. биохим. журнал. 2001. Т. 53. № 1. С. 125-132.
9. Назаров И. Н., Казицина Л. А., Зарецкая И. И. Исследование спектров поглощения 2,4-динитрофенилгидразонов карбонильных соединений // Журн. общ. химии. 1956. Т. 27 (89). № 3. С. 606-623.
10. Кузьменко Д. И., Лаптев Б. И. Оценка резервов липидов сыворотки крови для перекисного окисления в динамике окислительного стресса у крыс // Вопр. мед. химии. 1999. Т. 45. № 1. С. 47-54.
11. Спектрофотометрическое определение тиолов в сыворотке крови / В. В. Соколовский, В. С. Кузьмина, Г. А. Москады-нова, Н. Н. Петрова // Клин. лаб. диагностика. 1997. № 11. С. 20-21.
12. Характеристика индивидуальных различий функционального состояния человека в условиях гипоксической гипоксии / В. О. Самойлов, В. Н. Голубев, А. Л. Максимов [и др.] // Вестн. Рос. воен.-мед. академии. 2013. № 3 (43). С. 111-113.
(г \
Как оформить подписку?
• В любом отделении связи по каталогам «Роспечать» (по России) — индекс № 45886, через агентства «Урал-Пресс», «Гал», «Интер-почта 2003», «Информнаука».
• Через редакцию (с любого номера текущего года), отправив по факсу (812) 312-57-68 или электронной почте bts@polytechnics.ru заполненный запрос счета на подписку
Запрос счета для редакционной подписки на журнал «Биотехносфера»
Полное название организации_
Юридический адрес_
Банковские реквизиты. Адрес доставки_
Срок подписки_Кол-во экз..
Тел._Факс_e-mail_
Ф.И.О. исполнителя_
Стоимость одного номера журнала при подписке через редакцию — 550 руб. с добавлением стоимости доставки (простой бандеролью). К каждому номеру журнала будут приложены накладная и счет-фактура. Журнал выходит 6 раз в год. Отдельные номера можно заказать с получением наложенным платежом.
Информация о журнале — www.polytechnics.ru.
Журнал «Биотехносфера» распространяется только по подписке в России и странах СНГ.
^ Л
биотехносфера
I № 1-2(31-323/2014
