CC BY
23
УДК 576.08
Е. В. Мухачев, К. А. Михайлова, И. А. Габай, Д. П. Канайкин
Методы флюоресцентной иммуноцитохимии и конфокальной микроскопии в решении задач экологического контроля факторов окружающей среды
Ключевые слова: флюоресцентная иммуноцитохимия, конфокальная микроскопия, биотестирование. Keywords: fluorescence immunocytochemistry, confocal microscopy, biotesting.
Произведено иммуноцитохимическое маркирование белков тубулинов и ДНК глубинных клеток бластодермы ранних зародышей Danio ^гю (Teleostei) флюоресцентными агентами gfp и DAPI. Конфокальное исследование образцов с применением пакета программ анализа морфологической структуры показало эффективность данного подхода для точного определения пролиферативного пула клеточных популяций, используемого в качестве тест-реакции биотестирования.
Введение
Одной из наиболее информативных и интегральных тест-реакций методов биотестирования является пролиферативный индекс клеточных популяций [2]. Этот параметр служит мерой пролиферативной активности популяции клеток, для которых, как правило, характерна асинхронная композиция клеточного размножения.
Определение зависимости пролиферативного пула клеток в культуре, ткани или в организме от действия тех либо иных факторов окружающей среды (качества воды, электромагнитного излучения, вибрации и т. п.) является методом биотестирования, соответствующим критерию экологического реализма [2].
Для эффективной реализации подобного подхода к биотестированию следует использовать экспериментальные модели с высокой пролиферативной активностью в нормальных условиях и неспецифичной чувствительностью к факторам окружающей среды различной природы (как абиотическим, так и биотическим). Таким требованиям отвечают эм-
бриональные стадии развития в асинхронной фазе, которые также удобны для экстраполяции полученных результатов, так как характеризуются плюри-потентностью клеточного материала и гомологией на тканевом и физиологическом уровнях с организмами млекопитающих и человека. Повышенная чувствительность эмбрионального материала к факторам окружающей среды объясняется тем, что большая часть механизмов адаптации еще не сформированы или не запущены для выбранных стадий онтогенеза.
Одной из наиболее разработанных эмбриональных тест-систем являются зародыши и предличин-ки костистых рыб Башо гегю [4—6], обладающих высокой скоростью развития, прозрачностью и проницаемостью оболочек, бластодермы и тканей. На базе этой модели показана чувствительность клеточной репродукции к электромагнитным излучениям нетепловой интенсивности [2].
Классический подход в измерении пролифера-тивного пула клеток состоит в подсчете митотиче-ских фигур (веретен деления с конденсированным хроматином и интерфазных ядер) на серийных гистологических срезах [3]. Основными и значимыми недостатками этой процедуры являются ее высокая трудоемкость и низкая точность, связанная с недостаточной контрастностью веретен деления на гистологических препаратах с рутинной окраской и вероятностью их повторного подсчета на сериях срезов.
Современной альтернативой классической гистологической технике считается иммуноцитохи-мическое маркирование элементов цитоскелета (микротрубочек) и ядерного аппарата клетки (ДНК-богатые районы) флюоресцентными агентами с последующим конфокальным и машинным анализом изображния.
№ 2(38)/2015 |
биотехносфера
Материалы и методы исследования
В качестве модельной системы исследования использовали зародыши Danio rerio на стадии 75%-ной эпиболии. Выбор стадии обусловлен уже наступившей полной десинхронизацией клеточной репродукции, с одной стороны и сохранением высокой скорости прохождения клеточного цикла — с другой.
В качестве клеточных структур, по соотношению которых определяются ключевые стадии клеточного цикла, выбраны белки тубулины, формирующие микротрубочки веретена деления, и ДНК хроматина.
Тотальную окраску производили методом им-муноцитохимии [1] с использованием маркерных флюоресцентных агентов gfp (зеленый флюоресцентный белок) для тубулинов и DAPI для ДНК-богатых участков клетки.
Для микроскопического исследования препаратов использовали конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 c глубиной фокуса 30 мкм.
Количественный анализ полученных изображений производили с использованием программного пакета «Видеотест-мастер (морфология)».
Для проведения сравнительной оценки эффективности предложенного способа производили количественный подсчет интерфазных ядер и веретен деления на серийных гистологических срезах (окраска эозин-гематоксилин по Манну) толщиной 6 мкм и анализ каждого третьего среза в серии по порядку (для предотвращения повторного учета структур, посчитанных ранее в текущей серии срезов).
Результаты исследования
В результате проведения процедур иммуноцито-химического маркирования заданных клеточных структур флюоресцентными агентами gfp и DAPI и микроскопического анализа полученных препаратов были получены изображения, отображающие наличие и взаимное расположение ДНК-богатых элементов (интерфазные ядра и конденсированный митотический хроматин) и тубулиновых микротрубочек (рис. см. обложку).
С применением пакета программ морфологического анализа подсчитывали количество интер-
фазных ядер (синие псевдосферические объекты) и митотических картин (конденсированный синий хроматин в комплексе с зелеными веретенами деления).
В результате анализа 100 000 клеток как классическими гистологическими методами с подсчетом человеком-оператором, так и с применением описываемой процедуры флюоресцентного имму-ноцитохимического маркирования и программного анализа показано ускорение анализа в 20 раз (138 и 7 ч соответственно).
Заключение
Таким образом, в результате сравнительного анализа эффективности двух подходов для оценки пролиферативного пула популяции эмбрионов Danio rerio при проведении биотестирования показано, что при схожих временных затратах на изготовление препарата тотальное окрашивание зародыша флюоресцентными агентами методом иммуноцитохимии и последующий программный анализ материала эффективнее до 20 раз (по затраченному времени) по сравнению с технологией изготовления гистологических срезов с последующей рутинной окраской.
Литература
1. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. Дж. О' Д. Макги, С. Херрингтона. М.: Мир, 1999. 560 с.
2. Мухачев Е. В., Носов В. Н. Методы биотестирования электромагнитного излучения в зоне рабочего места пользователя персональных компьютеров // Актуал. вопр. экологии и природопользования: сб. тр. Вып. 15 / Отв. ред. Н. А. Черных. М., 2013. С. 451-454.
3. Роскин Г. И. Микроскопическая техника. М.: Сов. наука, 1959. 469 с.
4. Sun L. W., Qu M. M., Li W. Q. Toxic effects of aminophenols on aquatic life using the zebrafish embryo test and the comet essay // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2004. Vol. 73. P. 628-634.
5. Ma C., Parng C., Seng W. L. Zebrafish — an in vivo model for drug screening / / Innovations in Pharmatheutical Technology. 2006. Vol. 14. P. 38-45.
6. Kamman U., Vobach M., Wosniok W. Toxic effects of brominated indoles and phenols on Zebrafish embryos // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2006. Vol. 51. P. 97-102.
биотехносфера
I № 2(38)/2015
Иллюстрация к статье
Е. В. Мухачев, К. А. Михайлова, И. А. Габай. Методы флюоресцентной иммуноцитохимии и конфокальной микроскопии в решении задач экологического контроля факторов окружающей среды (см. с. 8-9)
-VI
* . ■ л
ГЖ 1 *
^ пни
5епе5002_Рго;|002
Участок бластодермы зародыша Оапю гепо на стадии 75%-ной эпиболии. Иммуноцитохимическая окраска тубули-нов и ДНК-богатых участков флюорохромами gfp (зеленый) и 0АР1 (красный). Конфокальная микроскопия. Красными рамками отмечены митотозы
