CC BY
45
АТФазная АКТИВНОСТЬ В МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФРАКЦИЯХ ТКАНЕЙ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В НОРМЕ И ПРИ ВВЕДЕНИИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА
А.Б. Ревина, Г.Ф. Рыжкова, О.В. Солдатенкова
Аннотация Приводятся результаты исследований АТФазной активности в тканях митохондриальных субклеточных фракций здоровых 10-17-суточных куриных эмбрионов и зараженных вирусом болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота. Показано, что в обеих группах в митохондриях головного мозга и печени активность транспортных ферментных систем за весь инкубационный период значительно выше, чем в мышечной ткани и в желудке. У зараженных эмбрионов по сравнению с незараженными активность АТФазы во всех исследуемых тканях достоверно снижается.
Ключевые слова: АТФазная активность, Mg2+, К+, Na - АТФаза, транспортная ферментная система, куриные эмбрионы, эмбриогенез, митохондрии, субклеточные структуры, инкубация, инкубационный период, вирус болезни Ньюкасла.
Деятельность клетки, целостность и эффективность процессов клеточного метаболизма тесно связаны с трансмембранным ионообменом.
Благодаря наличию биомембран обеспечивается избирательное накопление в клетках отдельных компонентов из окружающей среды, и по обе стороны мембраны устанавливаются необходимые градиенты концентраций.
С неравномерным распределением электролитов между клетками и их внеклеточной средой связаны генерация биотоков, транспорт аминокислот, сахаров и органических кислот через плазматические мембраны.
Указанные процессы осуществляются с помощью специальных механизмов, для функционирования которых затрачивается энергия АТФ (Сперанская Н.В., Титов В.Н., 1981).
Все виды ионного транспорта через клеточные мембраны подразделяются на четыре группы: пассивная диффузия, облегченная диффузия, первичноактивный транспорт, вторично-активный транспорт.
Активный транспорт ионов является примером первичного активного транспорта; он осуществляется специальными ионными насосами, интегральными компонентами которых являются транспортные АТФазы, встроенные в плазматическую мембрану (Бурков И. А., 1970; Forgae М., Chm G., 1981; Teller G.K., 1981). Они представляют собой созданные природой энергетические машины, превращающие химическую энергию в осмотическую и электрическую.
Транспортные АТФазы классифицируются по переносимым ими ионам: К+,Ыа+-АТФаза, Са2+-АТФаза, Mg2+-AT®a3a, анионная (НС03')-АТФаза, К+,Н+-АТФаза (Кометиани З.П., Векуа М.Г., 1988).
АТФазы - ферментные системы отличающиеся лабильностью, чутко реагирующие на изменения внутренней и внешней среды. На их активность оказывают
влияние ряд факторов: pH среды, температура, изменение осмотического давления в организме, лазерное излучение, радиация, возраст и физиологическое состояние животных, применение различных химических препаратов.
Известно, что основные окислительные процессы и аккумуляция энергии сосредоточены в митохондриях (Kennedy Е., Leningeer А., 1948).
Многочисленными исследованиями было доказано, что ферменты, катализирующие процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования, локализованы в мембранах митохондрий в виде митохондриальных субъединиц и ансамблей (Монахов Н.К., 1964; Daleke D.L., 2003). Митохондрии обеспечивают интеграцию многочисленных процессов клеточного обмена (Ленинджер А. А., 1966).
Встречаются одиночные работы (Глезер И.И.,1964), посвященные изучению морфогенеза, ультраструктуры и функциональных особенностей митохондрий тканей в ходе эмбрионального и онтогенетического развития животных и птицы.
В последнее время достаточно остро стоит вопрос эффективного использования эмбрионами питательных веществ, хотя до настоящего времени он не получил должного распространения и находится на стадии изучения (Аристархова Э. А., 1992).
Своеобразие обмена веществ куриного эмбриона связано с условиями развития зародыша, изолированного от внешней среды плотными оболочками яйца.
На сегодняшний день представляет определенный интерес изучение клеточной проницаемости и ионного транспорта электролитов в митохондриальных фракциях тканей как здоровых куриных эмбрионов, так и зараженных вирусом болезни Ньюкасла.
Болезнь Ньюкасла - это одно из наиболее опасных вирусных заболеваний, наносящих огромный ущерб птицеводству и характеризующееся развитием пневмонии, энцефалитом и поражениями внутренних органов. Несмотря на то, что природа этого заболевания была выяснена сравнительно давно, многие вопросы, связанные с ее ликвидацией, требуют дальнейшего изучения.
Целью наших исследований явилось изучение активности Mg2+, Na+, К+ -АТФазы в митохондриальных фракциях мышц, печени, желудка и головного мозга 10-17-суточных куриных эмбрионов как здоровых, так и зараженных вирусом болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота.
Экспериментальную часть работы проводили в лаборатории кафедры биологической и органической химии КГСХА им. проф. И.И.Иванова и в отделе эмбриональных вакцин производства №1 ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК».
Объектом исследований были 10-17-суточные куриные эмбрионы (п=100). Яйца инкубировали в инку-
баторе «Универсал-55» по режиму и технологии, принятым на производстве с учетом инструкции по инкубации яиц сельскохозяйственной птицы (при 1=37,5±0,5 °С; влажности 50-54 %).
Заражали 9-ти суточных куриных эмбрионов в аллантоисную полость вирусом болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота.
Материалом для исследований являлись: мышечная ткань, печень, желудок, головной мозг куриных эмбрионов. Фрагменты исследуемых органов отбирали непосредственно после окончания инкубирования. Митохондриальную субклеточную фракцию тканей получали методом дифференциального центрифугирования.
Активность АТФаз в митохондриальных субклеточных фракциях исследуемых тканей определяли в средах, рекомендованных в работе Иващенко А.Т., Бушневой И. А. (1981). При этом активность фермента рассчитывали по приросту неорганического фосфата (РГ) и выражали в нмоль Р1/мг белка/мин.
Полученные в ходе выполнения работы данные подвергались биометрической обработке на ПЭВМ с использованием прикладных программ.
Анализ результатов исследований активности изучаемой ферментной системы в митохондриях тканей 10-17 суточных куриных эмбрионов (рис.1) показал, что наибольшая активность М§2+,К+,>Та+- АТФазы в обеих исследуемых группах отмечается в головном мозге; средний показатель за весь период инкубации у здоровых эмбрионов составил 13,13 ±0,33, у зараженных -11,13±0,11 нМоль Р1/мг белка в мин.
Немного ниже этот показатель в печени и соответственно составляет 9,57 ±0,21 и 8,91 ±0,24 нМоль Р1/мг белка в мин.
В мышцах и желудке отмечены более низкие значения активности фермента - соответственно 5,27 ±0,09 и 4,77 ±0,26 нМоль Р1/мг белка в мин и 4,24 ±0,31 и 3,28 ±0,17 нМоль Р1/мг белка в мин.
Это можно объяснить тем, что различные органы у эмбрионов закладываются в разное время и имеют неодинаковую скорость роста.
Уже ко вторым суткам инкубации куриного эмбриона передний отдел нервной трубки представляет собой зачаток головного мозга. Эмбриональный мозг разделяется перетяжками на передний, средний и задний мозговые пузыри. Передний мозг образует боковые выпячивания - зачатки глазных пузырей. Задний мозговой пузырь без резкой границы переходит в спинной мозг.
1 мышеченая ткань 1 печень
□ желудок
□ головной мозг
Незараженные (1) и зараженные (2) куриные эмбрионы
Рисунок 1 - Активность ЪА% +Д+Д\Га+- АТФазы ми-тохондрий тканей 10-17 суточных куриных эмбрионов
Ткани печени принадлежит весьма важное место в обменных процессах в эмбриогенезе. Печень появляется на третьи сутки инкубации в виде двух выростов закладки печеночных протоков, к концу пятых суток
печень представляет собой уже крупный орган. На 10-е сутки инкубации печень эмбриона оказывается самым крупным органом брюшной полости.
Таблица 1 - Активность Mg2+,K+,Na+- АТФазы митохондрий тканей 10-17 суточных куриных эмбрионов
Вид ткани Активность транспортной М§2+,К+,№+ - АТФазы (нМ Рь'мг белка/мин)
Незараженные куриные эмбрионы Зараженные куриные эмбрионы
Мышцы 5,27±0,09 4,77±0,26*
Печень 9,57±0,21 8,91±0,24*
Желудок 4,24±0,31 3,28±0,17*
Головной мозг 13,13±0,33 11,13±0,11*
(* р<0,05)
С 13-х по 19-е сутки инкубации в обменных процессах начинают принимать участие системы органов желудочно-кишечного тракта, что сопровождается интенсивным развитием пищеварительных желез. Однако железистый отдел желудка начинает функционировать не ранее 19-х суток инкубации, после втягивания желточного мешка в брюшную полость.
Махинько В.В. (1966) установил, что позднее закладывающиеся органы растут быстрее тех, которые образовались раньше. Так, мышцы и сердце (органы, обладающие высокой скоростью роста) характеризуются более низким уровнем тканевого дыхания, чем печень и мозг (органы с меньшими темпами роста), и поэтому в мышцах отмечается более низкая АТФазная активность, что свидетельствует о снижении энергетического обмена.
Сопоставив активность Mg2+,K+,Na+- АТФазы в митохондриях исследуемых тканей незараженных и зараженных куриных эмбрионов в среднем за весь инкубационный период (таблица 1), можно наблюдать, что после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота, происходит достоверное ее снижение во всех тканях: в головном мозге - на 15,23%, печени - на
6,90%, мышцах - на 9,49%, желудке - на 22,64%.
Можно предположить, что вирус оказывает некоторое подавляющее действие на АТФазную активность, ингибируя аналогично другим токсинам сульфгидриль-ные группы (- ЭН), входящие в активный центр фермента, и тем самым блокирует поступление питательных веществ в митохондрии куриных эмбрионов, что отрицательно сказывается на их развитии.
Внедрение вакцины приводит к метаболическому стрессу, когда нарушается обмен веществ в эмбрионе, что вызывает сбой всех биологических систем, нередко даже гибель живого организма.
Результаты исследований указывают на то, что своевременная борьба с вирусными инфекциями позволит усилить сопротивляемость эмбрионов к неблагоприятным факторам, снизить смертность, особенно в критические периоды, тем самым способствовать вы-лупливанию здорового и жизнеспособного молодняка.
Список использованных источников
1 Аристархова, Э.А. Использование питательных веществ яиц эмбрионами и постэмбриональный рост кур: авто-реф. дис.. канд. биол. наук/ Э.А. Аристархова. - Сергиев-Посад, 1992.
2 Бурков, И.А. Структурные основы функционирования транспортных систем. - В кн.: Новые методы и модификация в биохимических исследованиях в животноводстве/ И.А. Бурков, А.Ф. Киселев. - М.: Колос, 1970. - С. 174-182.
3 Глезер, И.И. Электронномикроскопическое исследование изменения структуры клеток головного мозга белой
крысы в онтогенезе / И.И. Глезер // Цитология,- 1964. - Т.6. -№3.-С.305-311.
4 Ивагценко, А. Т. Выделение и свойства аниончувст-вительной АТФазы из мембран эритроцитов / А.Т. Иващенко, И.А. Бушнева // Биохимия. - 1981. - Т.46. - Вып. 3. - С.486-488.
5 Кометиани, З.П. Кинетика мембранных транспортных ферментов/ З.П. Кометиани, М.Г. Векуа. - М.: «Высшая школа», 1988. - 110 с.
6 Ленинджер, А.А. Митохондрия/ А.А. Ленинджер. -М.: Изд-во «Мир», 1966. - 315 с.
7 Махинько, В.В. Биохимия и энергетика эмбрионального развития сельскохозяйственных птиц / В.В. Махинько // В кн. : Ведущие проблемы возрастной физиологии и биохимии. - М.: Медицина, 1966. - С.294-312.
8 Симонян, А.А. Некоторые стороны энергетического обмена в онтогенезе/ А.А. Симонян. - Ереван: Изд-во АН АрмССР, 1970.-281 с.
9 Сперанская, H.B. Количественная оценка проницаемости мембран эритроцитов для одновалентных катионов / H.B. Сперанская, B.H. Титов // Лабораторное дело. - 1981. -№10.-С.592-595.
10 Daleke D.L. Regulasion of transbilayer plasma membrane phospholipids asymmetry. J.Lipid Res. 2003.44, 2849 -?8*ï7
11 Forgae M., Chin G. K+-independent active transport of Na+ by the (Na+ and K+) - stimulated adenosine triphosphatase it Biol. Chem. - 1981.V.256. - №8. - P.3645-3646.
12 Kennedy E., Leningeer A., Intracellular structure and the fatty acid oxidase of rat liver // Journal Biol. Chem., - 1948. -V. 172. -P.847-848.
13 Teller G.K. Enzymatyczne podstawy dzialania pompy sodowey// Post. Boil. Komorki. - 1981. - 8. - №4. - P.367-382.
Информация об авторах
Ревина Анна Борисовна, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. 8-906-689-60-46, E-mail: Ann-
vurovchLk@vandex.ru.
Рыжкова Галина Федоровна, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой физиологии и химии ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. (4712) 53-14-04, E-mail: uciidoim a ku-.lni.ru.
Солдатенкова Ольга Валерьевна, государственный инспектор отдела государственного ветеринарного надзора Управления Россельхознадзора по Орловской и Курской областям, тел.8-903-873-27-83, E-mail: Soldatenkova
Olga@rarnbler.ru.
