CC BY
85
УДК 577.1:636.5
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АТФАЗ ЭРИТРОЦИТОВ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ
Мосягин В. В. к. б. н., доцент
Курский институт социального образования (филиал) РГСУ, Курск, Россия
В статье рассматриваются особенности функционирования АТФаз эритроцитов цыплят-бройлеров. Предложен метод выделения цитоплазматических мембран и ядер эритроцитов цыплят-бройлеров. Представлены данные о влиянии ионов Ка+ и К+ на активность общей АТФазы эритроцитов и АТФаз, локализованных в цитоплазматической и ядерной мембранах.
Ключевые слова: АТФАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ, КЛ/К-АТФАЗА, ЭРИТРОЦИТЫ, ЦЫПЛЯТА-БРОЙЛЕРЫ, ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА, ЯДРА.
UDC 577.1:636.5
PECULIARITIES OF ERYTHROCYTE ATPASE FUNCTIONING OF CHICKEN-BROILERS
Mosyagin V.V.
Cand. Biol. Sci., assistant professor
Kursk institute of social education (branch) RGSU, Kursk, Russia
Peculiarities of functioning of ATPase of erythrocyte of chicken-broilers are considered in the article. Method of discharge of cytoplasmic membranes and nuclei of erythrocytes of chicken-broilers was proposed. Data on influence of ions Na+ and K+ on activity of general ATPase, localized in cytoplasmic and nuclear membranes were presented.
Key words: ATPASE ACTIVITY, NA/K-ATPASE, ERYTHROCYTES, CHICKENS-BROILERS, CYTOPLASMIC MEMBRANE, NUCLEI.
Известно, что ионный состав внутриклеточной и внеклеточной среды имеет существенные различия, особенно в отношении одновалентных катионов натрия и калия. Ионная асимметрия используется для генерации возбуждения в нервных и мышечных клетках, а также является движущей силой для работы белков-переносчиков, осуществляющих транспорт аминокислот и сахаров в клетку [1].
Создание градиента концентраций ионов натрия и калия по обе стороны мембраны осуществляется активным транспортом этих ионов против их электрохимических градиентов специальным ферментом - Ка/К-АТФазой, использующей энергию макроэргических связей АТФ. Наибольшая активность Ка/К-АТФазы обнаружена в возбудимых и секреторных тканях: мозге, электрическом органе, почках, солевых железах [2]. На активность Ка/К-АТФазы существенное влияние оказывают многие факторы: соотношение ионов натрия и калия, количество доступного АТФ и др. Специфическими ингибиторами Ка/К-АТФазы служат уабаин (строфантин-О) и http://ei.kubagro.ru/2008/01/pdf/03.pdf
другие сердечные гликозиды, а также эндогенные дигиталисоподобные факторы [1, 3, 4, 5].
Наиболее удобными объектами для изучения функционирования Ка/К-АТФазы являются препараты, получаемые из эритроцитов, почек и мозга, что связано с легкостью получения достаточно активных мембранных препаратов из этих объектов [4].
Однако изучение функционирования Ка/К-АТФаз эритроцитов цыплят-бройлеров затруднено, так как применение специфического ингибитора этой аденозинтрифосфатазы - уабаина (строфантина-О) в концентрации 2,0-100,0 ммоль не вызывает существенного подавления активности АТФазы, выделенной из тканей цыплят [6, 7].
Такая нечувствительность к уабаину, по-видимому, объясняется существованием, по крайней мере, двух видов АТФаз, связанных с транспортом натрия. Одна из них - классическая Ка/К-АТФаза - чувствительна к уабаи-ну, а другая - Ка-транспортирующая АТФаза - не нуждается для своей работы в ионах калия [8].
Особенности работы Ка/К-АТФазы эритроцитов птиц связаны с их более сложным строением, заключающимся в наличии ядра, а в молодых эритроцитах - и митохондрий. Вследствие чего возрастные изменения морфологии и функции эритроцитов птиц изучены недостаточно [9].
Выделение субклеточных структур эритроцитов птицы сопряжено с определенными трудностями. Так, методы, предполагающие для разрушения цитоплазматических мембран эритроцитов использование детергентов (сапонин, тритон Х-100) [10, 11], оказались неприемлемы, так как, по нашим данным, применение детергентов приводило к полному разрушению цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов. Использование метода получения теней эритроцитов млекопитающих [12] путем гемолиза эрит-
роцитов дистиллированной водой приводило в наших опытах к агглютинации мембранных структур.
Цель исследования - изучить влияние ионов Ка+, К+ и М^2+ на активность общей АТФазы эритроцитов и активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров.
Методика исследований. Исследования проводили на 20 цыплятах кросса «Бройлер-6» на базе птицефабрики «Курская» Курской области. Условия содержания и кормления соответствовали действующим нормативам.
Кровь для исследований у цыплят брали из вен шеи. Отделение эритроцитов от плазмы проводили путем центрифугирования в рефрижераторной центрифуге ^ = 100С) в течение 30 мин при 3000 оборотах. Эритроциты после отделения от плазмы двукратно отмывали физиологическим раствором.
Активность АТФаз оценивали по приросту неорганического фосфата (Фн) после инкубации при 370С и выражали в нмоль Фнмг белка'1-мин' 1 [13]. Неорганический фосфат определяли спектрофотометрически [14]. Концентрацию белка устанавливали спектрофотометрическим методом Варбурга и Кристиана [15].
Результаты исследований. Результаты исследований по влиянию различных концентраций ионов Ка+, К+ и Mg2+ на активность общей АТФа-зы эритроцитов цыплят-бройлеров, представленные на рисунке 1, показывают, что ионы натрия, калия и магния оказывают активирующее действие на активность АТФазы в разных диапазонах концентраций. Так, максимальная АТФазная активность проявлялась при концентрациях ионов: натрия - 115-145 ммоль-мл'1, калия - 17-22, магния - 3,0-4,0 ммоль-мл'1.
Результаты изучения комбинаций оптимальных концентраций этих ионов представлены в таблице 1. Максимальная АТФазная активность отмечена в инкубационной среде, содержащей: Ка+ - 120 ммоль-мл, К+ - 20
2+
ммоль-мл; - 3,0 ммоль-мл, и составляла 9,24±0,23 нмоль Фн -мг белка'
і -1 ■мин .
Рисунок 1 - АТФазная активность эритроцитов при различных
концентрациях ионов
Результаты, полученные нами, указывают на то, что основную регуляторную роль в активности фермента играют ионы натрия в сочетании с ионами магния, ионы калия оказывают значительно меньшее влияние на активность АТФазы.
Таблица 1 - Влияние комбинаций ионного состава на активность АТФазы
№ среды Ионы инкубационной среды Активность АТФазы, нмоль Фн -мг белка-1мин-1
1 Ш+, К+, Mg2+ 9,24±0,23
2 Ка+ , Mg2+ 8,56±0,21
3 К+, Mg2+ 7,36±0,18
4 Mg2+ 5,96±0,15
5 - 5,12±0,11
С целью изучения влияния ионов Ка+ и К+ на активность АТФаз ядер
и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров для выделения этих субклеточных структур был выбран метод замораживания - оттаивания в растворе сахарозы, содержащем 50 ммольл-1 трис-Н2Б04 буфер (pH 7,4), с последующим центрифугированием в течение 30 мин при 1000 обмин-1.
В результате проведения серии опытов было установлено, что оптимальным является 1,375 моль-л-1 (р=1,176) раствор сахарозы, а наиболее полное разрушение клеток и выход ядер происходят при 3-кратном замораживании - оттаивании. При этих условиях получили чистую от не разрушенных клеток фракцию ядер. На рисунках 2-5 представлена микрокартина суспензии эритроцитов на разных стадиях замораживания - оттаивания.
Рисунок 2 - Частичный гемолиз эритроцитов после первого замораживания - оттаивания. Видны не разрушенные
эритроциты
* ** о *
* к • « «% 1 •. -п -
♦ аА *# * *
л * # ' Л- * ■ Й 1 , ь в
Рисунок 3 - Микроскопическая картина суспензии эритроцитов после второго замораживания - оттаивания. Тени эритроцитов и ядра
Рисунок 4 - В осадке ядра эритроцитов (после третьего замораживания - оттаивания и центрифугирования)
Рисунок 5 - В супернатанте тени эритроцитов (после третьего замораживания - оттаивания и центрифугирования)
На рисунке 6 представлены данные о влияние ионов №+ и ^ на активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров. Дисперсионным и регрессионным анализом полученных данных было установлено, что замена в среде инкубации ионов №+ на ионы ^ не оказывает достоверного влияния на активность АТФазы ядер ^>0,05). Это, по-видимому, связано с отсутствием в ядерных мембранах №+Д+-чувствительной АТФазы. Аналогичная замена ионов в среде инкубации цитоплазматических мембран эритроцитов приводила к достоверному изменению их АТФазной активности на 24,2±4,49% ^<0,01). Коэффициент регрессии (г^) составлял 0,657±0,285 ^<0,05), что характеризовало сильную зависимость АТФазной активности этих мембранных структур от концентрации ионов натрия и калия.
Рисунок 6 - Активности АТФаз ядерной и цитоплазматической мембран эритроцитов цыплят в средах различного ионного состава
Заключение. На активность АТФаз эритроцитов птиц существенное влияние оказывают ионы №+, К+ и Mg2+. Основную регуляторную роль в активности фермента играют ионы натрия. Ионы калия оказывают значительно меньшее влияние на активность АТФазы.
АТФазы цитоплазматических и ядерных эритроцитов цыплят имеют существенные различия, проявляющиеся во влиянии на них ионов №+ и ^. Так, цитоплазматические мембраны эритроцитов содержат №+Д+- чувствительную АТФазную компоненту, составляющую 24,2+4,5 % от общей АТ-Фазной активности, в то время как в ядерных оболочках наличие такой системы не установлено.
Список литературы
1. Болдырев А. А. Na/K-АТФаза - свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 4. - С. 2-9.
2. Кометиани, З.П. Кинетика мембранных транспортных ферментов / З.П. Коме-тиани, М.Г. Векуа. - М.: Высш. шк., 1988. - 111с.
3. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. - М.: МГУ, 1985.
-167 с.
4. Болдырев А.А. Современное состояние проблемы транспортных АТФаз и транспортные аденозинтрифосфатазы. - М.: МГУ, 1977. - 115с.
5. Тапильская, Н.И. Эндогенные дигиталисоподобные ингибиторы Na/K-АТФазы
- новый класс гормонов с широким спектром функций / Н.И. Тапильская, И. А. Егорова, А.Я. Багров // Цитокины и воспаление. - 2006. - № 3. - С. 3-9.
6. Степанян, Р.А. АТФазная активность плазматических мембран печеночной ткани кур в онтогенезе / Р. А. Степанян, А.А. Симонян // Биологический журнал Армении. - 1983. - № 10. - С. 830-834.
7. Фурман Ю.В. Технологические аспекты производства и использования кормовых добавок и биологически активных препаратов в животноводстве: Дисс. на соиск. уч. степ. док. биол. наук. - М., 2001. - 329 с.
8. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. - М.: Высш. школа, 1989. - 283 с.
9. Болотников, И. А. Гематология птиц / И. А. Болотников, Ю.В. Соловьев. - Л.: Наука, 1980. -116 с.
10. Шкорбатов, Ю.Г. Биоэлектрические свойства клеточных ядер / Ю.Г. Шкорба-тов, В.Г. Шахбазов // Успехи современной биологии. - 1992. - Вып. 4. - С. 499-503.
11. Шкорбатов, Ю.Г. О роли нуклеиновых кислот и других биополимеров в образовании электрического заряда клеточного ядра / Ю.Г. Шкорбатов, В.Г. Шахбазов // Молекулярная генетика и биофизика. - 1982. - № 7. - С. 35-38.
12. Keeton K.S., Kaneko I.I. Characterization of adenosinetriphosphatase in erythrocyte membrane of the cow // Proc.Soc.Ekp.Biol. and Med. 1972. N 1. P. 140-145.
13. Иващенко, А.Т. Выделение и свойства аниончувствительной аденозинтрифосфатазы из мембран эритроцитов / А.Т. Иващенко, И.А. Бушнева // Биохимия. - 1981.
- № 3. - С. 486-488.
14. Кондрашова, М.Н. Метод определения неорганического фосфата по спектрам поглощения молибдатных комплексов в ультрафиолете / М. Н. Кондрашова, М.Н. Лесо-горова, С.Э. Шноль // Биохимия. - 1965. - № 3. - С. 567-572.
15. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
