CC BY
37
изв
637.56.002:577.156
АСПАРТИЛЬНЫЕ ПРОТЕАЗЫ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ ГИДРОБИОНТОВ
Л.А. ИГОЛКИНА
Дальневосточный государственный рыбохозяйственный университет
При переработке сырья животного происхождения на рыбоперерабатывающих предприятиях формируется огромное количество стоков, содержащих ценные вещества. К ним относятся некоторые ферменты, в частности протеолитические.
Известно, что протеолитические ферменты успешно применяют для улучшения вкуса и перевариваемое™ мясных и рыбных продуктов. Ферменты животного происхождения дефицитны по объему производства, а их аналоги микробного происхождения не всегда удовлетворяют требованиям пищевой промышленности и медицины. Перспективными являются ферменты, вырабатываемые из гидробионтов, но внедрение в производство новых технологий их получения сдерживается высокой стоимостью конечного продукта. Одним из путей повышения экономичности разрабатываемых технологий получения ферментных препаратов животного происхождения может явиться увеличение комплексности переработки сырья рыбной промышленности и утилизации ее отходов.
Нами исследована возможность получения про-теолитических ферментов животного происхождения на базе промывных стоков производства рыбных фаршей типа сурими.
Как известно, в мышечной ткани рыб содержатся протеолитические ферменты класса аспартиль-ных протеаз, в частности катепсин Д [1-3].
Катепсины мышечной ткани рыб менее изучены по сравнению с катепсинами тканей теплокровных животных. Исследования последних свидетельствуют, что назначение различных катепсинов — реагировать с белками тканей [4]. При этом катепсин Д относят к наиболее важным, поскольку он инициирует белковый гидролиз с образованием пептидов, которые в свою очередь расщепляются другими катепсинами, такими как катепсин С [5]. В более ранних исследованиях [6-8] отмечено влияние протеолиза тканевым катепсином на размягчение мяса, происходящее в посмертном состоянии, а также на процесс порчи рыбы.
По данным [9], катепсин Д играет роль инициатора процессов протеолиза in vitro. Вместе с результатами других исследований это свидетельствует о возможности использовать катептические препараты, в том числе катепсин Д, для интенсификации процесса созревания рыбного и мясного сырья, характеризующегося низким уровнем активности собственных протеолитических ферментов.
При исследовании мышечного волокна разных видов рыб наибольшая специфическая активность катепсина Д выявлена в лизосомальной фракции
[10-11]. Отмечено, что лизосомы рыб, в частности карпа, менее стабильны, чем лизосомы цыпленка и теплокровных при 37°С [11]. Высказано предположение, что лизосомы мышечной ткани рыбы обладают гетерогенностью по размерам: от размера митохондрий до микросом [10]. Выход катепсина Д из клеточных структур осуществляется в результате их химического разрушения в процессе автолиза и при дезинтеграции мышечной ткани рыб.
Нами отмечено, что условия проведения технологического процесса переработки рыбы в промытый фарш типа сурими [12] соответствуют условиям разрушения и вымывания лизосом из мышечной ткани рыб. Сравнение характеристик ультраструктур промытых и непромытых фаршей показало, что степень вымывания таких органелл, как лизосомы саркоплазмы, взаимосвязана с уровнем физиологической активности рыб. Чем менее физиологически активна рыба (минтай, песчанка), тем более полное вымывание лизосом саркоплазмы наблюдается при контакте дезинтегрированной ткани с водой [13].
С целью количественной оценки вымываемых в стоки из ткани рыбы аспартильных протеаз с катептической активностью исследовали их локализацию на стадиях измельчения мышечной ткани и двукратной промывки фарша водой.
Экспериментальным материалом служила белая мышечная ткань минтая, разделанного до окоченения и хранившегося при -25°С в течение 0,5-1,5 мес. Рыбу размораживали при 18-20°С до температуры в центре рыбы 0-2°С, затем промывали в пресной воде.
На охлажденной мясорубке измельчали 50 г белой мышечной ткани и заливали 150 мл охлажденной питьевой воды. Фарш промывали, перемешивая суспензию в течение 10-15 мин, и фильтровали на двойном капроновом фильтре. Фильтрат исследовали в качестве воды 1-й промывки.
Однократно промытый фарш заливали повторно охлажденной питьевой водой и перемешивали в течение 10 мин. После фильтрования суспензии получили воду 2-й промывки. Все операции проводили при температуре от 0 до 4°С. Питьевая вода имела pH 6,8-7,0.
Протеолитическую активность определяли по модифицированному методу Ансона [14]. Кислоторастворимые продукты ферментного гидролиза ге-моглооина определяли на спектрофотометре при 280 нм. За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента, которое в условиях определения за 1 ч давало прирост оптической плотности (Л280) на единицу. Удельную активность выражали "в единицах протеолитической активности на 1 мг белка.
Протеолитическую активность по катепсину Д и содержание белка в непромытом фарше принимали за 100%. При этом экстракцию фермента
про]
НИИ
пен,
мин
КС1.
Экс
(20
при
Экст
(0,
Экст{
T0I
Ре вают из т акти Удел ед.ак фарц фари Не ки иг ворш
577.156
:тности шленка. предпо-I рыбы зазмера :епсина резуль-:е авто-и рыб.
[ техно-промы-услови-мышеч-ультра-показа-лл, как ровнем їєє фи-чанка), плазмы ванной
іемьіх в >теаз с х лока-1 ткани
а белая кочене-3,5—1,5 темпе-івали в
и 50 г охлаж-іереме-фильт-ільтрат
вторно вали в пензии провозя вода
їли по 1СЛ0Т0-иза ге-ре при вности •орое в г опти-:льную итиче-
ину Д ірини-змента
проводили 0,5%-м раствором КС1 при соотношении ткань:раствор 1:4. Предварительно ткань суспендировали в гомогенизаторе РТ-2 в течение 1 мин с небольшим количеством 0,5%-го раствора КС1. Суспензию перемешивали в течение 3 ч. Экстракт отделяли от тканей центрифугированием (20 мин; 12000 д). Все процедуры осуществляли при температуре от 0 до 4°С.
Таким образом, установлено, что при получении промытого фарша из мяса минтая в промывные стоки вымывается около 70% биологически активного белка протеолитической направленности. Также выявлено, что при двукратной промывке фарша водой в сток уходит до 80% общего водорастворимого белка.
Таблица 1
Материал исследования Белок Активность* 103 Содержание белка, %
общий, мг мг/мл общая, ед. акт. ед. акт./мл удельная, ед. акт./мг активного общего
Экстракт непромытого фарша (0,5% КС1) 369 3 78700 640 213 100 100
Вода 1-й промывки 182 1,48 58400 475 320 74 49,3
Вода 2-й промывки 112 0,9 Следы Следы — Незначит. 30,4
Экстракт двукратно промытого фарша (0,5% КС1) 135 1,1 10500 85 78 13 36
Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что при однократной обработке фарша водой из ткани рыбы вымывается 74% биологически активного белка с протеолитической активностью. Удельная активность препарата составляет 0,32 ед.акт./1 мг белка, что в пересчете на промытый фарш — 1,17 ед.акт. / 1т. В 1л стока 1-й промывки фарша содержится 475 ед.акт.
Необходимо отметить, что со стоком 1-й промывки из фарша вымывается около 50% солеводорастворимого общего белка мышечной ткани рыбы.
Для экспериментальной оценки возможности выделения ферментного препарата из промывных вод рыбных фаршей использовали метод аффинной хроматографии, примененный нами впервые для выделения и очистки протеаз мышечной ткани рыб [15-19].
Результат аффинной хроматографии катепсина Д из стока 1-й промывки фарша минтая представлен на рисунке в виде профиля элюции фермента мышечной ткани минтая на колонке (1x8 см) с бациллихин-силохромом (элюирующий раствор:
Таблица 2
Стадия очистки Белок общий АктивностьхЮ3 Степень очистки Выход, %
еД- ^280 мг общая, ед. акт. ед. акт./ мл удельная, ед./ед. Л2§о удельная, ед./мг
Вода 1-й промывки фарша 2366 700 22750 130 10 32 1 100
Аффинная хроматография, диализ и лиофильная сушка 31,5 20,9 21750 375 690 1040 69 95,6
В стоке 2-й промывки также обнаружено значительное содержание белковых веществ (30%), но ферментативная активность практически отсутствует. В двукратно промытом фарше сохранилось до 13% белка с протеолитической активностью и 36% общего белка.
1 М КС1 на 0,1 М ацетатном буфере (pH 6,5) с добавлением 25% изопропанола).
График показывает, что фермент сходит с колонки в одном активном пике. При этом объем элюата на выходе с колонки в среднем в три раза меньше объема исследуемого раствора, наносимого на колонку.
Данные табл. 2 свидетельствуют, что процесс выделения и очистки ферментного препарата проходит в одну стадию. Степень его очистки составляет 69, выход по активному белку 95%, удельная активность 1,04 ед.акт./1 мг белка.
ВЫВОДЫ
1. В промывных водах производства промытых фаршей типа сурими содержится около 74% (1-я промывка) протеаз мышечной ткани рыб. Общая ферментативная активность препарата в 1 л стока 1-й промывки 475 ед.акт.
2. В водах 1-й и 2-й промывок содержится около 80% общего водорастворимого белка.
ИЗВЕСТИ
3. Показана возможность выделения и очистки ферментного препарата из стока 1-й промывки в одну стадию с использованием метода аффинной хроматографии. Достигаемая степень очистки препарата до 7и%, выход по активному белку 95%.
4. Разработаны научные основы использования промывных вод производства промытых рыбных фаршей в качестве сырьевого источника аспар-тильных протеаз рыб.
ЛИТЕРАТУРА
1. Wojtowich М.В., Odence Р.Н. Comparative Study of Muscle Catheptic Activity of Some Marine Species / / Fish Research Board of Canada. — 1972. — 29. — № 1. — P. 85-90.
2. Makinodan Y., Ikeda S, Studies on fish muscle protease.
— VI. Separation of carp muscle cathepsin A // Bull, of Japan Society of Scient. Fisheries. — 1976. — 42. — № 2.
— P. 239-247.
3. Расулова T.A. Активность катепсина Д в мышечной ткани океанических рыб / Исследования по технологии рыбных продуктов. — Калининград, 1980. — С. 16-20.
4. Caldwell К.А. Autoiitic activity in aqueous extracts of chicken sceletal muscle // J. Arg. Food Chem. — 1970. — № 18. — P. 276.
5. Huang F.L., Tappel A.L. Action of cathepsin С and Д in protein hidrolysis / / Biochim. Biophys. Acta. — 1971. — № 236. — P. 739-748.
6. Bate-Smith E.C, The physiology and chemistry of rigor mortis with special reference to aging of beef. Adv. Food Res. 1:1.
7. Sharp J.G. Aceptic autolysis in rabbit and bovine musciles // J. Scient. Food Arg. — 1963. — № 14. — P. 468.
8. Siebert G., Schmitt A. Fish Tissue Enzymes and Their Role in the Deteriorative Changes in Fish // J. The Technology of Fish Utilization. International Sympos. Husum. — 1964.
— P. 47-52.
9. Goetlich-Riemann W., Young J.D., Tappel A.L.
Cathepsin D, A, В and effect of pH in the pathway of protein hidrolysis // Biochim. et Biophys. Acta. — 1971. — 242.
— P. 137-146.
10. Reddi P.K., Constantinides S.М., Dymsza H.A.
Cathepsin activity of Fish Muscle / /, J. of Food Science. — 1972. — 37. — P. 643-648.
11. Ueno R., Morishita Т., Takahashi T. Stability of Rainbow Trout (falmo qairdnery) Muscle Lysosmy and Their Ralatiorship to Rigor Martis / / Bull, of Japan Soc. of Scient. Fisheries. — 1981. — 47. — № 2. — P. 207-214.
12. Колаковский Э. Технология рыбного фарша: Пер. с польск. — М.: Агропромиздат, 1991. — 218 с.
13. Бойцова Т.М., Костина Э.Н. Изменение ультраструктуры мышечной ткани рыбы в процессе производства фарша / Проблемы технологии переработки нетрадиционного сырья из объектов дальневосточного промысла. — Владивосток: ТИНРО, 1989. — С. 72-81.
14. Anson M.L. The estimation of pepsin, tripsin, papain and cathepsin with hemoglobin // J. Gen. Physiol. — 1938. — 22. — № 1. — P. 79-89.
15. Иголкина Л.А., Слуцкая Т.Н. Выделение препаратов катепсина Д из мышечной ткани рыб на специфических сорбентах // Изв. вузов. Пищевая технология. — 1989.
— № 4. — С. 16-18.
16. Иголкина Л.А., Руденская Т.Н., Слуцкая Т.Н. Использование аффинных сорбентов отечественного производства для выделения катептического препарата из мышечной ткани рыб / Исследования по технологии гидробионтов дальневосточных морей. — Владивосток: ТИНРО, 1986. — С. 36-40.
17. Слуцкая Т.Н., Иголкина Л.А., Соколова Е.В. Выделение катепсина Д из мышечной ткани рыб / / Прикл. биохимия и микробиология. — 1987. — 23. — Вып. 4. — С. 447-450.
18. Иголкина Л.А., Слуцкая Т.Н. Выделение катепсина Д из мышечной ткани сельди иваси / Интенсификация технологических процессов в рыбной пром-сти. — Деп. в ВНИЭРХ, 1989, № 10 (216). — 5 с.
19. Иголкина Л.А. Использование промывных вод фарша минтая для получения ферментного препарата / Проблемы технологии переработки нетрадиционного сырья из объектов дальневосточного промысла. — Владивосток: ТИНРО, 1989. - С. 53-57.
Кафедра неорганической химии
Поступила 22.12.97
Г.И. КАС
Кубанский
В агр Федеращ ричные с лочной, карной е
К втор носятся использо лов для : побочна? дят парг дополнит дов.
С цель назначен щевого п обоснова ния ВМ\ биология трировав В 199 оценке 3 вающих 1 объектив алах кра ’’Прогноз ных виде ского кр конфере! вторичнь ные даш АПК Куб ния.
Одобр< созданик ных СЫр1 тельно р; щих пред ции [1].
К пер< рекоменд подход.
Отходь тельное к емых в пр ются неп потерявш по размер выжимки ки и друг
Отдель го сырья на предп] затем отп ку. Напр:
