CC BY
160
DOI http://dx.doi.org/10.18551/rjoas.2016-08.03
ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА В ДИАГНОСТИКЕ
APPLICATION OF IMMUNOHISTOCHEMISTRY IN DIAGNOSTICS
Стаффорд В.В., старший научный сотрудник Stafford V.V., Senior Researcher ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко», Москва, Россия
All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Y.R. Kovalenko, Moscow, Russia E-mail: [email protected]
АННОТАЦИЯ
В данной статье описана широта применения иммуногистохимеческого метода для диагностики онкологических, токсикологических, бактериальных и вирусных заболеваний человека и животных. В настоящее время иммуногистохимеческий метод является не заменимым при дифференциальной диагностике заболеваний.
ABSTRACT
This article describes the practical application of immunohistochemistry method for diagnosis of animals' and humans' oncological, toxicological, bacteriological and viral diseases. Immunohistochemistry is taking leading place in differential diagnosis of diseases.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Иммуногистохимия, гистология, патоморология, моноклональное антитело, вирус, репродуктивный респираторный синдром.
KEY WORDS
Immunohistochemistry, histology, pathomorphology, monoclonal antibody, virus, reproductive respiratory syndrome.
Иммуногистохимеческий метод (ИГХ) был разработан в 1941 году Альбертом Кунсом путем получения антител меченных флюоресцеином. Данный метод направлен на выявление точной локализации того или иного клеточного или тканевого компонента (антигена) благодаря связыванию его с мечеными антителами [11].
ИГХ методы диагностики занимают на сегодняшний день одно из главных мест в патоморфологических исследованиях. Данный метод широко используется как в научных разработках, так и в повседневной практической деятельности специалистов морфологов. При этом наибольший удельный вес принадлежит онкоморфологии, что крайне важно в диагностике заболеваний человека [5]. Широта использования данного метода в медицине позволяет дифференцировать сложные случаи в судебно-медицинской экспертизе [4].
В сфере ветеринарной деятельности основные иммуноморфологические исследования крайне необходимы, и обязательны при дифференциальной диагностике заболеваний неопухолевой природы. К таким исследованиям относятся не только вирусные и бактериальные болезни животных. ИГХ метод особенно актуален в условиях эпизоотичиского распространения болезней, эволюционного пути возбудителей заболеваний, а в условиях широты применения ИГХИ (онкология, токсикология) и экономического развития животноводства.
Основным реагентом, при иммуногистохимическом исследовании, является антитело. Появление новых антисывороток, их фракций, иммуноглобулинов и моноклональных антител к возрастающему числу тканевых антигенов, полезных в клинической диагностике, значительно увеличило количество и качество иммуногистологических методов [5].
Существует два метода выполнения ИГХИ:
Прямой метод. Заключается в том, что в реакции используют специфичные антитела с маркером (пероксидаза хрена, иммунофлюоресцентная метка, авидин-биотиновый комплекс) к искомому антигену. Данный метод более простой, однако, не столь четкий из-за возможных артефактов и ошибочной интерпретации результатов.
Не прямой метод. Суть данного метода заключается в применении двух различных антител - первичное, не маркированное специфичное к искомому антигену, и вторичное, маркированное антитело, для которого первичное антитело является антигеном. Данный метод более специфичен, хоть и является более трудоемким и затратным.
Проведение иммуногистохимического исследования возможно с применением как стандартной парафиновой проводки, так и с применением замораживающего микротома. Применение криотома значительно ускоряет процесс диагностики заболевания, сокращая его до нескольких часов.
В секторе патоморфологии ФГБНУ ВИЭВ выполняется работа по многим направлениям гистологии и патоморфологии органов и тканей различных видов животных, в том числе рыб и пчел. Одним из основных направлений является изучение респираторных болезней свиней вирусной этиологии.
Инфекционная патология респираторных органов свиней, наносит огромный экономический ущерб во всех странах с развитым свиноводством. В хозяйствах, неблагополучных по репродуктивно респираторному синдрому, инфицированность поросят данными вирусами составляет от 70-80%, а летальность при этом может достигать 100%. Наиболее подвержены заболеваниям поросята 2-3 месячного возраста [7; 14], патология протекает со смешанной клинической картиной.
Учитывая тяжесть заболевания, высокую смертность поголовья и трудности, вызванные при дифференцированием осложненных заболеваний, для диагностики репродуктивного респираторного синдрома свиней (РРСС) применяют методы молекулярной биологии направленные на выделение вируса; выявление его антигенов, а так же антител к вирусу. Для данных целей используют полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (РТ ПЦР), стандартную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [12]; гибридизацию in-situ [15]; иммуноферментный анализ (ИФА) сывороток крови на наличие специфических антител против вируса РРСС с применением стандартных диагностических наборов [6; 8].
Немаловажную роль при оценке характеристик заболеваний играет патоморфологическое исследование, которое позволяет более детально изучить особенность респираторной патологии, степень повреждения органов, а для определения тропности инфекционного агента, его эволюционного пути используют метод иммуногистохимической диагностики. ИГХ исследование, так же используется для дифференциальной диагностики, что в комплексе исследований является основным методом.
При ИГХИ органов свиней непрямым методом зарубежные авторы опираются на разработанный в 1994 году способ, который описал Patrick G. Halbur с соавторами [13]. Для исследования они отбирали органы свиней в 10% забуференный нейтральный формалин, жидкость Буэна или раствор содержащий 4% формальдегида и 1% глутарового альдегида. Затем ткань фиксировали в течение 24 часов. После фиксации ткани в жидкости Буэна, ее выдерживали в 5 сменах 70%го этилового спирта. Иммуногистохимическую реакцию выполняли на парафиновых срезах предварительно депарафинировали их и проводили через батарею спиртов в возрастающей концентрации. Далее выполняли ряд манипуляций направленный на выявление колмплекса антител с пероксидазной меткой.
В России, для диагностики вышеуказанного заболевания, применяют полимеразную цепную реакцию, РТ ПЦР [12], иммуноферментный анализ и иммуноцитохимическую диагностику на культуре клеток МАРК-145 непрямым гистохимическим вариантом ИФА с применением моноклональных антител [1].
В настоящее время в секторе патоморфологии одним из современных методов диагностики является применение иммуногистохимических исследований, которые помогают расширить диагностические и научные возможности по выявлению вируса РРСС, определению его тропности к клеткам органов и вирулентного действия на системы организма. В условиях высокой смертности при заражении поголовья вирулентными штаммами данный метод незаменим для дифференциальной диагностики и научных исследований. Наши данные согласуются с зарубежными коллегами что вирус тропичен к альвеолярным макрофагам за счет маркера СD 163. Однако есть основание предположить развитие тропизма и к другим клеткам за счет вариабельности и растущей вирулентности вируса РРСС.
Исходя из вышеизложенного, в условиях хорошего оснащения лаборатории, можно выполнять несколько основных целей исследования: быстрая диагностика, научное исследование и рутинные гистологические исследования, которые могут быть направлены и на определение качества продукции. С этой целью в гистологической лаборатории можно выполнять параллельно два вида исследований: морфологическое и иммуногистохимическое, что позволяет более детально интерпретировать полученные данные. Такой объем работ является одним из основных направлений для выполнения заданий по реализации государственной научно-технической политики и развития сельского хозяйства. Применение дополнительных молекулярно-биологических методов дает целый ряд научно-диагностических возможностей для специалистов, что способствует комплексному подходу к диагностике и оценке качества исследований.
Несомненно, исследования такого рода сопряжены с рядом затратных мероприятий направленных на получение или приобретение специфичных моноклональных антител, использованием необходимых растворов, оборудования и т.п. Несмотря на это данный вид диагностики получает все большее распространение в ветеринарии, занимая одно из основных мест не только в дифференциальной диагностике болезней животных, но и в научных целях.
Кроме того, в настоящее время, на наш взгляд, существует необходимость в создании и внедрении специализированных баз данных, содержащих подробную информацию об эпизоотологических, молекулярно-генетических и патоморфологических характеристиках штаммов и полевых изолятов возбудителей инфекционных болезней животных. Идеальным инструментом для реализации этого являются геоинформационные системы (ГИС). Подобный проект ГИС воплощен в Европейском бюллетене по бешенству животных, с которым лаборатория эпизоотологии ВИЭВ сотрудничает уже 25 лет, ежеквартально представляя данные о заболеваемости бешенством животных разных видов на территории Европейской части Российской Федерации [2, 17].
Автор выражает огромную благодарность сотрудникам АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных» за оказанное содействие и всестороннюю помощь.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Вишняков И.Ф., Куриннов В.В., Балашов Е.А., Лыска В.М., Суханова О.В., Зуев В.В. Патент RU 2115929 С1, патентообладатель - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии.
2. Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза // Вопросы вирусологии. - 2014. - Т. 59. - №3. - С. 5-10.
3. Гулюкин, А.М. Эпизоотологические геоинформационные системы. Возможности и перспективы / Гулюкин А.М., Шабейкин А.А., Белименко В.В. // Ветеринария. - 2016. -№7. - С.21-24.
4. Збруева Ю.В., Кульбицкий Б.Н., Кабакова С.С., Джуваляков П.Г., Богомолов Д.В., Федулова М.В. Иммуногистохимическое исследование ушиба сердца // Судебно-медицинская экспертиза. 2013. №1. С. 54-55.
5. Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck.: DAKO / Пер. с англ. под ред. Франка Г.А. и Малькова П.Г.. - М., 2011. -224 с.
6. Орлянкин Б.Г., Гребенникова Т.В., Алипер Т.И., Мишин А.М. Специфическая профилактика репродуктивнореспираторного синдрома свиней // Свиноводство. 2010. №3. С. 67-69.
7. Орлянкин Б. Г., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. Инфекционные респираторные болезни свиней: этиология, диагностика и профилактика // Ветеринария. 2005. №11. С. 3-6.
8. Сидорчук А.А., Зеленуха Е.А. // Причины респираторной патологии свиней в ряде промышленных комплексов России. Ветеринария, 2014, №1, стр.17-24;
9. Шабейкин, А.А. Анализ текущей эпизоотической ситуации по бешенству на территории Российской Федерации / Шабейкин, А.А. Гулюкин А.М., Цареградский П.Ю., Паршикова А.В., Южаков А.Г., Зайкова О.Н. Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2015. - №4. -С. 5-7.
10. Шабейкин, А.А. Опыт использования ГИС-технологий при оценке рисков в эпизоотическом исследовании / Шабейкин А.А., Гулюкин А.М. // Материалы V Международного ветеринарного конгресса, Москва. -2015. - С. 250-252.
11. Coons A.H. Immunological properties of an antibody containing a fluorescence group / Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1941. - Vol.47. -P.200_202. 12. Fisher C. Immunohistochemistry in diagnosis of soft tissue tumours / Fisher C. // Histopathology. - 2011. - Vol. 58. -P.1001_1012.
12. Livak KJ, Schmittgen TD // Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2( Delta DeltaC(T)). Methods 25, 2001, p.402-408.
13. Patrick G. Halbur Development of a streptavidin-biotin immunoperoxidase procedure for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antigen in porcine lung//Patrick G. Halbur, John J. Andrews, Elise L. Huffman, Prem S. Paul, Xiang-Jin Meng, Yosiya Niyo. J Vet Diagn Invest 6:254-257 (1994) р.254-257.
14. Sibila, M., Pieters, M., Molitor, T., Maes, D., Haesebrouck, F., Segales, J., 2009. Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection. Vet. J. 181, 221-231.
15. Trang NT, Hirai T, Ngan PH, Lan NT, Fuke N, Toyama K, Yamamoto T, Yamaguchi R Enhanced detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in fixed tissues by in situ hybridization following tyramide signal amplification // J Vet Diagn Invest. 2015 May; 27(3):326-31. Epub 2015 Apr 8.
16. Vedernikov V.A., Sedov V.A., Pitalev P.N., Semljanova V.E., Gulyukin A.M. et al. Rabies in individual countries (Russia, European part only) // Rabies bulletin Europe. 1998. Т. 22. №4. С. 9-10.
17. Vedernikov V.A., Sedov V.A., Baldina I.V., Gulyukin A.M. et al. Summary of Rabies in the Russian Federation - Particularities of the Present Situation. Rabies Bulletin Europe -V. 23 -N. 4 -1999: 13-15.
