CC BY
49
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
АПОПТОЗ И НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ НА КОЖЕ ПРИ МЕЗОТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ ВВЕДЕНИИ ПРЕПАРАТОВ
Е.О.ШЕВЕЛЁВА
Кафедра патологической физиологии РУДН. Москва. 117198, ул. Миклухо-Маклая, д. 8. Медицинский факультет. Россия И.А КОМАРЕВЦЕВА., Е.А.ОРЛОВА Кафедра биохимии ЛГМУ. г. Луганск. 91045 квартал 50 лет Обороны Луганска, 1, Украина М.В.САМОЙЛОВ Кафедра патологической анатомии ЦКБ РАМН. Москва. 117593,
Литовский б-р, 1А
Описаны особенности, дающие важную информацию о механизмах воздействия ан-тигомотоксических препаратов.
Проблема предотвращения увядания кожи далека от своего разрешения. Продолжается поиск новых, эффективных способов, направленных на улучшение рельефа, тургора, эластичности кожи. Многолетний эмпирический опыт дерматологов свидетельствует о том, что идеальная регенерация достигается благодаря восстановлению кожи в исходе воспалительной реакции, поэтому в последние годы одной из задач среди дерматологов и косметологов является разработка методов моделируемого контролируемого повреждения кожи, способствующего эффективной репарации. Широкое распространение получила мезотерапия. Она представляет собой метод локального множественного парентерального (мезодермального) введения лекарственных веществ в очень низких дозах. Такое воздействие обеспечивает наилуч-шее распределение препарата, а вместе с нанесением локальной микротравмы создаёт наиболее благоприятные условия для активации клеточного метаболизма и восстановления кожи. Воспалительный и регенераторный процессы характеризуются традиционно принятыми параметрами клеточного компонента воспалительной реакции - активностью хемотаксиса и оксидант-ных свойств макрофагов. Также характеризуются апоптотическими [1,6,9,10,11] и ЯМР-релаксационными процессами в тканевой и клеточной воде, отражающими изменения ионного транспорта и клеточного объема [2,8]. Комплексное изучение этих методов может, с одной стороны, способствовать теоретическому обоснованию активно распространяемого лечебного метода, а значит обеспечить пути его совершенствования. С другой, в условиях предложенной самой клинической практикой экспериментальной модели, имеется возможность получить новые сведения об универсальных общепатологических процессах - воспалительном и регенераторном.
Целью работы явилось изучение особенностей течения воспаления в здоровой коже при применении мезотерапевтических процедур. Наряду с заве-
домо воспалительным эффектом примененной никотиновой кислоты исследовали воздействие препарата Cutis compositum (Кутис композитум), Heel, Германия. Препарат хорошо зарекомендовал себя при лечении псориаза, нейродермита и др. кожных заболеваний. По имеющимся данным это лекарственное средство обладает противовоспалительным, противоаллергическим, противомикробным и репаративным действием (активизирует митотический цикл кератиноцитов, стимулирует цикл Кребса, улучшает венозный и лим-фоотток, способствует улучшению микроциркуляции дермы).
Материалы и методы.
Эксперимент проводили на белых крысах линии Vistar, самцах, 16 недель, массой 200-300 г, всего 65 животных, которьщ мезодермально (на глубину 1,5-2мм) инсулиновым шприцом вводили препараты противоположных типов действия - никотиновую кислоту (провоспалительной активности) и Кутис композитум (противовоспалительного действия). Для контроля исследовали животных, которым вводили физиологический раствор. Препараты применяли в одинаковых общих объёмных количествах равных 0,7 мл за одну процедуру и вводили их в 30 единовременных инъекциях соответственно в область наружной поверхности левого бедра. Никотиновую кислоту - 1% -
0,2мл разводили физиологическим раствором до 0,7 мл. Каждая опытная и контрольная группа насчитывала от 3 до 12 голов. Инъекции проводили с интервалом в 2-3 дня. Животных забивали декапитацией, извлекали кусочки кожи. ________________________________
Выраженность воспалительного процесса в дерме оценивали по значениям показателей активности хемотаксиса и интенсивности продукции активных форм кислорода. Активность хемотаксиса исследовали в суспензии макрофагов. Определение интенсивности продукции активных форм кислорода в макрофагах проводили методом, основанным на способности нитросинего тетразолия восстанавливаться кислородными радикалами до диформазана. Для оценки интенсивности апоптоза использовали показатель ДНК-фрагментации клеток кожи. Гомогенат кожи после лизис-буфера центрифугировали и отделяли .фрагментированную ДНК. Пробы ресуспензировали в трйс-буфере и преципитировали в трихлоруксусной кислоте, центрифугировали, отбирали ф-ДНК и добавляли дифениламиновый реагент, осуществляли спектрофотометрическую оценку степени повреждения ДНК. Изменения внутриклеточного объёма как одного из возможных стимуляторов апоптоза определяли с использованием ЯМР (ядерно-магнитный резонанс) протонов тканевой воды клеток кожи методом ЯМР-релаксометрии на ядрах Н+, in vitro. Определяли подвижность молекул воды, скорость их переориентации в связанном и свободном состояниях, перемещение тканевой воды через плазматическую мембрану. Измерения проводили в ячейке ЯМР-релаксометра «Minispec PC 120». Данные обрабатывались автоматически с помощью программных пакетов «Вгикег» (ФРГ). Все изменения протонной плотности в ткани оценивали по времени релаксации (Т). Определяли показатели спин-решеточной (Т1) и спин-спиновой (Т2) релаксации протонов тканевой воды. Биэкспотенциальный анализ Т1 позволил определить содержание клеточного
объема. Затем автоматически рассчитывались данные о соотношении внутри - (Ра) и внеклеточной воды (РЬ) [3,4].
Результаты исследования.
Статистическая обработка проводилась пакетом статистических программ БРЗБ 8.0. Непараметрическое распределение выборки проверялось критерием Колмогорова-Смирнова, а также по величине ассиметрии и акцесса кривой Гаусса. При нормальном распределении изучаемых выборок, а также при оценке качественных показателей использовались методы непараметрической статистики с использованием критерия Стьюдента. При ненормальном распределении изучаемых выборок, а также при оценке качественных показателей использовались методы непараметрической статистики: ранговый и знаковый критерии Вилкоксона. Достоверность учитывалась при Р<=0,05.
Значения показателей никотиновой кислоты - НК превышали таковые у Кутис Композитум - КК. При сравнении показателей НК с группой контроля
Таблица 1
Характеристика групп исследования по различным ______физико-химическим характеристикам __________________
Группа Показатель Интенсивность хемотаксиса (мг белка/мл) Кислородный взрыв (отн.ед.) ДНК-фрагментация в клетках дермы (%)
Физиологический раствор п 9 9 12
М±ш 0,05±0,01 0,63±0,06 11,16±0,67
Никотиновая кислота п 7 7 10
М±т 0,09±0,01 0,83±0,02 38,28±2,01
Cutis Compositum п 12 12 10
М±т 0,06±0,00 0,73±0,05 27,97±1,75
Общее п 28 28 32
М±т 0,06±0,00 0,72±0,03 24,89±2,21
было показано более выраженное развитие островоспалительной реакции при применении первого.
Среднее значение (М) ф-ДНК в клетках дермы для НК также было больше такового для КК. При этом чем интенсивнее был кислородный «взрыв», тем были выше значения показателей ф-ДНК, степень корреляции (г)= 0,893 при Р=0,007. Последнее может указывать на взаимосвязь острого воспаления и апоптотического процесса, т.е., чем активнее протекали воспалительные изменения в коже, тем интенсивнее проявлялся апоптоз.
Внутригрупповое исследование ЯМР-показателей Н+ при введении НК свидетельствует об уменьшении времени продольной и поперечной релаксации (Т1=390,8±19,1мсек и Т2=38,9±},4 мсек). Такое сочетание показателей указывает на продолжающееся снижение подвижности молекул воды, увеличение структуризации воды за счет гидрированного слоя, увеличение его
толщины. Увеличивается плотность молекул воды, идет формирование гидрированного слоя вокруг возрастающего количества осмотически активных ионов (например, натрия), способствующие задержке воды в коже и нараста-
Таблица 2
Достоверность разницы показателей по группам сравнения ____________ по Вилкоксону________
Группы сравнения Р при исследовании интенсивности хемотаксиса Р при исследовании "Кислородного Р при исследовании ДНК-фрагментации в клетках дермы
Физиологический раствор / Никотиновая кислота 0,004 0,008 < 0,001
Физраствор / Cutis Compositum 0,003 0,046 < 0,001
Cutis Compositum / Никотиновая кислота 0,012 0,253 0,002
Примечание: Достоверна разница при р<=0,05
нию отёка. Характеризуя КК, необходимо отметить, что в коже показатели продольной и поперечной релаксации увеличивались (Т1= 446,6± 18,1 мсек и Т2= 44,6±1,5 мсек). Эти значения указывают на увеличение подвижности молекул воды, ее расструктурирование, ускорение протонного обмена между кристаллической и свободной фракциями тканевой воды, уменьшении гидрированного слоя. Это указывает на увеличение свободной фракции, воды. Результаты сравнения НК и КК были достоверными и соответствовали рТ1= 0,050 и рТ2= 0,017. В контрольной группе проявления отёка ткани кожи было менее выражено: Т1= 450±12,2 мсек, Т2= 47,4± 0,9 мсек, эти значения ещё более достоверны при сравнении с НК (рТ]= 0,027 и рТ2= 0,001). Показатель для НК внеклеточной воды (Ра)= 67,6%, внутриклеточной (РЬ)— 32,4%; для КК Ра= 70,7%, РЬ= 29,3%. Следует отметить, что после применения препаратов выявилась зависимость Т2 от показателей внутриклеточной и внеклеточной воды. Чем меньше Т2, тем больше РЬ, характерное для РЖ (г=-0,553, Р=0,004), следовательно количество внутриклеточной воды при применении НК будет увеличиваться. С другой стороны, чем больше Т2, тем больше Ра, соответствующее КК (г=0,553, Р=0,04), значит после введения КК внеклеточная вода будет нарастать. Отмечена обратная зависимость между Т2 и кислородным «взрывом» (гТ2/кислор.взрыв= -0,394, Р =0,05). Это может говорить об усилении внутридермального воспаления в ответ на введение НК.
При сравнительной оценке показателей ДНК-фрагментации и ЯМР была выявлена обратно пропорциональная взаимосвязь между Т1 и ф-ДНК и Т2 и ф-ДНК (гТ1/ф-ДНК=-0,369, Р-0,050 и гТ2-0,571, Р=0,03). Таким образом, чем меньше .Т-1 и Т2, тем интенсивнее апоптоз. При введении НК наблюдается снижение показателей Т1 и Т2, следовательно апоптотические процессы бу-
дут протекать более интенсивно. После применения КК, наоборот, наблюдается уменьшение апоптоза (см. выше).
Выводы.
Воспалительная реакция, возникающая в здоровой коже при мезотерапев-тическом использовании препарата Кутис Композитум, характеризуется существенными особенностями, отличающими ее от таковой при введении провоспалительного препарата (никотиновой кислоты) и реакции на введение биологически нейтрального физиологического раствора. Это характеризуется измениями в показателях интенсивности апоптоза, особенностях ЯМР-релаксации протонов воды, значениях активности хемотаксиса и интенсивности продукции активных форм кислорода в макрофагах. Описанные особенности дают важную информацию о механизмах воздействия антиго-мотоксических препаратов и, в частности, их мезотерапевтическом эффекте.
Литература
1. Бевза О.В. Са2+/ Н+ обмін крізь плазматичну мембрану в системі механізмів транспортування іонів Са та водню. //Укр. біохім. журнал. - 2003. - т. 75, № 5. - С. 28-41.
2. Зимин Ю.В., Сяткин СП., Березов Т.Т. Надмолекулярная регуляция активности некоторых оксидоредуктаз клетки в норме и патологии.7/Вопросы мед. Химии .-2001.-т. 3.-С.35-43. :1
3. Комаревцева И.А. Способ определения водно-солевого баланса организма in vi-
tro / Приоритетная справка изобретения №4688829/14 от 04.05.89 г., положит. Решение 05.03.90 г....
4. Орлова Е.А. Сравнительная динамическая активность гормонов по данным ЯМР-релаксометрии ин витро// диссерт на соиск. степени кандидата мед.наук.-1996.-Киев, инст. Биохимии им. Палладина.
5. ЯрилинА.А.. Апоптоз.// Эстетическая медицина,.-2004,-№ З,т.2.-С. 111-123.
6. Brysk М, Selvanayagam Р, Arany I, et al. Induction of Apoptotic Nuclei by Interferon
gamma and by.Predesquamin in cultured keratinocytes//Joumal of Interferon and Cytokine Research .-1995,- 15.-C.1029-1035, ~
7. Fullerton G. NMR relaxation of proton in tissues and other macromolecular water'so-lution.//Magn. Res. Imag.-1992.-№ l.-C.209-228.
8. McCall, CA., Cohen, JJ. Programmed Cell Death in Terminally Differentiating Kerati-nocytes: Role ofEndogenous Endonuclease.//J Invest Dermatol .-1991.-№ 97.-P.111-114.
9. Haake RA and Polakowska RR. Cell death by apoptosis in epidermal biology. //J Invest Dermatol.- 1993.-№101.-P.107-112.
10 .Paus R, Rosenbach T, Haas N, et al. Patterns of cell death: The significance of apoptosis for dermatology.// Exp Dermatol .-1993.-№ 2.-P.3-11.
APOPTOSIS AND SOME DERMAL INFLAMMATORY REACTION FEATURES UNDER CONDITIONS OF MESOTHERAPEUTIC INJECTION OF PREPARATIONS
E.O. SHEVELEVA
Department of pathophisiology RPFU. Moscow. 117198. M-Maclaya st 8.
Medical faculty
I.A. KOMAREVCEVA, E.A. ORLOVA Department of biochemistry LGMU. Ukraina. 91045. Lugansk, 50 let Oboroni
Luganska boulevard M.V. SAMOYLOV Department of anatomical pathology, Central clinical hospital, Russian Academy of Sciences. Moscow. 1179593. Litovsky b-r 1A
Apoptosis level (DNA fragmentation), NMR H-proton relaxation, chemotaxis and macrophage activated oxygen production in the skin of 65 healthy laboratory rats were examined during mesotherapeutic administration of antihomotoxical Cutis Compositum, proinflammatory nicotinic acid and physiological solution. Significant changes in these parameters were stated. The mechanisms of antihomotoxical mesotherapeutic influences were discussed.
