CC BY
13
УДК: 615.22:543.422.25
© Г.А. Дроздова, Ю.А. Белоус, И.А. Комаревцева, Е.В. Комаревцева, 2010
11 2 2 Г.А. Дроздова , Ю.А. Белоус , И.А. Комаревцева , Е.В. Комаревцева
Н+-ПРОТОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ КЛЕТОЧНОГО ОБЪЕМА ПРИ СТИМУЛИРОВАННОМ АПОПТОЗЕ В ПОЧКАХ
Российский университет дружбы народов, г. Москва Луганский государственный медицинский университет, Украина
Целью работы явилось изучение показателей ЯМР-релаксации тканевой воды в оценке степени гидратации ткани почек острой почечной недостаточности. Ранняя стадия острой почечной недостаточности, сопровождаемая стимуляцией апоптических процессов в клетках почек, характеризуется увеличением клеточного объема.
Модуляторы апоптоза - даларгин, налоксон и каптоприл, обладающие антиапоптическим действием, изменяют внутриклеточный объем с тенденцией к дегидратации ткани, а индометацин, стимулирующий апоптоз, вызывает увеличение клеточного объема. Данные ЯМР-релаксометрии достоверно коррелируют с содержанием фрагментированной ДНК в клетках почек.
Ключевые слова: ЯМР-релаксометрия протонов тканевой воды почки, апоптоз, острая почечная недостаточность.
G.A. Drozdova, U.A. Belous, I.A. Komarevtseva, E.V.Komarevtseva
H+-PROTON MECHANISMS OF CELLULAR VOLUME IN STIMULATED APOPTOSIS OF KIDNEYS
The aim of work was to study parameters of a nuclear magnetic resonance-relaxation of tissue water in estimation of degree of hydration of kidney tissue in acute renal failure. The early stage of acute renal failure accompanied by stimulation of apoptotic processes in kidney cells is characterized by increase of cellular volume.
Apoptosis modulators - dalargin, naloxone and captopril, possessing antiapoptotic action, change endocellular volume with the tendency to dehydratation of tissues, and the indometacin stimulating apoptosis, causes increase in cellular volume. The given nuclear magnetic resonance-relaxometry may correlate with the maintenance of fragmantic DNA in kidney cells.
Key words: NMR-relaxation ofprotons of tissue water in kidney, apoptosis, acute renal failure.
Важным интегральным показателем клеточного гомеостаза является внутриклеточный объем. Постоянство объема любой клетки регулируется такими механизмами, как транспорт ионов через мембраны, а также накопление или использование органических осмотически активных метаболитов. Объемрегулирующие механизмы клетки запускаются множеством внутриклеточных сигнальных факторов, таких как изменение мембранного потенциала и внутриклеточного состава ионов, каскады различных вторичных посредников, формирование протеинов и изменение экспрессии ионов. Изменение объема клетки и механизм его регулирования участвуют в разнообразных клеточных функциях, включая эпителиальный транспорт, метаболизм, возбуждение и выделение гормонов, пролиферацию и гибель клетки [5]. Как известно, любые изменения внутриклеточной и внеклеточной осмолярности сопровождаются соответствующим перемещением воды через мембраны с последующим изменением объема клетки.
Ионы составляют большую часть внутриклеточной (главным образом, К) и внеклеточной (Na+, Cl-) осмолярности [6]. Кроме того, на их долю в регулировании объема клетки приходится 2/3 от других механизмов регуляции осмолярности [7]. В поддержание постоянства объема клетки вовлечены следующие процессы:
Ш+/Н+-обмен, Na+/K+/2Cl-
котранспорт, Na+ZCa^-обмен, функционирование Н+-АТФ-азы параллельно с С1-каналами и,
2+ +
возможно, Са /Н -обмены (существование последнего сегодня широко обсуждается) [1].
Изменение внутриклеточного объема способно модулировать многие метаболические процессы в клетке [8-10] и, наоборот [11-12]. Так, изменение объема клетки влияет на метаболизм активных форм кислорода (АФК) [16]. Набухание клетки стимулирует генерацию АФК, а сжатие - ингибирует, через влияние на пентозофосфатный путь
продукции NADPH. Набухание клетки активирует NADPH-оксидазу, что способствует накоплению активных форм кислорода. Обычно этот фермент подавляется высокой осмолярностью [12, 14]. Кроме того, увеличение клеточного объема стимулирует накопление арахидоновой кислоты (АК), которая необходима для активации NADPH-оксидазы [15]. Следовательно, с одной стороны, как было сказано выше, набухание клетки активирует генерацию в ней АФК и АК [12]. Но, с другой стороны, это, в свою очередь, стимулирует триггерные механизмы апоптоза [17]. Ацидоз, характерный для апоптоза как следствие чрезмерной стимуляции множества энергозависимых процессов и изменения активности ионных обменников приводит к накоплению Са2+, роль которого в запуске суицидальной программы важна и очевидна. Хотя необратимая фаза апоптоза характеризуется уменьшением клеточного объема [20], но это является следствием уже развившегося процесса, а не его причиной.
Как оказалось, наблюдается неоднозначный эффект увеличения объема клетки на ее метаболизм. С одной стороны, набухание клетки является необходимым условием для активации пролиферации клеток, т.к. многие митогенные факторы активизируют Na+/H+-обмен, Na+/K+/2Cl -котранспорт [13]. Одним из последствий активации этих транспортных систем является увеличение объема клетки. С другой стороны, как уже было сказано, набухание клетки способствует накоплению в ней АФК. Таким образом, увеличение объема клетки является необходимым условием пролиферации, но в то же время это создает предпосылки для активации апоптоза. По всей видимости, такой эффект направлен на создание условий для быстрой элиминации неполноценных клеток, которые могут образоваться в процессе митоза, путем апоптоза.
Сморщивание же клетки подавляет пентозофосфатный путь и способствует ингибированию НАДФ-оксидазы, то есть препятствует накоплению АФК в клетке и активации апоптоза таким путем. Но сморщивание клетки также является одним из заключительных этапов апоптотических механизмов, т.е. уменьшение объема иным образом участвует в регуляции апоптоза. Как оказалось, увеличение внеклеточной осмолярности в 2 раза, вызывает апоптоз [18, 19].
Следовательно, неоднозначность и противоположность влияния изменения клеточного объема на механизмы апоптоза требует более детального и углубленного изучения. Одним из методов исследования изменения клеточного объема является ЯМР-релаксометрия как in vivo, так и in vitro.
Время релаксации (Т1 и Т2) является биохимическим показателем изменения объема клетки. Почти во всех, без исключения, биологических тканях увеличение протонной плотности является причиной удлинения времени релаксации - T1 и Т2. Все ЯМР-параметры в различной степени взаимосвязаны, и некоторые из них могут играть важную роль в идентификации тканей и диагностике болезней, связанных с нарушением программы клеточной гибели.
В настоящее время данные литературы по экспериментальным ЯМР-исследованиям противоречивы и часто отражают различие точек зрения при объяснении тех или иных биологических процессов. Очевидно, что время релаксации тесно связано с биофизическими свойствами клеток и тканей. По мере накопления знаний о ЯМР-свойствах тканей, которые ответственны за время T1 и Т2, возникает реальная перспектива более глубокого изучения влияния модуляторов апоптоза на релаксацию тканевой воды.
Цель данного исследования - изучить Н+-протонные механизмы клеточного объема на модели стимулированного апоптоза в почках.
Материалы и методы. Эксперимент проводили на 236 белых половозрелых крысах-самцах 16-18-ти недельного возраста. У животных формировали острую почечную недостаточность (ОПН) двумя моделями. I модель преренальная - по типу ишемия /реперфузия - за счет пережатия почечной ножки в течение 30 минут. Операцию проводили под тиопенталовым наркозом в дозе 10 мг/мл, в стерильных условиях. У контрольных
животных проводили двухсторонние надрезы кожи и мышц в области спины. II модель ренальная - «глицерольная» - путем двухстороннего внутримышечного введения 50% раствора глицерола из расчета 10 мл на 1 кг веса животного. Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора.
Животных наблюдали в ранний период развития ОПН (олигурическая стадия) [2]: через 1 час после ишемии (контроль - 2) и в течение 1, 2, 3-х суток (ОПН-1,ОПН-2,ОПН-3). Забой животных проводили методом декапитации под легким эфирным наркозом.
Исследования изменения клеточного объема в почках проводили методом ЯМР-релаксометрии на ядрах Н+, in vitro [3]. Был использован ЯМР-релаксометр «Minispec pc 100». Метод ЯМР позволяет определить подвижность молекул воды, скорость их переориентации в связанном и свободном состояниях, перемещение тканевой воды через плазматическую мембрану. Все эти изменения протонной плотности в ткани оцениваются по времени релаксации (Т). Время релаксации изменения объема клетки является биохимическим показателем. В проведенных экспериментах спин-решеточную составляющую (Т1) времени релаксации определяли по методу «inversion-recobvery», используя 180-Т-900-пульсовую последовательность, а спин-спиновая составляющая (Т2) -по методу СРМО. Время повторения импульса 3,0 сек. Биэкспотенциальный анализ Т1 позволил определить содержание клеточного объема. Полученные данные обрабатывались автоматически на компьютере с помощью программных пакетов фирмы «Bruker».
После забоя животных почки извлекали и взвешивали на весах «Sartorius». Для ЯМР-исследований навески почек были одинаковые и составлили 750±0,005 мг. Затем почки измельчали на льду и помещали в пробирки для ЯМР-исследования.
Для того, чтобы установить корреляционные связи между Н-протонными механизмами и фрагментацией ДНК в клетках почек, мы применили модуляторы апоптоза, использованные нами в работах (даларгин, налоксон, каптоприл, индометацин). Инъекции даларгина (100 мкг/кг), налоксона (3 мкг/кг), каптоприла (1,5 мг/кг) и индометацина (5 мг/кг) вводили животным внутрибрюшинно за 20 минут до формирования экспериментальной ОПН. В течение периода наблюдения (1-е, 2-е, 3-и сутки) препараты вводили одноразово.
Статистическая обработка экспериментальных данных была проведена с помощью критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Развитие экспериментальной ОПН в ткани почек сопровождается количественными и качественными апоптическими изменениями. Так, морфологические исследования подтвердили наличие конденсации ядерного хроматина и его расположение по периферии ядра в виде полуколец, уменьшение размеров ядер и их фрагментация. В предыдущих наших работах было установлено, что ОПН в первые трое суток протекает с увеличением содержания низкомолекулярных фрагментов ядерной ДНК по сравнению с контрольной группой.
Таблица 1
Спин-решеточная (Т1) и спин-спиновая (Т2) релаксация протонов тканевой воды почек и содержание внутриклеточной воды (Ра ) в моделях ОПН
Серии экспериментов Т1-релаксация, мсек Т2-релаксация, мсек Ра, % (Ра+Рв=100%)
Контроль 569,3±2,6 64,0±0,7 76,8±1,2
I модель
ОПН-1 сутки 608,5±2,4* 66,9±0,2* 84,9±1,7*
ОПН-2 сутки 620,2±3,6* 76,8±0,5* 85,9±1,1*
ОПН-3 сутки 615,1±3,2* 74,7±0,5* 85,3±1,2*
II модель
ОПН-1 сутки 587,7±2,2* 71,4±0,1* 85,8±2,2*
ОПН-2 сутки 616,0±2,5* 73,9±0,6* 86,3±2,3*
ОПН-3 сутки 613,5±2,1* 72,4±0,3* 86,1±2,7*
Примечание: * - различия достоверны относительно контроля, р<0,05
В таблице 1 представлены результаты 1Н-ЯМР in vitro релаксации интактных почек крысы, а также на 1-е, 2-е и 3-и сутки эксперимента. После развития ОПН было зафиксировано увеличение спин-решеточной (Т1) и спин-спиновой (Т2) составляющих времени релаксации в клетках почечной ткани по сравнению с группой контроля (табл. 1).
Динамика изменения показателей Т1 и Т2 между группами ОПН-1,ОПН-2 и ОПН-3 оказалась однозначной, с увеличением от первых к третьим суткам. На продольную (Т1) релаксацию в тканях оказывают действие два фактора: содержание всей тканевой воды и способность участков макромолекул связывать воду в гидратный слой. В то же время параметр Т2 определяется количеством участков, присоединяющих кристаллизированную воду, и толщиной гидрированного слоя [4-19]. Удлинение Т1- и Т2-времени релаксации свидетельствует о медленном протонном обмене между свободной и гидрированной фракциями тканевой воды, а также об уплотнении слоя гидратной воды [2, 4, 7].
Несмотря на сложный клеточный состав, ученым удалось разделить внутри- и межклеточную водные фракции по времени релаксации T1 и Т2 и установить, что компонента с большим временем релаксации T1a соответствует внутриклеточной водной фракции, а короткая Т1б - внеклеточной [21]. В моделях ОПН перераспределение тканевой воды в почечной ткани происходило в сторону внутриклеточной, с достоверным повышением на 10,5%, на 11,1%, на 11,8%, соответственно в группах одно-, двух- и трехсуточных животных, по сравнению с контролем.
Следовательно, на ранней стадии развития ОПН в клетках почек наблюдается тенденция к набуханию клеток. Накопление Н+ внутри клетки приводит к увеличению ее объема и закислению среды. Известно, что на ранних стадиях ишемии в клетках накапливаются интермедиаторы цикла Кребса - лактат, пируват и цитрат [22], что указывает на активность NАDРН-оксидазы и накопление активных форм кислорода.
В наших ранних исследованиях было установлено, что даларгин, каптоприл и налоксон (ДНК+дал., ДНК+капт., ДНК+нал.) проявляют антиапоптозное действие, а индометацин, наоборот, обладает апоптозстимулирующим эффектом (ДНК-индометацин). Применение этих модуляторов апоптоза на фоне ишемии привело к неоднозначным протонным механизмам клеточного объема почек по сравнению с контрольной группой. Но если оценивать ЯМР-показателем между экспериментальными группами (от первых до третьих суток), то прослеживаются изменения в Н+-протонных механизмах, характерных для каждого препарата. Результаты оказались следующими.
Таблица 2
Изменение времени релаксации и доли внутриклеточной воды (Ра) в клетках почек при ОПН на фоне введения модуляторов апоптоза
Период наблюдений Т1-релаксация, мсек Т2-релаксация, мсек Ра, % (Ра+Рв=100%)
Контроль 569,3±2,6 64,0±0,7 76,8±1,2
ОПН-1 +даларгин 443,4±1,8* 61,6±0,2* 80,5± 2,1*
ОПН-2+даларгин 474,8±1,5* 63,9±0,5* 82,3±1,3*
ОПН-3+даларгин 454,2 ±1,4* 61,4±0,7* 79,9 ± 1,4*
ОПН-1 +налоксон 530,5± 2,8* 71,6±0,5* 80,7± 1,8*
ОПН-2+налоксон 534,5± 2,3* 75,3±0,8 82,3±1,6*
ОПН-3+налоксон 522,2 ±2,8* 72,4±0,7 80,9± 1,3*
ОПН-1 +каптоприл 600,8 ±1,3* 66,3±0,2 80,3± 1,5*
ОПН-2+каптоприл 613,3±1,8* 68,3±0,4* 81,4± 1,5*
ОПН-3+каптоприл 610,5±1,4* 67,1±0,6* 79,7± 1,2*
ОПН-1 +индометацин 612,5± 1,2* 65,6±0,6* 85,6± 2,4
ОПН-2+индометацин 616,5± 1,5 66,6±0,6* 87,3± 3,2
ОПН-3+индометацин 582,5± 1,4* 64,5±0,5* 86,6± 2,4
Примечание:* - различия достоверны относительно групп ОПН, р<0,05
Даларгин - синтетический лей-энкефалин в течение трех суток развития ОПН вызывал достоверное понижение Т1 и недостоверное - Т2 (табл. 2) по сравнению с контролем, при этом клеточный объем оставался несколько увеличенным. Но от 1-х суток к 3-м наметилась тенденция к увеличению показателя Т1 и понижения Т2. Такая динамика свидетельствует о росте кристаллической фракции воды [23]. При этом доля внутриклеточной воды уменьшается достоверно к 3-м суткам, т.е. прослеживается тенденция к дегидратации ткани.
При введении антагониста даларгина [4] - налоксона установлено понижение Т1 и повышение Т2 по сравнению с контролем и достоверная гидратация ткани почек. В сравнении с группами ОПН наблюдалось уменьшение спин-решеточной релаксации (Т1), и без изменений оставалась спин-спиновая (Т2). Такое сочетание Т1 и Т2 характерно для липидной фракции накоплений в клетке. Перераспределение тканевой воды происходило в сторону внутриклеточной, т.е. прослеживалась тенденция к дегидратации ткани [23].
Блокада ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) каптоприлом приводила в почках к понижению как Т1-релаксации, так и Т2-релаксации от первых к третьим суткам (табл. 2). Такая динамика показателей характеризуется быстрым протонным обменом и уменьшением плотности гидрированного слоя воды, что сопровождается дегидратацией ткани, и корреляционная связь со степенью апоптоза с долей Ра была положительной.
Введение индометацина (блокатора циклооксигеназы) поддерживало повышенное значение времени релаксации и достоверно изменяло перераспределение тканевой воды во внутриклеточное пространство по сравнению с контролем (табл. 2). На фоне развития ОПН продольная релаксация (Т1) достоверно не изменялась, а поперечная (Т2) - понижалась. Такое сочетание временных составляющих релаксации указывает, что сигнал исходит от кристаллической фракции воды. В течение трех суток прослеживалось достоверное набухание клеток почек, связанное с тенденцией к гидратации под действием индометацина (табл. 2).
Следовательно, можно отметить, что даларгин, налоксон и каптоприл, обладающие антиапоптическим действием, изменяют внутриклеточный объем с тенденцией к дегидратации ткани, а индометацин, стимулирующий апоптоз, вызывает увеличение клеточного объема. Данные ЯМР-релаксометрии достоверно коррелируют с содержанием фрагментированной ДНК в клетках почек.
Таким образом, ранняя стадия ОПН, сопровождаемая стимуляцией апоптических процессов в клетках почек, характеризуется незначительным увеличением клеточного объема, что связано не только дезинтеграцией плазматической мембраны, нарушением транспорта ионов натрия и воды, вследствие дисфункции почек, но и, по-видимому, за счет изменения активности ионных обменников, закисления среды, т.е. запуска механизмов программируемой клеточной гибели, на что указывает положительная корреляционная связь. Динамика изменения Н+-протонных механизмов свидетельствует о медленном обмене протонами между свободной и гидрированной фракциями тканевой воды. Применение модуляторов апоптоза различного действия подтверждает наше предположение об участии Н+-протонных механизмов в регулировании клеточного объема. Однако более глубокий анализ вклада различных механизмов в наблюдаемое изменение клеточного объема нуждается в дальнейшем всестороннем изучении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бевза О.В. Са2+/ Н+ обмш ^зь плазматичну мембрану в системi механiзмiв транспортування юшв Са та водню // Укр. бiохiм. журнал. - 2003. - Т. 75, № 5. - С. 28-41.
2. Ермоленко В.М. Острая почечная недостаточность. Нефрология / под. ред. И.Е. Тареевой. - М.: Медицина, 2000. - 2-е изд., перераб. и доп. - С. 580-595.
3. Комаревцева И.А. Способ определения водно-солевого баланса организма in vitro: авт. св. 1682927, 07.10.91, Бюл. № 37. - 1 с.
4. Лишманов Ю.Б., Маслов Н.М., Маслова Л.В., Кривоногов Н.Г. Опиоидные пептиды в динамике физиологического и «патологического» стресса // Пат. физитол. и экпер. терапия. - 1990. - № 4. - С. 79.
5. Anbari K., Schults R.M. Effect of sodium and betaine in culture media on development and relative rates of protein synthesis in preimplantation mouse embryos in vitro // Mol. Reprod. Dev. - 1993. - Vol. 35. - P. 2428.
6. Brugnara C., Bunn H.F., Tosteson D.C. Regulation of erythrocyte cation and water content in sickle cell anemia // Science. - 1986. - Vol. 232. - P. 388-390.
7. Brugnara C., Franceschi L.De., Alper S.L. Inhibition of Ca2+-dependent K+ transport and cell dehydration in sickle erythrocytes byclotrimazole and other imidazole derivatives // J. Clin. Invest. - 1993. - Vol. 92. -P. 520-526.
8. Brugnara C., Kopin A.S., Bunn H.F. [et al.]. Regulation of cation content and cell volume in hemoglobin erythrocytes from patients with homozygous hemoglobin C disease // J. Clin. Invest. - 1985. -Vol. 75. - P. 1608-1617.
9. Brundage R.A., Fogarty K.E., Tuft R.A. [et al.]. Calcium gradients underlying polarization and chemotaxis of eosinophils // Science. - 1991. - Vol. 254. - P. 703-706.
10. Brunner M., Schraner E.M., Wild P. Cellular changes in rat parathyroids provoked by progesterone and testosterone// Cell Tissue Res. - 1992. - Vol. 268. - P. 283-286.
11. Buche A., Colson P., Houssier C. Organic osmotic effectors and chromatin structure // J. Biomol. Struct. Dyn.
- 1990. - Vol. 8. - P. 601-618.
12. Buche A., Colson P., Houssiere C. Effect of organic effectors on chromatin solubility, DNA-histone H1 interactions, DNA and histone H1structures // J. Biomol. Struct. Dyn. - 1993. - Vol. 11. - P. 95-11.
13. Busch A.E., Waldegger S., Herzer T. [et al]. Molecular basis of K protein regulation by oxidation or chelation // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 3638-3641.
14. Burg M.B. Role of aldose reductase and sorbitol in maintaining the medullary intracellular milieu // Kidney Int. - 1988. - Vol. 33. - P. 635-641.
15. Burg M.B. Molecular basis for osmoregulation of organic osmolytes in renal medullary cells // J. Exp. Zool. -1994. - Vol. 268. - P. 171-175.
16. Caplan M.J., Stow J.L., Newman A.P. [et al.]. Dependence on pH of polarized sorting of secreted proteins // Nature. - 1987. - Vol. 329. - P. 632-635.
17. Carrenter D.O., Fejtl M., Ayrapetyan S. [et al.]. Dynamic changes in neuronal volume resulting from osmotic and sodium transport manipulations // Acta Biol. Hung. - 1992. - Vol. 4. - P. 39-48.
18. Cemerekic D., Sackin H. Substrate activation of mechanosensitive, whole cell currents in renal proximal tubule // Am. J. Physiol. - 1993. - Vol. 264. - P. F697-F714.
19. Chacon E., Reece J.M., Nieminen A.L. [et al.]. Distribution of electrical potential, pH, free Ca2+, and volume inside cultured adult rabbit cardiac myocytes during chemical hypoxia: a multiparameter digitized confocal microscopic study // Biophys. J. - 1994. - Vol. 66. - P. 942-952.
20. Chan H.C., Fu W.O., Chung Y.W. [et al.]. Swelling-induced anion and cation conductances in human epididymal cells // J. Physiol. (Lond.). - 1994. - Vol. 478. - P. 449-460.
21. Fullerton G. NMR relaxation of proton in tissues and other macromolecular water solution // Magn. Res. Imag.
- 1992. - Vol. 1. - P. 209-228.
22. Kimmich R., Nusser W., Witer F. In vivo NMR field-cycling relaxation spectrpscopy reveals O14, H1-relaxation sinks in the back bones of proteins // phys. med. Biol. - 1994. - Vol. 29, № 5. - P. 593-596.
23. Ling G.N., Tucser M. A physical theory of the biving state: application to water and solute distribution // In: The state of water in the cells. - 1988. - P. 899-913.
24. Ling, G.N. A quantitative theory of solute distribution in cell water according to molecular size // Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. - 1993. - Vol. 25, № 3. - P. 145-175.
Дроздова Галина Александровна, доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии медицинского факультета «Российский университет дружбы народов», Россия, 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8
Белоус Юрий Александрович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры психотерапии и наркологии факультета повышения квалификации медицинских работников «Российский университет дружбы народов», Россия, 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 21, корп. 3, тел./факс: (495) 476-25-02
Комаревцева Ирина Александровна, доктор медицинских наук, профессор кафедры медицинской химии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1.
Комаревцева Екатерина Витальевна, кандидат медицинских наук кафедра урологии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 19104, г Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1Г.
