CC BY
33ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
О.А. Ёршик, Г.Н. Бузук
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО
COMARUM PALUSTRE К
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
С помощью двух методик изучена антиоксидантная активность корневищ с корнями, стеблей и листьев сабельника болотного. С использованием методики, основанной на восстановлении DPPH (2,2 — дифенил — 1 пикрилгидразил С18Р12М5Об) антиоксидантом, установлено, что проантоцианидины вегетативных органов сабельника болотного снижают содержание свободным радикалов на 41,7-52,5%. Данная антиоксидантная активность сопоставима с активностью 1% раствора кверцетина.
По результатам реакции образования фосфорномолибденового комплекса антиоксидантная активность выделенной и очищенной на сорбенте Sepha-dex LH20 суммы проантоцианидинов сопоставима с активностью 0,08% раствора аскорбиновой кислоты.
Антиоксидантная активность проантоцианидинов вегетативныгх органов сабельника болотного уменьшается в ряду: листья > стебли > корневища с корнями.
Ключевые слова: антиоксидантная активность, сабельник болотный, проан-тоцианидины.
ВВЕДЕНИЕ
Конденсированные дубильные вещества - полимерные производные ка-техинов, лейкоантоцианидинов и других восстановленных форм флавоноидов [1]. Они, как правило, представляют собой линейные полимеры или отдельные мономеры (катехины и лейкоантоцианидины, соединенные С-С связью), которые способны к ограниченному вращению вокруг соединяющей их связи. В результате этого молекула может приобретать стабильную спиральную конформацию с фенольными гидроксилами, расположенными по периферии [2]. Кислотный гидролиз (деполимеризация) данного класса природных соединений приводит к образованию ан-тоцианидинов, отсюда и название данной группы БАВ - проантоцианидины.
Проантоцианидины по распространенности занимают четвертое место после целлюлозы, гемицеллюлоз, лигнина и являются в растениях важными вторичными метаболитами [3].
С точки зрения химического строения
проантоцианидины представляют собой полимерные флаван-3-олы, которые имеют типичный С6-С3-С6-флавоноидный скелет [4], катехиновые мономеры имеют 2 асимметрических центра в положениях 2 и 3 [5] (рисунок 1).
Свободные радикалы играют важную роль в патогенезе более чем 100 заболеваний человека. Они запускают цепные реакции, которые приводят к повреждению клеток и тканей. Фенольная структура проантоцианидинов дает возможность их молекулам связывать свободные радикалы [6,7], снижая интенсивность перекис-ного окисления липидов. Благодаря тому, что проантоцианидины являются мощными антиоксидантами, они обладают широким спектром биологической активности [8,9].
Антиоксидантная активность семян и кожуры плодов винограда, коры сосны белой превышает антиоксидантную активность некоторых синтетических препаратов: глютаминил-цистеинил-глицина, токоферола, эрготионеина, тролокса, бути-локсианизола, бутилокситолуола [10].
К-
3^2
Рисунок 1 - Типичная структура флаван-3-ола
Антиоксидантная активность про-антоцианидинов зависит от степени полимеризации, галлоизации (количество остатков галловой кислоты в молекуле), сродства к белкам, коэффициента распределения между липидной и водной фазами, природы мономерных звеньев, положения межмономерных связей [11].
Проантоцианидины в природе встречаются в виде смеси олигомеров различной степени полимеризации: растворимых в воде, содержащих от двух до шести единиц катехина, а также нерастворимых в воде полимеров со степенью полимеризации от 7 и выше, которые представляют собой основную (до 80%) часть проанто-цианидиновых комплексов [12].
В работах [13,14] установлена связь между длиной цепи проантоцианиди-нов и их антиоксидантной активностью: мономеры, димеры и тримеры обладают большей антиоксидантной активностью в водной фазе, а высокомолекулярные - в липофильной. Олигомеры проантоциани-динов семян винограда оказывают более мощную антиоксидантную активность, по сравнению с мономерами и полимерами.
Целью данной работы является изучение антиоксидантной активности извлечений из вегетативных органов сабельника болотного и очищенной фракции суммы проантоцианидинов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получали извлечения из вегетативных органов сабельника болотного. Для этого аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц 250 мкм. Около 0,500 г измельченного сырья помещали в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 20,0 мл 70% спирта этило-
вого, закрывали пробкой, взвешивали с погрешностью ±0,01 г, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После охлаждения до комнатной температуры колбу с пробкой взвешивали и доводили до первоначальной массы 70% спиртом этиловым. Содержимое колбы центрифугировали в течение 10-15 мин со скоростью 2000-3000 об/мин и собирали надосадочную жидкость. Экстракцию проантоцианидинов проводили с учетом ранее установленных оптимальных условий [15].
Сумму проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного выделяли на сорбенте Sephadex КН 20. Около 0,50 г корневищ с корнями сабельника болотного, измельчённых до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром пор 250 мкм, экстрагировали 20 мл 70% спирта этилового на кипящей водяной бане в течение 20 минут. Готовое извлечение охлаждали и центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 15 минут. Колонку, содержащую 500 мг сорбента Sephadex КН-20, предварительно кондиционировали 96% спиртом этиловым и пропускали 20 мл полученного извлечения. Затем элюировали 96% спиртом этиловым со скоростью 1 мл/мин. Элюирование проводили до тех пор, пока при 280 нм значение оптической плотности новых порций элюата не будет постоянным. В качестве раствора сравнения при спектрофотометрии использовали воду очищенную. Фракцию суммы проанто-цианидинов элюировали 70% ацетоном водным. Раствор полученной фракции выпаривали, остаток растворяли в 96% спирте этиловом [16].
Антиоксидантную активность про-антоцианидинов сабельника болотного
изучали по методике, основанной на восстановлении DPPH (2,2 - дифенил - 1 пикрилгидразил С18Н12К5О6, М=394,33). Снижение пурпурно-синей окраски раствора DPPH контролировали измерением оптической плотности при длине волны 517 нм [17].
Приготовление раствора: к 0,6 мл испытуемого раствора прибавляли 4,2 мл
0,006% раствора DPPH в метаноле. Через 30 мин измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 517 нм. Компенсационный раствор: 0,6 мл 70% спирта этилового и 4,2 мл 0,006% раствора DPPH в метаноле.
Степень ингибирования свободных радикалов рассчитывали по формуле:
А(%)=
(Л0 - Лі) х 100 ■V; ,
где А0 - оптическая плотность раствора DPPH;
А1 - оптическая плотность раствора DPPH после добавления антиоксиданта.
Также для определения антиокси-дантной активности применяли методику, основанную на образовании окрашенного фосфорномолибденового комплекса. Восстановление Мо(У1) в Мо(У) в кислой среде сопровождается появлением зеленого окрашивания раствора. Реакцию контролировали измерением оптической плотности при длине волны 695 нм спектрофотометрическим методом [18].
Фосфорномолибденовый реактив: 0,6 М раствор серной кислоты; 28 тМ фосфата натрия; 4 тМ молибдата аммония.
Приготовление раствора: к 0,7 мл испытуемого раствора прибавляли 7 мл фосфорномолибденового реактива, при-
соединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане при 95°С в течение 90 мин. Раствор охлаждали до комнатной температуры. Компенсационный раствор: 0,7 мл 70% спирта этилового, 7 мл фосфорномолибденового реактива. Раствор нагревали на водяной бане при 95°С в течение 90 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изученные вегетативные органы сабельника болотного обладают антиокси-дантной активностью, снижая содержание свободных радикалов на 41,7-52,5%. Данная активность сопоставима с активностью кверцетина. Снижение содержания свободных радикалов проантоциани-динами корневищ с корнями на 41,7±1,1% и стеблей - 51,4±1,6% сабельника болотного свидетельствует об их схожем составе смеси проантоцианидинов. Проявление антиоксидантной активности (52,5±1,5) листьями сабельника болотного при низком содержании в них про-антоцианидинов (1,45±0,06) может быть обусловлено содержанием мономерных катехинов (таблица 1). Антиоксидантная активность проантоцианидинов вегетативных органов сабельника болотного уменьшается в ряду: листья > стебли > корневища с корнями.
Антиоксидантная активность выделенной и очищенной на сорбенте Sep-hadex КН 20 суммы проантоцианидинов сабельника болотного сопоставима с активностью раствора 0,08% аскорбиновой кислоты. Антиоксидантная активность проантоцианидинов вегетативных органов сабельника болотного уменьшается в ряду: листья > стебли > корневища с корнями (таблица 2).
Таблица 1 - Степень ингибирования свободных радикалов (А±ЛА, %) проантоцианидинами (Х±Лх, %) сабельника болотного и 1% спиртового раствора
кверцетина
Образец Х±Лх, % (п=5) А±ЛА, % (п=5)
Корневище с корнями 4,63±0,19 41,7±1,1
Стебель 4,48±0,19 51,4±1,6
Лист 1,45±0,06 52,5±1,5
Кверцетин — 52,5±0,7
Таблица 2 - Антиоксидантная активность проантоцианидинов (X±Aх, %) сабельника болотного, 0,08% раствора аскорбиновой кислоты, выделенной и очищенной на сорбенте Sephadex LH 20 суммы проантоцианидинов (в пересчете на сухой остаток)
Образец Х±Дх, (%) (n=5) A695 ±A^ (n=5)
Корневище с корнями 4,63±0,19 0,382±0,010
Стебель 4,48±0,19 0,607±0,04
Лист 1,45±0,06 0,648±0,08
Сумма проантоцианидинов 5,0*10"3±0,4*10"3 0,83±0,15
Аскорбиновая кислота — 0,84±0,05
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Доказано проявление антиоксидант-ной активности очищенной фракции суммы проантоцианидинов сабельника болотного. Проявление антиоксидантной активности проантоцианидинами вегетативных органов сабельника болотного согласуется по двум методикам и уменьшается в ряду: листья > стебли > корневища с корнями.
SUMMARY
O.A. Yorshyk, G.N. Buzuk ANTIOXIDANT ACTIVITY OF COMARUM PALUSTRE L.
There was studied the antioxidant activity of rhizomes with roots, caules and leaves of Comarum palustre L. by two methods. According to the method tased on the reduction DPPH (2,2 - diphenyl - 1 picrylhydra-zyl С18Н12^О6) by antioxidant, i is found that proanthocyanidins of vegetative organs of Comarumpalustre L. bring down the content of free radicals by 41,7-52,5%. Such antioxidant activity is comparable to the activity of 1% solution of quercetin.
During the conducting of method of phosphomolybdic complex formation with the amount of proanthocyanidins, isolated and purified on Sephadex LH 20 sorbent, it was shown a that the antioxidant activity is comparable with the activity of 0,08% ascorbic acid solution.
The antioxidant activity of proanthocy-anidins of vegetative organs of Comarum palustre L. reduced in the line: leaves > caules > rhizomes with roots.
Keywords: antioxidant activity, Co-marum palustre L., proanthocyanidins.
ЛИТЕРАТУРА
1. Запрометов, М.Н. Основы биохи-
мии фенольных соединений / М.Н. Запрометов. - М.: Высш. школа, 1974. - 273 с.
2. Fine, A.M. Oligomeric Proanthocy-anidin Complexes: History, Structure, and Phytopharmaceutical Applications / A.M. Fine // Alternative Medicine Review. -2000. - Vol. 5, N 2. - Р 8.
3. Bate-Smith, E. Phytochemistry of procyanidins / E. Bate-Smith // Phytochemistry. - 1975. - Vol. 14. - P. 1107-1113.
4. Bravo, L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance / L. Bravo // Nutr. Rev. - 1998. -Vol. 56. - P. 317-333.
5. Kofink, M. (-)-Catechin in Cocoa and Chocolate: Occurence and Analysis of an Atypical Flavan-3-ol Enantiomer / M. Kofink // Molecules. - 2007. - Vol. 12. - P. 1274-1288.
6. Activity of grape polyphenols as inhibitors of the oxidation of fish lipids and frozen fish muscles / M. Pazos [et al.] // Food Chem. - 2005. - Vol. 92. - P. 547-55
7. Fine, A.M. Oligomeric Proanthocy-anidin Complexes: History, Structure, and Phytopharmaceutical Applications / A.M. Fine // Alternative Medicine Review. -2000. - Vol. 5, N 2. - Р 8.
8. Saraf, S. Flavonoids: A Nutritional Protection against oxidative and UV induced cellular damages: review / S. Saraf [et al.] // Phcog. Rev. - 2007. - Vol. 1. - P. 30-40.
9. Yilmaz, Y. Health aspects of functional grape seed constituents: review / Y Yilmaz, R.T. Toledo // Trends in Food Science & Technology. - 2004. - Vol. 15. - P. 422-433.
10. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: Mechanism and actions / M.A. Soobrattee [et al.] // Mutation Research. - 2005. - Vol. 579. - P. 200-213.
11. Спрыгин, В.Г. Природные олигомерные проантоцианидины - перспективные регуляторы метаболических на-
рушений / В.Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнеро-ва // Вестник ДВО РАН. - 2006. - №2. -С. 81-90.
12. Haslam, E. Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs: possible modes of action / E. Haslam // J. Nat. Prod. - 1996. -Vol. 59, N 2. - Р. 205-215.
13. Absorption and urinary excretion of procyanidin B2 [epicatechin-(4P-8)-epicatechin] in rats / S. Baba [et al.] // Free Radical Biology & Medicine. - 2002. - Vol. 33, N 1. - P. 142-148.
14. Influence of Oligomer Chain Length on the Antioxidant Activity of Procyani-dins / S.B. Lolito [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. -2000. - Vol. 276, N 3. - P. 945-951.
15. Ёршик, О.А. Количественное определение проантоцианидинов в сабельнике болотном Comarum palustre L. / О.А. Ёршик, Г.Н. Бузук // Вестник фармации. - 2007. - № 4. - С. 10-17.
16. Ёршик, О.А. Выделение суммы проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного на сорбенте Sepha-dex LH-20 / О.А Ёршик, Г.Н. Бузук // Актуальные вопросы современной медицины и фармации: материалы 61-ой итоговой научно-практической конференции сту-
дентов и молодых ученых университета, посвященной 75-летию его образования. Витебск, 23-24 апреля 2009 г. / ВГМУ; редкол.: А.П. Солодков [и др.]. - Витебск, 2009. - С. 246-248.
17. Determination of low molecular weight polyphenolic constituents in grape (Vitis vinifera sp.) seed extracts: Correlation with antiradical activity / R. Guendez [et al.] // Food Chem. - 2005. - Vol. 89. - P. 1-9.
18. Spectrophotometric Quantitation of Antioxidant Capacity through the Formation of a Phosphomolybdenum Complex: Specific Application to the Determination of Vitamin E / P. Prieto [et al.] // Anal. Biochem. -1999. - Vol. 269. - P. 337-341.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра фармакогнозии с курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8 (0212) 37-09-29,
Ершик О.А.
Поступила 16.09.2013 г.
