CC BY
56
УДК 615.241.3
Е.н. цыбикова1, и.п. Убеева1, д.н. оленников2, л.м. танхаева2, Е.Б. петров2
антиоксидантная Активность отвара бад байкальский-5 в экспериментах in vitro
1 Бурятский государственный университет (Улан-Удэ) 2 Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ)
Изучено влияние отвара БАД Байкальский-5 на процессы свободно-радикального окисления в модельных системах in vitro. В ходе исследований выявлено, что исследуемое фитосредство обладает, высокой общей антиоксидантной емкостью и. антирадикальным действием. Установлено, что выраженная антиоксидантная, активность фитосредства обусловлена входящими, в его состав фенольными соединениями, причем, наибольшее влияние отмечено для. лютеолин-7-гликозида и. розмариновой кислоты..
Ключевые слова: Байкальский-5, фенольные соединения, антиоксидантная активность, ВЭТСХ, ДФПГ-метод
antioxidant activity of BAiKAL’sKiY-5 food supplement DEcocTioN in vitro models
E.N. Tsybikova1, I.P. Ubeeva1, D.N. Olennikov2, L.M. Tankhaeva2, E.V. Petrov2
1 Buryat state university, Ulan-Ude
2 Institute of general and experimental biology SB RAS, Ulan-Ude
The effect of food supplements Baikal'skiy-5 decoction on free-radical oxidation processes in model systems in vitro. The studies found that the investigated, phytoremedy has a high total antioxidant capacity and radical-scavenging action. Established, that the pronounced, antioxidant activity of phytoremedy due to its phenolic compounds, with, the greatest effect observed for luteolin-7-glycoside and. rosmarinic acid.
Key words: Baikal'skiy-5, phenolic compounds, antioxidant activity, HPTLC, DPPH-assay
Проблемы химической регуляции окислительного стресса и поиск биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, находятся в центре внимания исследователей различных направлений экспериментальной биологии и медицины. В Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН разработан состав комплексного растительного средства БАД Байкальский-5 (РУ №003217.Р.643.11.2001, ТУ 9373-025-05148925-2001) в качестве общеукрепляющего средства, улучшающего функциональное состояние дыхательной системы. Целью настоящей работы является исследование антиоксидантной активности БАД Байкальский-5 в экспериментах in vitro.
материал и методы
Растительное сырье приобретено через аптечную сеть: плоды Anethum graveolens, корни с корневищами Inulahelenium, трава Thymus serpyllum — АО «Красногорсклексредства», корни Glycyrrhiza uralensis, трава Viola tricolor — ООО «Алтай-Фарм». Все используемое растительное сырье соответствовало требованиям фармакопейных статей. В работе использовали следующие стандартные образцы веществ сравнения: эриоцитрин (Chroma Dex), кофейная, хлорогеновая, розмариновая кислоты, лютеолин-7-глюкозид (Fluka), скополетин, рутин (Acros Organics), дифенилпикрилгидразил (ДФПГ, MP Biomedicals Inc.); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре
UV-Vis-mini (Shimadzu) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Фитомикс БАД Байкальский-5 готовили из измельченного до размера частиц 1—3 мм растительного сырья A. graveolens, G. uralensis, I. helenium, Th. serpyllum, V. tricolor в соотношении 1 : 1 : 1 : 1 : 1. Отвары готовили общепринятым способом (1 г растительного сырья на 100 мл воды).
Содержание экстрактивных веществ определяли гравиметрическим методом, суммарное содержание фенольных соединений — по методу Фолина.
Качественный состав фенольных соединений устанавливали с применением метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). ВЭТСХ-анализ проводили на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.). Денситограммы получали с использованием оборудования Сорбфил (УФ-облучатель 254/365 нм, сканер; все Имид Ltd.) и обрабатывали с применением пакета программ Сорбфил ТСХ Видеоденситометр 2.0 (Имид Ltd.). Для выявления веществ, ответственных за проявления антирадикального эффекта хроматограммы обрабатывали методом погружения 1%-ным раствором ДФПГ в метиловом спирте, после чего их быстро просушивали в токе воздуха при температуре не выше 30 °С и через 15 мин после начала проявления проводили сканирование.
Антиоксидантную активность определяли с применением следующих методик: общая антиоксидантная емкость [13], антирадикальная активность (ДФПГ-метод) [14]. Корреляционный
анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.), статистическую обработку — согласно рекомендациям [1].
результаты и их обсуждение
БАД Байкальский-5 (далее Б-5) представляет собой фитомикс из равного количества пяти видов растительного сырья — плодов Anethum graveolens (укроп пахучий), корней Glycyrrhiza uralensis (солодка уральская) и Inula helenium (девясил высокий), травы Thymus serpyllum (чабрец ползучий) и Viola tricolor (фиалка трехцветная). Для проведения сравнительных исследований были получены образцы отваров индивидуальных растений, общая характеристика которых приведена в таблице 1.
Общее содержание экстрактивных веществ в отваре БАД Байкальский-5 составляет 3,24 мг/мл
(23,98 % от масс сырья). Наибольший вклад в данный показатель вносит присутствие I. helenium — 38 % от общего содержания, что объясняется высоким содержанием водорастворимых полисахаридов (30 — 45 %), в частности фруктанов типа инулина, а наименьшее — A. graveolens (7 %); средние показатели отмечены для V. tricolor (22 %), G. uralensis (20 %) и Th. serpyllum (13 %) (рис. 1а).
В ходе предварительных экспериментов было показано, что проявление антиоксидантного эффекта исследуемого фитосредства обусловлено присутствием фенольных соединений, поэтому нами была проведена количественная оценка их содержания. Содержание данного класса соединений в отваре БАД Байкальский-5 составляет 188,3 ± 5,7 мкг/мл (5,80 % в пересчете сухой остаток), и обусловлено входящим в состав сбора Th. serpyllum (в отваре — 557,2 мкг/мл), фенольные
Таблица 1
Содержание экстрактивных веществ и фенольных соединений в отварах БАД Байкальский-5 и его компонентов
Отвар Экстрактивные вещества Общее содержание фенольных соединений
мг/мл отвара % * мкг/мл отвара % * % в отваре
Anethum graveolens 1,10 ± 0,02 9,31 ± 0,18 125,5 ± 4,1 11,36 ± 0,34 0,013
Glycyrrhiza uralensis 3,32 ± 0,07 28,25 ± 0,56 197,4 ± 6,0 5,91 ± 0,18 0,020
Inula helenium 8,42 ± 0,17 53,12 ± 1,06 136,5 ± 4,2 2,11 ± 0,06 0,014
Thymus serpyllum 2,21 ± 0,04 17,82 ± 0,35 557,2 ± 16,5 25,23 ± 0,76 0,055
Viola tricolor 3,64 ± 0,07 29,74 ± 0,59 199,3 ± 6,2 5,56 ± 0,17 0,020
Байкальский-5 3,24 ± 0,06 23,98 ± 0,47 188,3 ± 5,7 5,80 ± 0,17 0,019
Примечание: * - в пересчете на сухой остаток отвара.
TS
Рис. 1. Вклад компонентов БАД Байкальский-5 в общее содержание экстрактивных веществ (а), фенольных соединений (б), общую антиоксидантную емкость (в) и антирадикальную активность (г). Anethum graveolens (AG), Glycyrrhiza uralensis (GU), Inula helenium (IH), Thymus serpyllum (TS), Viola tricolor (VT).
соединения которого составляют около 50 % от общего содержания; по 16 % приходится на G. ura-lensis и V. tricolor (рис. 1б).
Общая антиоксидантная емкость отвара БАД Байкальский-5 составляет 742 мкг/мл (228,06 мг/г в пересчете на сухой остаток); для наиболее активного компонента — Th. serpyllum, данная величина составляет 1077 мкг/мл отвара (489,77 мг/г сухого остатка) (табл. 2), причем вклад Th. serpyllum и G. uralensis в сумме составляет 68 % (37 и 31 %, со-отвественно) (рис. 1в).
Суммарный препарат обладает выраженной антирадикальной активностью — IC50 64,49 мкг/мл; компоненты по степени убывания данного действия располагаются следующим образом: Th. serpyllum (6,13 мкг/мл) > A. graveolens > V. tricolor > I. helenium > G. uralensis (250,98 мкг/мл) (табл. 2). Присутствие Th. serpyllum обуславливает до 81 % от общей величины IC50 (рис. 1г).
Применение регрессионного анализа показало, что для пар «содержание фенольных соединений — общая антиоксидантная емкость» и «содержание фенольных соединений — антирадикальная активность» наблюдаются линейные зависимости с высокими значениями коэффициентов корреляции
0,8063 и 0,6907 соответственно (рис. 2).
На основании проведенных исследований A. graveolens и Th. serpyllum отнесены к наиболее
активным, присутствие которых обуславливает проявление данного вида активности. Согласно данным литературы плоды A. graveolens содержат до 3 — 4 % эфирного масла, доминирующим компонентами которого является D-карвон (50 — 60 %) и лимонен (30 — 40 %); также обнаружены транс- и цис-дигидрокарвон, транс- и цис-карвеол, D- и
I-дигидрокарвеол, а- и у-терпинен и др. [3]; липиды [8]; фенольные кислоты — кофейная, феруловая, хлорогеновая [5]; кумарины — скополетин, эску-летин, умбеллиферон, бергаптен, умбеллипренин,
8.8-диметил-6,7-дигидро-2Н,8Н-бензо[1,2Ь;5,4Ь'] дипиран-2,6-дион [5]; флавоноиды — кверцетини кемпферол-3-О-глюкурониды, кверцетин- и изорамнетин-3-О-глюкозиды, -3-О-галактозиды и -3-О-рутинозиды [16], виценин [6]; бензоксан-тоновый гликозид — дилланозид [9, 12] в составе водорастворимых компонентов плодов A. graveolens были обнаружены монотерпены — (4S,8S)-
8.9-дигидрокси-8,9-дигидрокарвон (3,5 x 10-4 %), (4S,8 S)-8,9-дигидрокси-8,9-дигидрокарвон-9-О^-глюкопиранозид (3,3 x 10-3 %), (1S,4S,8S)-
8.9-дигидрокситетрагидрокарвон (2 x 10-4 %), (1S,4S,8S)-8,9-дигидрокситетрагидрокарвон-9-О^-глюкопиранозид (1,1 x 10-2 %), (1S,2S,4R)-п-мент-8-ен- 1,2-диол- 1-О-ß-глюкопиранозид (4,0 x 10-4 %), (1£,2£,4Я)-п-мент-8-ен-1,2-диол-2-О^-глюкопиранозид (5,9 x 10-3 %), (1S,2S,4R)-r-
Таблица2
Общая антиоксидантная емкость (TAC) и антирадикальная активность (DPPH) отваров БАД Байкальский-5 и его
компонентов
Отвар TAC DPPH, IC50, мкг/мл *
мкг/мл отвара мг/г *
Anethum graveolens 331 ± 9 301,36 ± 9,04 47,49 ± 0,94
Glycyrrhiza uralensis 930 ± 28 281,97 ± 8,46 250,98 ± 5,02
Inula helenium 190 ± 6 29,66 ± 0,89 197,20 ± 3,94
Thymus serpyllum 1077±32 489,77 ± 14,69 6,13 ± 0,12
Viola tricolor 443 ± 14 123,06 ± 3,69 104,41 ± 2,09
Байкальский-5 742 ± 22 228,86 ± 6,86 64,49 ± 1,28
Примечание: * - в пересчете на сухой остаток отвара.
рис. 2. Корреляционные зависимости «содержание фенольных соединений - общая антиоксидантная емкость» (а) и «содержание фенольных соединений - антирадикальная активность» для БАД Байкальский-5. По оси абсцисс - содержание фенольных соединений, % (в пересчете на сухой остаток отвара); по оси ординат для (а) - TAC, мг/г (в пересчете на сухой остаток отвара), для (б) - IC50, мкг/мл.
рис. 3. Антирадикальная активность индивидуальных соединений (ДФПГ-метод). LG - лютеолин-7-глюкозид, ChA - хлорогеновая кислота, CA - кофейная кислота, Rt - рутин, EC - эриоцитрин, RA - розмариновая кислота, Sp - скополетин. TS - отвар Thymus serpyllum, AG - отвар Anethum graveolens. По оси ординат - lC50, мкг/мл.
мент-8-ен-1,2-диол-2-0-р-апиофуранозил-(1^-6)-Р-глюкопиранозид (1,7 х 10-3 %), (15,2Д,4Д,85)-п-ментан-2,8,9-триол-2-0 -р-глюкопиранозид (3,6 х 10-3 %), (1^2Л,4Л,8Л)-п-ментан-2,8,9-триол-
2-О-р-глюкопиранозид (6,0 х 10-4 %), (1S,2S,4Л)-п-ментан-1,2,8-триол-2-0-р-глюкопиранозид (2,5 х 10-4 %); ароматические соединения — шаше-нозид I (5,0 х 10-4 %), сирингин (8,3 х 10-3 %), ика-ризид Б2 (4,5 х 10-4 %), бензил-р-глюкопиранозид (6,0 х 10-4 %), 4-гидроксибензил-р-глюкопиранозид (2,5 х 10-4 %), 4-гидроксибензилового спирта р-глюкопиранозид (4,0 х 10-4 %), 1'-(4-гидрокси-2-метоксифенил)-пропан-2',3'-диол-Р-глюкопиранозид (2,6 х 10-3 %); алкилглико-зиды — этил-р-глюкопиранозид (4,5 х 10-4 %), глицерол-2-О-а-фукопиранозид (1,5 х 10-4 %),
3-(метоксикарбонил)пропил-р-глюкопиранозид (7,5 х 10-4 %); свободные углеводы — 2-С-метил-О-эритрит (1,5 х 10-4 %), (3Л)-2-гидроксиметилбутан-1,2,3,4-тетрит (1,5 х 10-3 %), 1-дезокси-О-ксилит (2,0 х 10-4 %), 1-дезокси-О-рибит (3,0 х 10-4 %), 1-дезокси-Д-глюцит (3,5 х 10-4 %), эритрит (2,3 х 10-3 %), Д-треит (4,0 х 10-4 %), 2-дезокси-Д-рибоно-1,4-лактон (1,6 х 10-3 %), глицерин (4,1 х 10-3 %), глюкоза (2,5 х 10-4 %), фруктоза (5,8 х 10-3 %); нуклеозиды — тимидин (6,0 х 10-4 %) и уридин (6,0 х 10-4 %).
Исследования химического состава травы Тй. serpyllum показали присутствие в ее составе эфирного масла с преобладающими в его составе тимолом (до 30 %), карвакролом (до 20 %), 1,8-цинеолом (16,3—19,0 %), карвилацетатом (18,7 %) [4, 11]; фенилпропаноидов — розмариновая, кофейная, литоспермовая кислоты [7]; флавоноидов
— лютеолин-7-рутинозид [7]; тритерпенов — ти-мусурсенолид, тимусланостенолид, тимусолеане-нолид, тимусизоланостенолид, тимусланостенил гептаноат, тимусдитерпеновый эфир, тимусте-рефталевый эфир, тимусланостениловый эфир, тимусхолестеролактон [15], 3-р-гидроксиолеан-12-ен-28-оевая кислота, ситостерол-3-О-р-глюкозид, дигидроурсоновая кислота [2]; тетратерпенов
— мастертетрафенильный эфир; сесквитерпенов
— тимуссесквитерпеноевая кислота [15]; алифатические соединения — кетопентатриаконтаноевая
кислота, кетотриаконтанол [2]. В водном отваре Th. serpyllum обнаружены розмариновая кислота (93,13 мг/г), лютеолин-7-глюкозид (10,37 мг/г), эриоцитрин (10,26 мг/г), а также лютеолин, апиге-нин, кверцетин и апигенин-7-глюкозид [10].
С применением ВЭТСХ с постхроматографи-ческой дериватизацией хроматограммы раствором ДФПГ установлено, что выраженное обесцвечивание наблюдается в зонах адсорбции 7 соединений (по убыванию интенсивности деколоризации)
— розмариновая кислота > лютеолин-7-гликозид > эриоцитрин > рутин > хлорогеновая кислота > кофейная кислота > скополетин, которые в составе фенольного комплекса отвара БАД Байкальский-5 являются доминирующими. Наибольшее содержание в исследуемом отваре отмечено для розмариновой кислоты и эриоцитрина.
Для доминирующих соединений, входящих в состав отвара БАД Байкальский-5 с использованием ДФПГ-метода установлена антирадикальная активность (рис. 3).
Выявлено, что индивидуальные соединения, входящие в состав отвара Th. serpyllum, проявляют выраженное антирадикальное действие, причем, вероятно, присутствие более активного лютеолин-7-гликозида и доминирующей в сумме фенольных соединений розмариновой кислоты является лимитирующим фактором, обуславливающим способность препарата к связыванию свободных радикалов.
литература
1. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии / К. Дёрффель. — М., 1994.
2. Aziz Sh. Studies on the chemical constituents of Thymus serpyllum / Sh. Aziz, Habib-ur-Rehman // Turk. J. Chem. - 2008. - Vol. 32. - P. 605-614.
3. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil from seeds of Anethum graveolens growing in Uzbekistan / Yili A. [et al.] // Chem. Nat. Comp. - 2009. - Vol. 45. - P. 280-281.
4. Content and composition of the essential oil of Thymus serpyllum L. growing wild in Estonia / A. Raal, U. Paaver, E. Arak, A. Orav // Medicina (Kaunas). -2004. - Vol. 40. - P. 795-800.
5. Dranik L.I. Coumarins and acids of the fruits of Anethum graveolens / L.I. Dranik, A.P. Prokopenko // Chem. Nat. Comp. - 1969. - Vol. 7. - P. 362.
6. Dranik L.I. Vicenin from the fruit of Anethum graveolens / L.I. Dranik // Chem. Nat. Comp. — 1970. - Vol. 6. - P. 263.
7. Fecka I. Quantitative determination of four water-soluble compounds in herbal drugs from Lamiaceae using different chromatographic techniques / I. Fecka, D. Raj, M. Krauze-Baranowska // Chromatographia. -2007. - Vol. 66. - P. 87-93.
8. Investigation of the oils from Anethum graveolens / M.D. Narzieva [et al.] // Chem. Nat. Comp. -1976. - Vol. 12. - P. 248.
9. Ishikawa T. Water-soluble constituents of dill / T. Ishikawa, M. Kudo, J. Kitajima // Chem. Pharm. Bull. - 2002. - Vol. 50. - P. 501 -507.
10. Kulisic T. Antioxidant activity of aqueous tea infusions prepared from Oregano, Thyme and Wild Thyme / T. Kulisic, V. Dragovic-Uzelac, M. Milos // Food Technol. Biotechnol. - 2006. - Vol. 44. -P. 485-492.
11. Loziene K. Chemical composition of the essential oil of creeping thyme (Thymus serpyllum s.l.) growing wild in Lithuania / K. Loziene, J. Vaiciüniene,
P.R. Venskutonis // Planta Med. - 1998. - Vol. 64. -P. 772-773.
12. Neue Xanthon Glucoside, Dillanosid, aus Dill, die Frucht der Anethum graveolens L. / M. Kozawa [et al.] // Chem. Pharm. Bull. - 1976. - Vol. 24. -P. 220-223.
13. Preito P. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phospho-rmolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E / P. Preito, M. Pineda, M. Aguilar // Anal. Biochem. - 1999. - Vol. 269. - P. 337-341.
14. Seyoum A. Structure-radical scavenging relationships of flavonoids / A. Seyoum, K. Asres, F.K. El-Fiky // Phytochem. - 2006. - Vol. 67. -P. 2058-2070.
15. Sharma S.K. Antiproliferative phytoconstituents from Thymus serphyllum aerial plants // in Recent Progress in Medicinal Plants: Phytochemistry and Pharmacology / S.K. Sharma, M. Ali, M.P. Singh // Eds. J.N. Govil, V.K. Singh. - Studium Press: Houston, Texas, 2003. - Vol. 2. - P. 271-294.
16. Teuber H. Flavonolglykoside der Blätter und Früchte des Dills (Anethum graveolens L.). II. Über Gewürzphenole / H. Teuber, K. Herrmann // Z. Lebensm. Unters. Forsch. - 1978. - Vol. 167. - S. 101-104.
сведения об авторах
Цыбикова Елена Николаевна - старший преподаватель кафедры общественного здоровья Бурятского государственного университета
Убеева Ираида Поликарповна - профессор, д.м.н., заведующий кафедрой инфекционных болезней Бурятского государственного университета
Оленников Даниил Николаевич - к. фарм. наук, старший научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН
Танхаева Лариса Максимовна - к. фарм. наук, старший научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН
Петров Евгений Васильевич - к. фарм. наук, старший научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН
