CC BY
38
УДК 615.241.3
Е.Н. Цыбикова I, И.П. Убеева I, Д.Н. Оленников 2, П.н. □□□□□□□□ 2, Е.В. Петров 2
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ОТВАРОВ БАД БАЙКАЛЬСКИЙ-5 И БАЙКАЛЬСКИЙ-8 В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
1 Бурятский государственный университет (Улан-Удэ) 2 Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ)
Изучено влияние отваров БАД Байкальский-5 и Байкальский-8 на процессы свободно-радикального окисления в модельных системах in vitro. В ходе исследований выявлено, что исследуемые фитосредства обладают, высокой общей антиоксидантной емкостью и антирадикальным действием. Установлено, что выраженная, антиоксидантная, активность фитосредств обусловлена входящими в его состав фенольными соединениями, причем, наибольшее влияние отмечено для. лютеолин-7-гликозида и розмариновой, кислоты.
Ключевые слова: Байкальский-5, Байкальский-8, фенольные соединения, антиоксидантная активность, ВЭТСХ, ДФПГ-метод
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BAIKALSKIY-5 AND BAIKALSKIY-8 FOOD SUPPLEMENT DECOCTION IN IN VITRO MODELS
E.N. Tsybikova, I.P. Ubeyeva, D.N. Olennikov, L.M. Tankhayeva, E.V. Petrov
Buryat State University, Ulan-Ude Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan-Ude
The effect of food supplements Baikalskiy-5 and Baikalskiy-8 decoction on free-radical oxidation processes was studied, in model systems in vitro. The studies found that the investigated, phytoremedy has a high, total antioxidant capacity and. radical-scavenging action. Established, that the pronounced, antioxidant activity of phytoremedy due to its phenolic compounds, with the greatest effect observed for luteolin-7-glycoside and. rosmarinic acid. Key words: Baikal'skiy-5, Baikal'skiy-8, phenolic compounds, antioxidant activity, HPTLC, DPPH-assay
Проблемы химической регуляции окислительного стресса и поиск биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, находятся в центре внимания исследователей различных направлений экспериментальной биологии и медицины. В Институте общей и экспериментальной биологии С О РАН разработаны комплексные растительные средства БАД Байкальский-5 и Байкальский-8 (РУ №003217.Р.643.11.2001, ТУ 9373-025-05148925-2001), в качестве общеукрепляющего средства, улучшающего функциональное состояние дыхательной системы. Целью настоящей работы является исследование антиоксидантной активности БАД Байкальский-5 и Байкальский-8 в экспериментах in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Растительное сырье приобретено через аптечную сеть: плоды Anethum graveolens, корни с корневищами Inula helenium, трава Thymus serpyllum
— АО «Красногорсклексредства», корни Glycyrrhiza uralensis, трава Viola tricolor — ООО «Алтай-Фарм». Все используемое растительное сырье соответствовало требованиям фармакопейных статей. В работе использовали следующие стандартные образцы веществ сравнения: эриоцитрин (Chroma Dex), кофейная, хлорогеновая, розмариновая кислоты, лютеолин-7-глюкозид (Fluka), скополетин, рутин (Acros Organics), дифенилпикрилгидразил (ДФПГ, MP Biomedicals Inc.); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре
UV-Vis-mini (Shimadzu) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Фитомиксы БАД Байкальский-5 и Байкальский-8 готовили из измельченного до размера частиц 1—3 мм растительного сырья в соотношении 1 : 1 : 1 : 1 : 1. Отвары готовили общепринятым способом (1 г растительного сырья на 100 мл воды).
Содержание экстрактивных веществ определяли гравиметрическим методом, суммарное содержание фенольных соединений — по методу Фолина.
Качественный состав фенольных соединений устанавливали с применением метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). ВЭТСХ анализ проводили на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.). Денситограммы получали с использованием оборудования Сорбфил (УФ-облучатель 254/365 нм, сканер; все Имид Ltd.) и обрабатывали с применением пакета программ Сорбфил ТСХ Видеоденситометр 2.0 (Имид Ltd.). Для выявления веществ, ответственных за проявления антирадикального эффекта хроматограммы обрабатывали методом погружения 1% раствором ДФПГ в метиловом спирте, после чего их быстро просушивали в токе воздуха при температуре не выше 30 °С и через 15 мин после начала проявления проводили сканирование.
Антиоксидантную активность определяли с применением следующих методик: общая антиоксидантная емкость [2], антирадикальная активность (ДФПГ-метод) [3]. Корреляционный анализ проводили с применением пакета программ Advanced
198
niiiiiiiiiiiiiiiiin її iiiiii і піт □ її її I г nil її I ii
Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.), статистическую обработку — согласно рекомендациям [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
БАД Байкальский-5 (далее Б-5) представляет собой фитомикс из равного количества пяти видов растительного сырья — плодов Anethum graveolens (укроп пахучий), корней Glycyrrhiza uralensis (солодка уральская) и Inula helenium (девясил высокий), травы Thymus serpyllum (чабрец ползучий) и Viola tricolor (фиалка трехцветная). Для проведения сравнительных исследований были получены образцы отваров индивидуальных растений.
БАД Байкальский-8 также состоит из пяти видов растительного сырья: плодов Rosa sp. (шиповник
— 25%), плодов Aronia melanocarpea L. (рябины черноплодной — 25 %), листьев Urtica dioica L. (крапивы двудомной — 20%), плодов Hippophae rhamnoides L. (облепихи крушиновидной — 15 %), листьев Mentha piperita L. (мяты перечной — 15 %) общая характеристика которых приведена в таблице 1.
В соответствии с требованиями, предъявляемыми к разработке БАД (Определение ..., 1999), проведены доклинические исследования по определению фармакологической активности, фармакотерапевтической эффективности и безопасности указанных БАД. «Байкальский-5» и «Байкальский-8» готовили из измельченного (до размера частиц 1-3 мм) растительного сырья.
Для проведения сравнительных исследований антирадикальной активности были получены образцы отваров индивидуальных растений, входящих в состав БАД «Байкальский-5» общая характеристика которых приведена в таблице 1.
В ходе предварительных экспериментов было показано, что проявление антиоксидантного эффекта «Байкальский-5» обусловлено присутствием фенольных соединений, поэтому нами была проведена количественная оценка их содержания. Содержание данного класса соединений в отваре
БАД «Байкальский-5» составляет 188,3 ± 5,7 мкг/мл (5,80 % в пересчете сухой остаток), и обусловлено входящим в состав сбора Th. serpyllum (в отваре
— 557,2 мкг/мл), фенольные соединения которого составляют около 50 % от общего содержания; по 16 % приходится на G. uralensis и V. tricolor.
Содержание в отваре фенольных соединений «Байкальский-8» составляет 516,8 ± 10 мкг/мл (16,9 % в пересчете сухой остаток), и определено входящими в состав сбора Mentha piperita (746,0 ± 14,9, 32,9 % в пересчете сухой остаток), Rosa canina (927,4 ± 18,5, 25,8 % в пересчете сухой остаток).
Общая антиоксидантная емкость отвара БАД «Байкальский-5» составляет 742 мкг/мл (228,06 мг/г в пересчете на сухой остаток); для наиболее активного компонента — Th. serpyllum, данная величина составляет 1077 мкг/мл отвара (489,77 мг/г сухого остатка) (табл. 2), причем вклад Th. serpyllum и G. uralensis в сумме составляет 68 % (37 и 31 %, соответственно).
Общая антиоксидантная емкость отвара БАД «Байкальский-8» составляет 667 мкг/мл (176,7 мг/г в пересчете на сухой остаток); для наиболее активного компонента — Mentha piperita, данная величина составляет 170 мкг/мл отвара (499,1 мг/г сухого остатка) (табл. 2), в отваре Rosa canina общая антиоксидантная емкость составляет 371 мкг/мл (343,1 мг/г в пересчете на сухой остаток).
Суммарный препарат «Байкальский-5» обладает выраженной антирадикальной активностью — IC50 64,49 мкг/мл; компоненты по степени убывания данного действия располагаются следующим образом: Th. serpyllum (6,13 мкг/мл) > A. graveolens > V. tricolor > I. helenium > G. uralensis (250,98 мкг/мл) (табл. 3). Присутствие Th. serpyllum обуславливает до 81 % от общей величины IC50.
Компоненты «Байкальский-8» по степени убывания антирадикальной активности располагаются следующим образом: Rosa canina (4,81 мкг/мл) > Mentha piperita > Hippophae rhamnoides > Urtica dioica > Sorbus aucuparia (85,7 мкг/мл).
Таблица 1
Содержание экстрактивных веществ и фенольных соединений в отварах БАД «Байкальский-5» и «Байкальский-8» и его компонентов
Отвар Экстрактивные вещества Общее содержание фенольных соединений
мг/мл отвара % мкг/мл отвара % % в отваре
Anethum raveolens 1,10 ± 0,02 9,31 ± 0,18 125,5 ± 4,1 11,36 ± 0,34 0,013
Glycyrrhiza uralensis 3,32 ± 0,07 28,25 ± 0,56 197,4 ± 6,0 5,91 ± 0,18 0,020
Inula helenium 8,42 ± 0,17 53,12 ± 1,06 136,5 ± 4,2 2,11 ± 0,06 0,014
Thymus serpyllum 2,21 ± 0,04 17,82 ± 0,35 557,2 ± 16,5 25,23 ± 0,76 0,055
Viola tricolor 3,64 ± 0,07 29,74 ± 0,59 199,3 ± 6,2 5,56 ± 0,17 0,020
Байкальский-5 3,24 ± 0,06 23,98 ± 0,47 188,3 ± 5,7 5,80 ± 0,17 0,019
Hippophae rhamnoides 0,84 ± 0,01 8,40 ± 0,09 242,1 ± 4,8 30,26 ± 0,91 0,004
Mentha piperita 2,67 ± 0,05 26,69 ± 0,51 746,0 ± 14,9 32,91 ± 0,99 0,011
Rosa canina 3,61 ± 0,07 36,11 ± 0,72 927,4 ± 18,5 25,76 ± 0,77 0,028
Sorbus aucuparia 5,52 ± 0,13 55,21 ± 1,33 255,8 ± 5,12 4,65 ± 0,14 0,005
Urtica dioica 2,02 ± 0,04 20,20 ± 0,39 196,4 ± 3,9 9,82 ± 0,30 0,004
Байкальский-8 3,04 ± 0,06 30,42 ± 0,64 516,8 ± 10,3 16,97 ± 0,33 0,007
ПІІММІМІІІМІМП ИММММГП □ I I II II III Г Ill I II I I I
199
Таблица 2
Общая антиоксидантная емкость (TAC) и антирадикальная активность (DPPH) отваров БАД «Байкальский-5» и «Байкальский-8» и его компонентов
Отвар TAC DPPH, IC50, CBA, IC50,
мкг/мл отвара мг/г мкг/мл мкг/мл
Anethum graveolens 331 ± 9 301,36 ± 9,04 47,49 ± 0,94 245,22 ± 7,36
Glycyrrhiza uralensis 930 ± 28 281,97 ± 8,46 250,98 ± 5,02 373,61 ± 11,61
Inula helenium 190 ± 6 29,66 ± 0,89 197,20 ± 3,94 1198,07 ± 35,9
Thymus serpyllum 1077 ± 32 489,77 ± 14,69 6,13 ± 0,12 57,16 ± 1,71
Viola tricolor 443 ± 14 123,06 ± 3,69 104,41 ± 2,09 261,49 ± 7,85
Байкальский-5 742 ± 22 228,86 ± 6,86 64,49 ± 1,28 393,33 ± 11,80
Hippophae rhamnoides 88 ± 4 735,00 ± 29,45 14,87 ± 0,28 114,50 ± 3,44
Mentha piperita 170 ± 7 499,12 ± 19,96 6,15 ± 0,12 181,78 ± 5,45
Rosa canina 371 ± 15 343,15 ± 13,73 4,81 ± 0,10 146,19 ± 4,39
Sorbus aucuparia 122 ± 5 110,64 ± 4,42 119,22 ± 2,38 1525,08 ± 45,75
Urtica dioica 83 ± 3 208,25 ± 8,34 85,67 ± 1,71 95,10 ± 2,85
Байкальский-8 667 ± 20 176,67 ± 5.63 21,62 ± 0.43 280,8 ± 8.40
кофейная кислота > скополетин, которые в составе фенольного комплекса отвара БАД «Байкаль-ский-5» являются доминирующими. Наибольшее содержание в исследуемом отваре отмечено для розмариновой кислоты и эриоцитрина.
Для доминирующих соединений, входящих в состав отвара БАД «Байкальский-5» и «Байкаль-ский-8» с использованием ДФПГ-метода установлена антирадикальная активность.
Выявлено, что индивидуальные соединения, входящие в состав отвара Th. serpyllum, проявляют выраженное антирадикальное действие, причем, вероятно, присутствие более активного лютеолин-7-гликозида и доминирующей в сумме фенольных соединений розмариновой кислоты является лимитирующим фактором, обусловливающим способность препарата к связыванию свободных радикалов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. — М., 1994. — 268 с.
2. Preito P., Pineda M., Aguilar M. Spectropho-tometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphormolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E // Anal. Biochem. - 1999. - Vol. 269. - P. 337-341.
3. Seyoum A., Asres K., El-Fiky F.K. Structure-radical scavenging relationships of flavonoids // Phy-tochem. - 2006. - Vol. 67. - P. 2058-2070.
Сведения об авторах
Цыбикова Елена Николаевна - старший преподаватель кафедры общественного здоровья Бурятского государственного университета (670002, г. Улан-Удэ, ул. Октябрьская, 36; тел.: (3012) 44-55-03)
Убеева Ираида Поликарповна - профессор, д.м.н., заведующий кафедрой инфекционных болезней Бурятского государственного университета (670002, г Улан-Удэ, ул. Октябрьская, 36; тел.: (3012) 44-55-03).
Оленников Даниил Николаевич - к.фарм.н., с.н.с. лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-37-13).
ТанхаеваЛариса Максимовна - к.фарм.н., с.н.с. лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-37-13).
Петров Евгений Васильевич - к.фарм.н., с.н.с. лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-37-13).
I I ■ I I I III I
LG ChA CA Rt EC RA Sp TS AG RC MP
Рис. 1. Антирадикальная активность индивидуальных соединений (ДФПГ-метод). LG - лютеолин-7-глюкозид, ChA - хлорогеновая кислота, CA - кофейная кислота, Rt - рутин, EC - эриоцитрин, RA - розмариновая кислота, Sp - скополетин. TS - отвар Thymus serpyllum, AG - отвар Anethum graveolens. По оси ординат - IC50, мкг/мл.
С применением ВЭТСХ с постхроматографи-ческой дериватизацией хроматограммы раствором ДФПГ установлено, что выраженное обесцвечивание наблюдается в зонах адсорбции 7 соединений (по убыванию интенсивности деколоризации) — розмариновая кислота > лютеолин-7-гликозид > эриоцитрин > рутин > хлорогеновая кислота >
2CC
ПНИИИМИИМП I I I I I ІМГП □ II I II I ММ Г nil I I I II
