CC BY
72
УДК 547.964.4
Вестник СПбГУ. Сер. 3. 2013. Вып. 2
Е. И. Ильина, М. Н. Берлов, Я. А. Дубровский, Е. Г. Богомолова, В. Н. Кокряков
АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ ЛИСИЦЫ
УиЬРББ УиЬРББ*
Введение
Накопленные к настоящему времени данные позволяют сделать вывод о том, что антимикробные пептиды (АМП) являются одним из ключевых молекулярных компонентов системы врожденного иммунитета млекопитающих [1-4]. Большинство АМП млекопитающих — кодируемые генами антибиотики эволюционно древней системы защиты. Однако, важную физиологическую роль могут играть также АМП, представляющие собой продукты ограниченного протеолиза более крупных белков. В частности, одним из первых примеров такого рода было описание антимикробной активности производных гистонов [5].
Как правило, АМП обладают относительно низкой токсичностью по отношению к клеткам собственного организма, а резистентность к ним микробов вырабатывается медленнее, чем к традиционным антибиотическим агентам. Помимо непосредственного антимикробного действия, АМП нередко проявляют целый ряд иммуномодулирую-щих эффектов [1, 2]. В связи с этим выделение, очистка и структурно-функциональное изучение АМП животных создает предпосылки для разработки и производства гомологов подобных соединений и их внедрения в медицину и ветеринарию как дополнения, а в ряде случаев альтернативы конвенциальным антибиотикам.
Важную роль в изучении АМП играют сравнительные исследования их структурно-функциональных свойств, так как известно, что набор и структура АМП у разных видов животных даже в пределах одного семейства могут сильно варьировать. В нашей лаборатории ранее уже были проведены исследования спектра АМП лейкоцитов собаки [6] и песца [7], в связи с чем представляло интерес изучение АМП еще одного представителя семейства псовых — лисицы Vulpes vulpes. В настоящей работе мы выделили из лейкоцитов лисицы новый антимикробный пептид, являющийся фрагментом гистона Н4, и охарактеризовали его по ряду структурных и функциональных свойств.
Ильина Елена Игоревна — студент, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Берлов Михаил Николаевич — канд. биол. наук, старший преподаватель, Санкт-Петербургский государственный университет; научный сотрудник, НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН; e-mail: [email protected]
Дубровский Ярослав Александрович — аспирант, НИИ аналитического приборостроения РАН; e-mail: [email protected]
Богомолова Елена Григорьевна — студент, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Кокряков Владимир Николаевич — д-р биол. наук, профессор, Санкт-Петербургский государственный университет; руководитель лаборатории, НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН; e-mail: [email protected]
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №12-04-01573а). © Е. И. Ильина, М. Н. Берлов, Я. А. Дубровский, Е. Г. Богомолова, В. Н. Кокряков, 2013
Методы исследования
Выделение пептида. Суспензия лейкоцитов лисицы Vulpes vulpes в дистиллированной воде хранилась при температуре -20 °С. Материал размораживали, затем центрифугировали в течение 30 мин при 15 000 g. К осажденным клеткам добавляли 20 мл 10%-ной уксусной кислоты, гомогенизировали с помощью гомогенизатора Поттера (стекло-тефлон) и инкубировали 2,5 ч при температуре +4 °С. После этого смесь центрифугировали в течение 30 мин при 15 000 g и отбирали супернатант.
Полученный экстракт подвергали последовательному хроматографическому фракционированию методами гель-фильтрации и офВЭЖХ. Для гель-фильтрации использовали колонку с биогелем P-10 высотой 90 см, диаметром 3,5 см. В качестве элюи-рующего буфера использовали 5%-ную уксусную кислоту. Для офВЭЖХ использовали колонку Supelco (Sigma-Aldrich) C18 длиной 25 см, диаметром 0,46 см и размером гранул 5 мкм. Пробу наносили в гидрофильном растворителе (0,1% ТФУ), в ходе хромато-графического разделения увеличивали концентрацию ацетонитрила в элюенте (до 20% за первые 10 мин, затем — до 65% за 45 мин и до 100% за 15 мин).
Гомогенность материала в полученных фракциях анализировали с помощью электрофореза в 16%-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по методу Г. Шаггера и Г. фон Джагова [8].
Выявление дисульфидных связей. Для определения наличия или отсутствия ди-сульфидных связей в молекуле анализируемого пептида проводили окисление пробы надмуравьиной кислотой [9]. Пробы инкубировали на ледяной бане с реагентом (450 мкл муравьиной кислоты и 50 мкл 30%-ного пероксида водорода) в течение 2 ч. Затем избыток надмуравьиной кислоты удаляли двумя промывками дистиллированной водой, пробы лиофилизировали, применяя аппарат SpeedVac Savant. Результаты анализировали с помощью электрофореза в 12,5%-ном ПААГ при кислых значениях pH по методу С. Паньима и Р. Челкли [10]. В качестве положительного контроля использовали лизоцим человека — белок, содержащий 4 дисульфидные связи.
Определение антимикробной активности. Для анализа антимикробной активности проб по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям — Listeria monocytogenes (штамм EGD) и Escherichia coli (штамм МЬ-35р), соответственно — использовали метод радиальной диффузии [11]. На чашках Петри, залитых агарозой, содержащей клетки микробов, размещали анализируемые пробы в лунках диаметром 1,5 мм из расчета 0,5 мкг белка на лунку. Также на чашки наносили положительный (ультрафильтрат экстракта из лейкоцитов крови кролика, содержащий дефенсины) и отрицательный (0,01% уксусная кислота) контроль. Чашки Петри с пробами инкубировали при температуре 37 °С в течение 3 ч, затем добавляли агарозу с питательной средой и инкубировали 18 ч при температуре 37 °С. О наличии антимикробной активности в пробах свидетельствуют зоны ингибирования роста, представляющие собой прозрачные участки на фоне помутневшей агарозы.
Масс-спектрометрический анализ. Образцы для проведения анализа растворяли в 10 мкл 0,1%-ной ТФУ в воде. На мишень наносили 0,5 мкл матрицы (синапиновой кислоты) (20 мг/мл в 0,1%-ной ТФУ в 50%-ном ацетонитриле) и 0,5 мкл образца. Затем высушивали на воздухе. Использовали времяпролетный масс-спектрометр Axima Performance с источником MALDI, оснащенным УФ-лазером (337 нм). Детектировали положительные ионы в диапазоне m/z от 4 000 до 20 000 Д. Масс-спектры регистрировали
при помощи программы MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония). Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF Axima, проводили в программе MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония).
Для проведения триптического гидролиза пептида пробу растворяли в 25 мМ бикарбонате аммония до концентрации 0,1 мг/мл, добавляли раствор трипсина (массовое соотношение пептид : трипсин, 50 : 1) и инкубировали в течение ночи при температуре 37 °С.
Результаты исследования
Путем последовательного хроматографического разделения материала экстракта 10%-ной уксусной кислотой из лейкоцитов крови лисицы методами гель-фильтрации
и офВЭЖХ был получен в гомогенном виде антимикробный пептид с молекулярной массой 4690 Д. Элек-трофореграмма очищенного пептида представлена на рис. 1, масс-спектр — на рис. 2. В ходе гель-фильтрации данный пептид характеризовался объемом элюции 167 мл, а в ходе офВЭЖХ элюировался с колонки при концентрации ацетонитрила 44%. Показано, что пептид проявляет выраженную антимикробную активность по отношению к Escherichia coli и Listeria monocytogenes (рис. 3). Тест на наличие дисульфидных связей не выявил их в данном пептиде (результаты не представлены).
С целью определения первичной структуры пептида были осуществлены его расщепление трипсином и последующий масс-спектрометрический анализ полученных фрагментов (рис. 4). Как видно из рис. 4, выявлено 4 мажорных пика, соответствующих фрагментам с молекулярными массами приблизительно 1179,6, 1335,7, 1480,8, 1593,9 Д. Анализ данных, проведенный с помощью программы MASCOT, позволил идентифицировать полученные фрагменты как фрагменты ги-стона H4 (таблица).
Следует отметить, что гистон H4 является одним из наиболее консервативных белков в эволюции эука-риот [12]; широко известным, в частности, является факт различия первичных структур гистонов H4 коровы и гороха всего лишь по двум аминокислотам [13]. К настоящему времени сведения о гистоне H4 лисицы отсутствуют в базах данных, таких как Uniprot, GenBank. Однако имеется информация о гистоне H4 другого представителя этого же рода животных — Vulpes zerda (фенек): известна первичная структура фрагмента, включающего 43 аминокислотных остатка [14], который полностью совпадает с фрагментом 31-73 гистона H4 человека [15]. Также известна первичная структура гистона H4 другого представителя семейства псовых — собаки Canis lupus fa-miliaris, рассчитанная на основании секвенированной последовательности нуклеотидов гена этого белка [16]. Первичные структуры гистонов H4 собаки и человека идентичны.
Рис. 1. Электрофореграмма очищенного пептида из лейкоцитов лисицы:
1 — стандартные белки с известной молекулярной массой (значения молекулярной массы в кД приведены слева); 2 — пептид.
100 90
ш 80 Ii 70
К л
Ii60
8 I so
¡¡40 ¡4 30
И
S 20 10 0
2000
8000
9000 m/z
3000 4000 5000 6000 7000
Рис. 2. Масс-спектр пептида из лейкоцитов лисицы По оси абсцисс — отношение молекулярной массы (Д) к заряду иона (m/z); по оси ординат — интенсивность сигнала в процентах от максимальной. Значение m/z 4 691 для однозарядного иона соответствует значению молекулярной массы 4 690 Д.
Рис. 3. Результаты антимикробного теста пептида из лейкоцитов лисицы методом радиальной диффузии по отношению к E. coli (вверху) и L. monocytogenes (внизу)
Пробы слева направо — пептид; отрицательный контроль (0,01%-ная уксусная кислота); положительный контроль (тотальный дефенсин кролика).
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500 m/z
Рис. 4. Масс-спектр продуктов триптического гидролиза пептида из лейкоцитов лисицы По оси абсцисс — отношение молекулярной массы (Д) к заряду иона (m/z); по оси ординат — интенсивность сигнала в процентах от максимальной.
Фрагменты гистона И, идентифицированные в результате анализа масс-спектра триптического гидролизата антимикробного пептида, выделенного из лейкоцитов лисицы
Положение в полипептидной цепи гистона H4 Молекулярная масса (экспериментальная), Д Молекулярная масса (расчетная), Д Аминокислотная последовательность
46-55 1179,6060 1179,6135 R. ISGLIYEETR. G
45-55 1335,6717 1335,7146 K. RISGLIYEETR. G
23-35 1480,8349 1480,8474 L. RDNIQGITKPAIR. R
22-35 1593,9239 1593,9314 V. LRDNIQGITKPAIR. R
Таким образом, выделенный нами пептид по данным масс-спектрометрического анализа включает в себя фрагменты гистона Н4, ограниченные остатками 22-35 и 4555. Молекулярная масса пептида составила 4690 Д (см. рис. 2). Чтобы восстановить его полную первичную структуру, необходимо было подобрать такой участок аминокислотной последовательности гистона Н4, который соответствовал бы данной молекулярной массе и полностью покрывал бы фрагменты 22-35 и 45-55. Из всех возможных вариантов данным требованиям более всего соответствует участок 19-59 (молекулярная масса — 4688,6 Д) (рис. 5), поскольку отклонение молекулярной массы от экспериментально полученного значения — менее 2 Д. Во всех прочих возможных вариантах отклонение превышает 5 Д. Таким образом, мы предполагаем, что выделенный нами пептид по своей первичной структуре соответствует участку 19-59 гистона Н4.
'заКСКССКСЬСКССАЫШККУЬНВМОСгеКРАШКЬАККССУКШвСЬГСЕЕТКСУЬК
УРЬЕКУХКОАУТУТЕНАКККТУТАМБУУУАЬККООКТЬУСРОО102
Рис. 5. Первичная структура гистона Н4
Жирным шрифтом выделена аминокислотная последовательность пептида из лейкоцитов лисицы.
Обсуждение результатов исследования
В ходе этой работы мы выделили Пе1ггад из лейкоцигав лисицы
из лейкоцитов лисицы антимикроб-
„ „ ,r RKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLK
ный пептид, соответствующий фрагменту гистона H4 19-59. Следует Пептиды из лейкоцитов собаки
отметить, что данная аминокислотная последовательность полностью
, ----RDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYE-------
включает в себя первичную структуру
четырех антимикробных пептидов,
Рис. 6. Сравнение первичной структуры пепти-
выделенных нами ранее из лейкоци-
Г1. да из лейкоцитов лисицы и четырех пептидов из лей-
тов шбаки [6] (в цитируемОй рабОте коцитов собаки, выделенных ранее [6]
структуры не приведены) (рис. 6).
Антимикробная активность ядерных катионных белков — гистонов — представляет собой широко известный феномен, детально изученный в работах отечественных и зарубежных исследователей [5, 17-18]. Однако установленная в условиях in vitro антимикробная активность гистонов сама по себе не давала оснований приписывать им соответствующую физиологическую функцию. В настоящее время рассматривается концепция нейтрофильных экстраклеточных ловушек — NETs (Neutrophil Extracellular Traps), предусматривающая, в частности, реализацию антимикробного потенциала ядерных гистонов в физиологических условиях [19, 20]. Согласно этой концепции, после активации нейтрофильные гранулоциты могут высвобождать из клетки фрагменты хроматина и гранулярные белки, которые, в свою очередь, сорбируются на хроматине. В результате формируются внеклеточные структуры, способствующие элиминации патогенов, циркулирующих в кровотоке, за счет повышения локальной концентрации антимикробных белков и пептидов (включая как белки гранулярного происхождения, так и ядерные гистоны) и создания физико-химического барьера, предотвращающего дальнейшее распространение как бактерий, так и самих антимикробных веществ, которые, в противном случае, могут вызвать аутоповреждение структур организма хозяина.
Немало сведений имеется в литературе и об антимикробной активности фрагментов гистонов, выделенных из различных природных источников. В составе ней-трофильных экстраклеточных ловушек многие молекулы гистонов присутствуют в частично деградированной форме [19]. Часто АМП, являющиеся фрагментами гистонов, обнаруживают в слизистой кожи рыб: из различных видов были выделены производные гистонов H1, H2A, H2B [21-23]. В желудке азиатской жабы Bufo bufo gargarizans обнаружен АМП буфорин I — производное гистона H2A [24]. Фрагменты гистона H1 с антимикробной активностью находили и в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта человека [25]. Наконец, источником АМП — производных гистонов — нередко становятся и лейкоциты. Активные фрагменты гистона H1 обнаружены в стимулированных гранулоцитах человека [26]. Антимикробные пептиды, являющиеся фрагментами гистона H2A, были выделены и из лейкоцитов русского осетра Acipenser guldenstadti [27]. Как уже отмечалось выше, фрагменты гистона H4 с антимикробной активностью, представляющие собой укороченные варианты пептида, исследованного в данной работе, были ранее выделены из лейкоцитов собаки Canis lupus familiaris [6].
Есть основания предполагать, что, по крайней мере, в части рассмотренных случаев образование протеолитических фрагментов гистонов, обладающих антимикробной
активностью, происходит в физиологических условиях и является этапом реализации защитных механизмов организма. Однако в нашем случае генерация антимикробного пептида, скорее всего, происходит в ходе препаративного эксперимента при гомогенизации лейкоцитов, что нарушает внутриклеточную компартментализацию и делает ядерные белки — гистоны — доступными действию внутриклеточных протеиназ. Тем не менее высокая антимикробная активность полученного фрагмента гистона H4 позволяет рассматривать его как перспективную матрицу для разработки пептидных антибиотиков нового поколения для медицины и ветеринарии.
Литература
1. Современная концепция об антимикробных пептидах как молекулярных факторах иммунитета / Кокряков В. Н., Алешина Г. М., Шамова О. В., Орлов Д. С., Андреева Ю. В. // Мед. акад. журн. 2010. Т. 10. С. 149-160.
2. Choi K.-Y., ChowL. N. Y., Mookherjee N. Cationic host defence peptides: multifaceted role in immune modulation and inflammation // J. Innate Immun. 2012. Vol. 4. P. 361-370.
3. Guani-Guerra E., Santos-Mendoza T., Lugo-Reyes S. O., Teran L. M. Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease // Clin. Immunol. 2010. Vol. 135. P. 1-11.
4. Overview on the recent study of antimicrobial peptides: origins, functions, relative mechanisms and application / Li Y., Xiang Q., Zhang Q., Huang Y., Su Z. // Peptides. 2012. Vol. 37. P. 207-215.
5. Антибактериальные и антивирусные функции основных белков клетки и перспективы практического их использования / Ашмарин И. П., Ждан-Пушкина С. М., Кокряков В. Н., Самедов А. Ш., Антонова С. А. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1972. № 4. С. 502-508.
6. Кораблева Е. С., Берлов М. Н., Андреева Ю. В., Кокряков В. Н. Антимикробный пептид из лейкоцитов собаки: структурно-функциональные свойства // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2007. Вып. 3. С. 80-88.
7. Выделение и характеристика антимикробных низкомолекулярных белков из лейкоцитов крови голубого песца Alopex lagopus / Богомолова Е. Г., Берлов М. Н., Дубровский Я. А., Кораблева Е. С., Кокряков В. Н. // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2012. Вып. 1. С. 47-59.
8. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 — 100 kDa // Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. P. 368-379.
9. Торчинский Ю. М. Сера в белках. М.: Наука, 1977. 123 с.
10. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 130. P. 337-346.
11. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides / Lehrer R. I., Rosenman M., Harwing S. S., Jackson R., Eisenhauer P. // J. Immunol. Meth. 1991. Vol. 137. P. 167-173.
12. Piontkivska H., Rooney A. P., Ney M. Purifying selection and birth-and-death evolution in the histone H4 gene family // Mol. Biol. Evol. 2002. Vol. 19. P. 689-697.
13. DeLange R. J., Fambrough D. M., Smith E. L., Bonner J. Calf and pea histone IV. 3. Complete amino acid sequence of pea seedling histone IV; comparison with the homologous calf thymus histone // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244. P. 5669-5679.
14. The Universal Protein Resourse. URL: http://www.uniprot.org/uniprot/Q6B830 (дата обращения: 8.10.2012).
15. The Universal Protein Resourse. URL: http://www.uniprot.org/uniprot/P62805 (дата обращения: 8.10.2012).
16. The Universal Protein Resourse. URL: http://www.uniprot.org/uniprot/F2Z4N2 (дата обращения: 8.10.2012).
17. Ждан-Пушкина С. М. О действии протаминов, гистонов и полипептидов основного характера на микроорганизмы // Науч. докл. высшей школы. 1973. Вып. 8. С. 82-98.
18. Hirsch J. G. Bactericidal action of histone // J. Exp. Med. 1958. Vol. 108. P. 925-944.
19. Brinkmann V., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? // J. Cell Biol. 2012. Vol. 198. P. 773-783.
20. Papayannopoulos V., Zychlinsky A. NETs: a new strategy for using old weapons // Trends Immunol. 2009. Vol. 30. P. 513-521.
21. Fernandes J. M., Kemp G. D., Molle M. G., Smith V. J. Anti-microbial properties of histone H2A from skin secretions of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss // Biochem. J. 2002. Vol. 368. P. 611-620.
22. Synergy of histone-derived peptides of coho salmon with lysozyme and flounder pleurocidin / Patrzykat A., Zhang L., Mendoza V., Iwama G. K., Hancock R. E. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. Vol. 45. P. 1337-1342.
23. Antimicrobial activity in the skin of the channel catfish Ictalurus punctatus: characterization of broad-spectrum histone-like antimicrobial proteins / Robinette D., Wada S., Arroll T., Levy M. G., Miller W. L., Noga E. J. // Cell. Mol. Life Sci. 1998. Vol. 54. P. 467-475.
24. Park C. B., Kim M. S., Kim S. C. A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1996. Vol. 218. P. 408-413.
25. Potential role of epithelial cell-derived histone H1 proteins in innate antimicrobial defense in the human gastrointestinal tract / Rose F. R., Bailey K., Keyte J. W., Chan W. C., Greenwood D., Mahida Y. R. // Infect. Immun. 1998. Vol. 66. P. 3255-3263.
26. Antibacterial peptides in stimulated human granulocytes: characterization of ubiquitinated histone H1A / Wang Y., Griffiths W. J., Jornvall H., Agerberth B., Johansson J. // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 512-518.
27. Антимикробные пептиды из лейкоцитов русского осетра (Acipenserguldenstadti) / Шамова О. В., Орлов Д. С., Овчинникова Т. В., Сал Х. Г., Тверьянович И. А., Попова В. А., Орлов С. Б., Дюбин В. А., Кокря-ков В. Н. // Фундаментальные исследования. Биологические науки. 2006. № 1. С. 10-13.
Статья поступила в редакцию 11 декабря 2012 г.
