CC BY
41
УДК 612.398.1:547.964.4
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2007, вып. 1
А. Л. Мальцева, Г. М. Алешина, В. Н. Кокряков, Е. Г. Краснодембский
РАЗНООБРАЗИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ В КИСЛЫХ ЭКСТРАКТАХ ИЗ ЦЕЛОМОЦИТОВ МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ ASTERIAS RUBENS L.
Введение. Антимикробные пептиды (АП) в течение последних 20 лет являются предметом многочисленных исследований. Данная группа молекул интересна как с фундаментальной точки зрения - в качестве основных эффекторов системы врожденного иммунитета самых различных живых организмов, так и с прикладной - в качестве материала для разработки терапевтических препаратов, представляющих возможную альтернативу так называемым классическим антибиотикам микробного происхождения.
Наличие антимикробной активности у иглокожих было показано в связи с различными тканями и органами, в том числе, и целомической жидкостью [11,23,62]. Антимикробная активность была описана и в целомической жидкости морской Asterias rubens [4,23,30]. Вполне вероятно, что эта активность полностью или частично обусловливается присутствием АП.
В целомической жидкости иглокожих присутствуют форменные элементы - цело-моциты. Целомоциты иглокожих - это клетки, на которые возложена функция реализации защитных реакций, таких как фагоцитоз, инкапсуляция, гемостаз, продукция регу-ляторных и эффекторных молекул. Разнообразие клеток, объединяемых термином целомоциты, может довольно сильно варьировать у различных представителей иглокожих и по-разному классифицироваться авторами [9,10, 35, 60 и др.]. Однако для абсолютно всех описанных случаев постоянным является присутствие такого типа клеток, как амебоциты. У морских звезд этот клеточный тип доминирует по численности, маскируя присутствие клеток других типов, доля которых не превышает 1-5 % от общего числа цело-моцитов [2]. Поскольку целомоциты представляют собой иммунокомпетентные клетки иглокожих, они являются подходящим объектом для поиска АП.
Первым АП, описанным в целомической жидкости морской звезды Asterias rubens, является лизоцим (идентифицирован в плазме целомической жидкости и целомоцитах, молекулярная масса 15.5±1 кДа) [30]. Следующим в целомоцитах был идентифицирован ци-стеин-содержащий АП (молекулярная масса 4±1 кДа) [4]. Однако, согласно многим наблюдениям, обычным является присутствие в одном организме 15-40 различных АП [8], в связи с чем поиск АП был продолжен. Из уксуснокислых экстрактов из целомоцитов морской звезды было выделено шесть пептидов, молекулярная масса которых составляла: 2.02, 2.24,2.36, 2.60,2.73,4.16 кДа. Для одного из пептидов (2.24 кДа) была определена аминокислотная последовательность, этот пептид оказался фрагментом молекулы актина [3].
Однако шесть указанных выше пептидов не могут объяснить всей наблюдающейся в экстракте активности, поэтому можно предположить, что разнообразие антимикробных молекул в экстрактах несколько выше. Действительно, присутствие нескольких различных АП в клетках, вовлеченных в защитные реакции, является обычным и для позвоночных, и для беспозвоночных животных. Так, в нейтрофилах кролика было описано шесть различных дефенсинов, человека - четыре, кур - три, крупного рогатого скота - тринадцать [ 1,54]. В гемоцитах мидии Mytilusgalloprovincialis идентифицировано восемь различ-
Данная работа была выполнена при поддержке INTAS (грант №03-51-4984), РФФИ (грант №06-04-49416) и «Университеты России» (грант №07.01.328).
© А. Л. Мальцева, Г. М. Алешина, В. Н. Кокряков, Е. Г. Краснодембский, 2006
ных АП (MGD1.2; mytilins В, С, D, Gl; myticins А, В) [42, 43], в гемоцитах мечехвоста ('Tachypleus tridentalus) - пять (big defensin, tachystatins А, В, С; tachycitin) [28], в гемоцитах асцидии (Styela clava) - восемь (styelins А, В, С, D, Е, F; clavanins А, В) [53,58]. Поэтому в данной работе была поставлена задача выявить в экстрактах новые АП, а также более подробно изучить свойства уже идентифицированных молекул.
Материалы и методы исследования. Животные. Сбор материала для выделения антимикробных пептидов проводился в августе 2002-2005 гг. Морские звезды Asterias mbens были собраны в окрестностях МБС СПбГУ (губа Лебяжья, губа Подпахта). Животные содержались в садках на глубине 1,5 м до момента использования. После использования животные выпускались в районе сбора. Для получения целомоцитов с целью дальнейшего выделения мРНК и клонирования ДНК были использованы морские звезды Asterias rubens из Аквариальной лаборатории на базе ЗИН РАН и СПбГУ.
Целомоциты. Сбор целомической жидкости (ЦЖ) проводился путем удаления кончика луча. ЦЖ сцеживалась в сосуды, содержащие ЭДТА в таком количестве, чтобы конечная концентрация хелата составила 30 мМ (для предотвращения коагуляции). Непосредственно после сцеживания ЦЖ центрифугировали (Í.5 тыс. об./мин, 15 мин), затем удаляли надосадочную жидкость, к осажденным целомоцитам добавляли 15%-ную уксусную кислоту для экстракции. Экстракция проводилась при температуре 4 °С в течение 2-3 недель. По истечении времени экстракции клетки удалялись из экстракта путем центрифугирования (20000g, 40 мин), после чего экстракт подвергался дополнительной фильтрации через бумажные фильтры с диаметром пор 3 мкм (Filtrak).
Ультрафильтрация. Экстракт фракционировался в камере для ультрафильтрации (объем 50 мл) (Beckinan) через фильтры с фиксированным диаметром пор (последовательно 10 и 1 кДа) под давлением 4 атм.
Препаративный электрофорез. Часть экстракта, содержащая молекулы массой от 1 до 10 кДа, подвергалась препаративному электрофорезу в кислой буферной системе (5%-ная уксусная кислота) в присутствии мочевины [22]. Электрофорез проводился на установке BioRad (модель AG501-X8) в 12.5 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ).
Обратнофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ). Компоненты активных фракций разделялись с помощью ОФ ВЭЖХ на установке Beckman Gold HPLC Sistem. Для хроматографии использовались колонки С8 и С18 (Altech), С18 (Vydac), С18 (Zorbax) в градиенте ацетонитрила (подкисленного 0.1%-ной трифторуксусной кислотой).
Аналитические электрофорезы. Состав фракций анализировался методом электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины [44] в 12.5%-ном ПААГ и методом диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия [52] в ПААГ (3%-ный концентрирующий гель, 10%-ный разделяющий гель). Для проведения аналитических электрофорезов были использованы приборы фирмы Hoehfer PB. Inc. (USA).
Масс-спектрометрия. Изучение массы пептидов в пробах производилось с использованием времяпролетного масс-спектрометра (MALDI-TOF: matrix assisted laser desorption/ionization - time of flight, прибор Voyager-DE, Perseptive Biosystem Inc. (Framingham AM, USA)). Ионизация тестируемых молекул осуществляется посредством лазерной десорбции с матрицы (а-циаио-4-гидрокси-циннамовая кислота (Sigma)) с источником ионов замедленной экстракции в линейном режиме.
Антимикробный тест. Изучение антимикробной активности проводилось методом наложения геля или методом радиальной диффузии [33]. Для антимикробного теста использовались два вида бактерий: Escherichia coli, штамм ML035p (грамогрицательная бактерия); Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия).
Определение аминокислотной последовательности. Перед секвенированием чистота пептидных проб была проверена путем электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, после чего пробы были лиофилизированы. Секвенирование было осуществлено в Институте клеточной биохимии и клинической нейробиологии Клиники Гамбургского Университета (Istitut fur Zellbiochemie und klinische Neurobiology, Universitatsklinikum Hamburg-Eppendorf, Universität Hamburg).
Определение нуклеотидной последовательности транскрипта. Для выделения РНК у нескольких животных была собрана целомическая жидкость, клетки осаждались путем нен-
трифугирования, надосадки удалялись, к клеткам добавлялся раствор тризола. Выделение РНК, синтез кДНК, полимеразная цепная реакция с полученным обратным транскриптом (ОТ ПЦР), клонирование и секвенирование ДНК были осуществлены фирмой АТГ Сервис Ген, Санкт-Петербург.
Результаты исследований и их обсуждение. Перед проведением препаративного электрофореза в кислой буферной системе, экстракт разделялся на высокомолекулярную (молекулы массой >10 кДа) и низкомолекулярную (<10 кДа и >1 кДа) части. Дальнейшему разделению подвергалась только низкомолекулярная часть экстракта. Мы уже сообщали, что после разделения низкомолекулярной части экстракта путем препаративного электрофореза антибактериальная активность наблюдалась в широком спектре фракций [3]. Это указывает на присутствие в данной части экстракта многих антибактериальных молекул. Из них, как уже упоминалось, ранее были выявлены шесть АП: 2.02, 2.24, 2.36, 2.60, 2.73, 4.16 кДа [3]. Путем последовательного разделения с помощью ОФ ВЭЖХ фракций, полученных в результате препаративного электрофореза, нам удалось идентифицировать три новых пептида, проявляющих антимикробную активность: 1.84, 2.26, 4.67 кДа.
Таким образом, в экстрактах из целомоцитов всего нами было идентифицировано девять пептидов с антимикробной активностью. Для пяти из этих девяти пептидов была установлена аминокислотная последовательность.
Два пептида - 2.26 и 2.36 кДа (расчетные массы 2268 и 2387 Да, рис. 1) - являются фрагментами молекулы гистона Н2А (поэтому были обозначены АгНз11 и АгНб12 соответственно). Они представляют один и тот же участок молекулы с разницей на одну аминокислоту наИ-конце фрагмента: ЬАСЫАА1ЮМККТ1ШР1ШЩЬ.
В составе обоих пептидов имеется по шесть катионных аминокислот и свыше 45% гидрофобных аминокислот. Высокие катионность и гидрофобность являются наиболее характерными свойствами АП как группы: большинство известных в настоящее время АП - катионные молекулы, т. е. при физиологических значениях рН в среднем они имеют заряд от +2 до +7. Катионность АП определяется высоким содержанием положительно заряженных аминокислот: аргинина, лизина и гистидина [54]. Второе сзойство АП -гидрофобность: в молекулах АП имеется большое число гидрофобных аминокислот, чаще всего их более 50% [5, 21, 55]. Оба эти свойства важны для проявления ДП своей активности в отношении бактериальных клеток. Поверхность бактериальной клетки отрицательно заряжена - это касается и клеточной стенки (у грамотрицательных за счет присутствия липополисахарида, у грамположительных - тейхоевых кислот) и клеточной мембраны, содержащей, в отличие от клеток животных и растений, значительное количество отрицательно заряженных фосфолипидов: фосфатидилглицерола и кардиолипи-на [20,25, 40,55, 64]. Таким образом, положительный заряд, имеющийся на АП, обеспечивает электростатическое взаимодействие с поверхностью бактериальной клетки, а гидрофобность разрешает встраивание АП в состав мембраны, что является необходимыми этапами в реализации губительного воздействия АП на клетку-мишень.
Наличие антимикробной активности у появляющихся в результате протеолитичес-кого расщепления частей более крупных молекул было многократно описано [7, 8, 54, 61, 64]. Функции, лежащие на исходных белковых молекулах, могут быть самыми разнообразными, в том числе и защитными. Например, лактоферрины сами обладают сильной антимикробной активностью [39]. Было показано, что лактоферрин может служить источником для появления фрагментов, также обладающих антимикробной активностью и названных лактоферрицинами. Были идентифицированы человеческий и бычий лактоферрицины, несколько отличающиеся по структуре [16]. Считается, что лакто-феррицины появляются в желудке под действием протеаз желудочного сока. Аналогичным образом могут появляться АП при расщеплении а-казеина (из коровьего молока) -казоцидины [65], лизоцима [27], а-лактальбумина [48], /3-лактоглобулина [46], овотран-
Рис. 1. Последняя стадия хроматографической очистки пептидов ArHstl и ArHst2. Фракции №26 и 27 после препаративного электрофореза низкомолекулярной части экстракта, полученного в 2003 г., были объединены и подвергнуты хроматографическому разделению в градиенте ацетонитрила 0,5%/мин от 15 до 50% ацетонитрила. На хроматограмме стрелками отмечены пики, соответствующие фракциям №34 и 36, содержащим в чистом виде пептиды ArHstl (2268 Да) и ArHst2 (2387 Да) соответственно. Цифрами на хроматограмме указано время появления пиков (18-я и 19-я минуты от начала градиента).
сферрина [26], овальбумина [47]. В желудке клещей АП могут образовываться из гемоглобина бычьей крови, которой они питаются [19].
Большое число протеолитических фрагментов с бактерицидными свойствами было описано для различных гистонов: Н1 [18, 61], Н2В [51]. Однако чаще, также как и в данном исследовании, сообщается о выделении производных гистона Н2А, обладающих антимикробной активностью. Известно, что молекулы гистонов и сами по себе (без про-теолитического расщепления) проявляют антимикробную активность, что было еще установлено в начале XX в. [49]. В частности, целый гистон Н2А был выделен из кожных секретов радужной форели Oncorhynchus mykiis [17]. Низкомолекулярные производные гистона Н2 А были обнаружены у различных животных. Под действием пепсина из гистона Н2А образуется АП в пищеварительной системе азиатской жабы Bufo bufo - буфо-рин [31]. Пептид, названный гиппозином, был выделен из покровной слизи обыкновенного палтуса Hippoglossus hippoglossus [7]. Другой фрагмент гистона Н2А - паразин, был идентифицирован в покровных эпителиальных слоях и покровной слизи амурского сома Parasilurus asotus [45]. Причем в случае с паразином была идентифицирована протеаза, ответственная за его появление - катепсин Д, который присутствует в поверхностной слизи в виде предшественника - ирокатепсина - и активируется специфичной металло-протеиназой после ранения [14].
Механизм появления фрагментов гистона Н2А в целомоцитах морской звезды пока не ясен. Возможно, что это происходит подобно тому, как в активированных гранулоци-тах человека появляются производные гистона Н1 (молекулярные массы 6.2 и 7.5 кДа), проявляющие сильную антимикробную активность [61].
Пептид 1.84 кДа (расчетная масса 1847 Да, рис. 2), так же как и секвенированныи ранее нептид массой 2.24 кДа (расчетная масса 2234 Да), является фрагментом молекулы актина, поэтому пептиды получили названия ArActl и ArAct2 соответственно. Они, так же как и фрагменты гистона, представляют один и тот же .расположенный ближе к N-концу участок молекулы актина с разницей в длине пептида 4 аминокислоты на С-конце фрагмента: APRAVFPSIVGRPRHQGVMVG. Как и предыдущая пара молекул, данные два пептида характеризуются высоким содержанием катионных (+4) и гидрофобных (более 65%) аминокислот.
Определение аминокислотной последовательности для пептида, массой 2.02 кДа (рис. 3), не позволило полностью установить первичную структуру пептидной молекулы. Одна из аминокислот, расположенная ближе к С-концу молекулы, не была определена, кроме того, оставалось неизвестным, заканчивается ли пептид валином или за ва-лином имеется еще аминокислота: УКК^11£)1РС5РРК1ХУ.
Сравнительный анализ полученной последовательности выявил значительное сходство с актин-связывающим белком филамином А (ПпА) морского ежа (приблизительно
Рис. 2. Последняя стадия хроматографической очистки пептида АгАси.
Фракции №47-49 после препаративного электрофореза низкомолекулярной части экстракта, полученного в 2002 г., были объединены и подвергнуты ОФ ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила 1%/мин от 0 до 60% ацетонитрила. Фракции №30-32 после этого разделения, проявившие антимикробную активность, были объединены и вновь нанесены на хроматографическую колонку. Разделение проводилось в градиенте ацетонитрила 0.5%/мин от 15 до 45% ацетонитрила; хроматограмма этого разделения представлена на рис. 2. Стрелкой показан пик, соответствующий 52-й фракции, содержащей пептид АгАси (1847 Да) в чистом виде. Цифрами на хроматограмме указано время появления пика (27-я минута от начала градиента).
70%), и несколько меньшее сходство с филамином человека и других позвоночных, вследствие чего данный пептид рассматривался как фрагмент филамина и был обозначен АгИп1.
Для определения полной последовательности выделенного пептида было проведено клонирование соответствующей части гена филамина морской звезды.
Последовательность филамина морской звезды отсутствует в электронной базе данных http:Zwww.ncbi.nlm.nih.gov, поэтому при создании праймера мы ориентировались на аминокислотную последовательность пептида и последовательности генов филамина других животных, имеющиеся в электронной базе данных. Сравнение последовательностей участков генов филамина различных позвоночных и филамина морского ежа, которые кодируют наиболее близкий по структуре пептид, позволило найти наиболее консервативный вариант, на основании которого был синтезирован прямой праймер. Данный праймер был использован в реакции ОТ ПЦР в паре с олиго-дТ праймером. Продукт этой реакции был клонирован и секвенирован. На основании полученной нук-леотидной последовательности была восстановлена аминокислотная последовательность фрагмента белка, наиболее близкого по молекулярной массе искомому пептиду (жирным курсивом выделена последовательность праймера):
Рис. 3. Последняя стадия хроматографической очистки пептида ArFlnl.
Фракция №54 после препаративного электрофореза низкомолекулярной части экстракта, полученного в 2002 г., была подвергнута ОФ ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила 1%/мин от 0 до 60% ацетонитрила. Одна из полученных фракций (№34) была вновь нанесена на хроматографическую колонку. Разделение проводилось в градиенте ацетонитрила 0.5%/мин от 15 до 45% ацетонитрила, хроматограмма этого разделения представлена на рис. 3. Стрелкой показан пик, соответствующий 31-й фракции, содержащей пептид ArFlnl (2028 Да) в чистом виде. Цифрами на хроматограмме указано время появления пика (31-я минута от начала градиента).
AAGAAG TTCAACAGG CAGATC ССТGGC AGC ССС TTC AAG АТС ATT GTC CGC KKFNRQIPGSPFKI I V G .
Расчетная масса пептида ArFlnl составляет 2028 Да. В молекуле пептида содержится 18 аминокислот, из них 4 являются катионными: 3 лизина и 1 аргинин, следовательно, суммарный заряд молекулы при физиологических значениях рН приблизительно равен +4. Десять аминокислот из восемнадцати являются гидрофобными, что составляет около 56%. Пептид представляет собой концевую часть иммуноглобулинового повтора филаминового типа и расположен ближе к С-концу молекулы филамина.
В отличие от фрагментов гистонов в литературе не имеется данных о фрагментах актина или филамина, проявляющих антимикробную активность. Для того чтобы объяснить, каким образом появляются данные пептиды в экстрактах, нужно помнить, что экстракты были получены из целомоцитов. Как уже указывалось, доминирующим типом целомоцитов у морской звезды являются амебоциты. То есть экстракты, которые исследовались на предмет присутствия антимикробных веществ, были получены преимущественно из амебоцитов, которые являются главными исполнителями всех защитных реакций. Именно амебоциты (и только они из всех целомоцитов) способны к фагоцитозу, вовлекаясь также в процессы инкапсуляции и гемостаза [9,10,12,13, 29].
Важную роль в выполнении амебоцитами своих защитных функций играет активация, которая сопровождается изменением морфологии клетки. Изменение морфологии целомоцитов обусловливается трансформацией активного цитоскелета. Для морского ежа Sùvngylocentrotus purpuratus было показано, что даже на небольшое раздражение (такое, как укол иглой в перистомальное поле животного) целомоциты могут отвечать активацией экспрессии гена SpCoell. Этот ген кодирует белок, обладающий высокой структурной гомологией с профилином позвоночных [56]. Профилины - это группа белков, связывающих актин и участвующих в проведении сигнала и трансформации цитоскелета [32 ]. Также было описано, что ген SpCoell активируется при введении в целом бакте-
риального липополисахарида [57]. То есть трансформация актинового цитоскелета является необходимым компонентом развития защитной реакции амебоцитов, развивающейся в ответ на нарушение целостности стенки тела и/или проникновение инфекционного начала в полость целома.
Известно, что филамин A (FlnA), так же как и профиллин, является актин-связываю-щим белком. Он ответствен за формирование трехмерной ортогональной сети, за пришивание'актиновых фибрилл к интегральным белкам клеточной мембраны, в том числе и рецепторным [59]. Ввиду последнего обстоятельства FlnA оказывается вовлечен в проведение сигнала. Так, FlnA связан с андрогеновым рецептором [37], с инсулиновым рецептором [24], с рецептором для TGFp. Он также вовлечен в поведение сигнала от рецептора для TNFa, То11-рецептора и рецептора к ИЛ-1 [34]. Кроме того, он связан с адгезионными белками интегринового семейства [36]. Было показано, что протеолитические фрагменты филамина присутствуют в клетке и играют важную роль в формировании ответа на раздражение рецептора (например, андрогенового), участвуя в регуляции экспрессии генов [37]. FlnA связывает в цитоплазме многие регуляторные молекулы [6,15,24,34,41,50,63 и др], и его расщепление может приводить к их освобождению и активации или же, наоборот, инактивации. Так, присутствие FlnA оказывает ингибирующее действие на активацию МАР-киназы и контролируемого ею каскада после связывания лиганда инсулиновым рецептором. С другой стороны, есть основания полагать, что FlnA необходим для TNFa-зависимой активации МАРК [38]. Кроме того, было показано, что в клетке присутствуют укороченные формы филамина, не имеющие актин-связывающих доменов. Считается, что такие формы филамина важны для регулирования состояния актинового цитоскелета клетки [59J. Было установлено, что появление в цитоплазме клетки С-концевой части филамина приводит к трансформации актинового цитоскелета и изменению морфологии клетки [24].
Вероятно, появление продуктов протеолитического расщепления актина и филамина связано с трансформацией актинового цитоскелета в ходе активации целомоцитов, вызванной соприкосновением целомической жидкости с внешней средой (при ее заборе). Выявленный нами пептид ArFlnl соответствует С-концевой области филамина, возможно, что его появление в клетке является одним из факторов, обусловливающих изменения в состоянии актинового цитоскелета клетки и ее морфологии.
Наличие антимикробной активности у фрагментов актина и филамина ставит вопрос о возможности их функционирования как эффекторных молекул в ходе защитного противобактериального ответа. Однако возможный механизм использования организмом образовавшихся в цитоплазме фрагментов остается неясным. Самый простой путь соприкосновения подобных молекул с микробным началом - разрушение клеток, например, на поверхности образовавшегося в ходе гемостатической реакции клеточного сгустка. В то же время подтверждение участия данных протеолитических фрагментов в защите организма, так же как и других подобных молекул, описанных в литературе, довольно затруднительно с методической точки зрения. Вполне обоснованным представляется только предположение о защитной функции паразина, поскольку был идентифицирован каскад протеаз, ответственных за его появление [14]. Функционирование других пептидов, представляющих собой протеолитические фрагменты, в качестве
эффекторных молекул не является доказанным.
* * *
Авторы глубоко признательны В. А. Поповой и И. А. Тверьяновичу, сотрудникам ООО ЦКП «Аналитическая спектрометрия», за возможность использования времяпро-летного масс-спектрометра в ходе нашего исследования, а также И. А. Тихомирову, со-
труднику кафедры Зоологии беспозвоночных СПбГУ и Аквариальной лаборатории на базе ЗИН РАН и СПбГУ, за возможность работы с животными, содержащимися в указанной лаборатории.
Summary
Malzeva A. L., Aleshina G. М., Kokryakov V. N„ Krasnodembsky E. G. Diversity of antimicrobial peptides in acidic extracts from coelomocytes of starfish Asterias rubens L.
Three new antimicrobial peptides were identified in extracts from coelomocytes of starfish Asterias rubens. At present the total number of discovered peptides (including six described earlier) is nine. Five of nine peptides were sequenced. They all proved to be fragments of other proteins. Two peptide's (ArActl and ArAct2) are fragments of actin (the same part of actin molecule but with different length): APRAVFPSIVGRPRHQGVMVG. Other two peptides (ArHstl and ArHst2) peptides are the fragments ofhistone H2A(also representing the same partofhistone molecule): LAGNAARDNKKTRINPRHLQL. Analysis of fifth peptide (ArFlnl) revealed significant similarity with filamin A (FlnA) of sea urchin (72%): VKKFNRQIPGSPFKIIVG.
Литература
1. Кокряков В. H. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. . 2. Кореибаум Е. С., Воробьев В. А. Клетки целомической жидкости морской звезды // Биология моря. 1988. № 1. С. 27-33. 3. Мальцева А. Л., Алешина Г. М„ Кокряков В. #., Краснодембский Е. Г., Овчинникова Т. В. Новые антимикробные пептиды из целомоцитов морской звезды Asterias rubens // Вестн. С.-Петерб. ун-та. 2004. Сер. 3. Вып. 4 (№ 27). С. 100-108.4. МирончикЕ. В. Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств антимикробных белков и пептидов Asterias rubens: Магистерская диссертация (СПбГУ, каф. биохимии). СПб., 1999. 112 с. 5. Anderson М., Zasloff М. Antimicrobial peptides: complementing classical inflammatory mechanisms of defense // Inflammation: basic principles and clinical correlates / Ed. by J. I. Gallin and R. Snyderman. 3rd ed. New York, 1999.
6. Beny F. В., O'Neil M. A., Coca-Prados M., Walter M. A. FOXC1 trascriptional regulatory activity is impaired by PBX1 in a filamin A-mediated manner// Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25. N 4. P. 1415-1424.
7. Birkemo G. A., Luders Т., Andersen O., Ingolf I. F., Nissen-Meyer J. Hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide in Atlantic halibut (Hippoglossus hippiglossus L.) // Biochim. Biophys. Acta. 2003. N 1646. P. 207-215. 8. Boman H. G. Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts // J. Intern. Med. 2003. Vol. 254. P. 197-215. 9. Brown A. C. The elimination of foreign particles injected into the coelom of holothurian Cucumaria stefensoni // Zool. Afr. 1967. Vol. 3. N 1. P. 1-3.10. Burton M. P. M. Echinoid coeiomic cells // Nature 1966. Vol. 211. P. 1095-1096. 11. Canicatti C. Lysosomal enzyme pattern in Holothuria polii //J. Invert. Path. 1990. Vol. 56. P. 70-74.12. Canicatti C., D 'Ancona G. Cellular aspects of Holothuria polii immune response //J. Invert. Path. 1989. Vol. 53. P. 152-158. 13. Canicatti C., Quaglia A. Ultrastructure of Holothuria polii encapsulating body //J. Zool. Lond. 1991. Vol. 224. P. 419-429.14. Cho J. #., Park I. Y„ Kim M. 5., Kim S. C. Matrix metalloproteinase 2 is involved in the regulation of the antimicrobial peptide parasin I production in cat.sh skin mucosa // FEBS Lett. 2002. Vol. 531. P. 45-463. 15. D'Addario A/., Arora P. D„ Ellen R. P., McCulloch C. A. G. Interaction of p38 and Spl in a mechanical force-induced integrin-mediated transcriptional circuit that regulates the actin-binding protein filamin-A //J. Biol. С hem. 2002. Vol. 277. N 49. P. 47541-47550.16. FamaudS., Evans R. \V. Lactoferrin-a multifunctional protein with antimicrobial properties // Mol. Immunol. 2003. Vol. 40. P. 395-405.17. FemandesJ. M., Kemp G. D„ Molle G. D. G., Smith V.J. Antimicrobial properties ofhistone H2A from skin secretions of rainbow trout, Onchorynchus mykiss // Biochem. 2002. Vol. 368. P. 611-620.18. FemandesJ. A/., Molle G., Kemp G. D., Smith V.J. Isolation and characterization of oncorhyncin II, a histone Hl-derived antimicrobial peptide from skin secretions of trout, Oncorhynchus mykiss // Dev. Сотр. Immunol. 2004. Vol. 28. P. 127-138.19. Fogaca A. C., da Silva P., Miranda M. Т., Bianchi A. G., Miranda A., Ribolla P. E., Daffre S. Antimicrobial activity of a bovine hemoglobin fragment in the tick Boophilus microplus //J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 25330 25334. 20. Hancock R. E. W., Diamond G. The Role of cationic antimicrobial peptides in innate host
defenses // TRENDS Microbiol. 2000. Vol. 8. N 9. P. 402-410. 21. Hancock R. E. W„ Scott M. G. The Role of cationic antimicrobial peptides in animal defenses // PNAS. 2000. Vol. 97. N 16. P. 8856-8861. 22. Harwig S. S., Chen N. P., Park A. S. K., Lehrer R. I. Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leukocytes by continuous acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol. 208. p. 382-386. 23. Haug T„ Kjuul /4. K„ Styrvold O. B., Sandsdalen £., Olsen O. M., Stenvag K. Antibacterial activity in Strongelocentrotus droebachiensis (Echinoidea), Cucumaria frondosa (Holothuroidea), and Asterias rubens (Asteroidea) //J. Invert. Path. 2002. Vol. 81. P. 94-102. 24. He H.-J., Kole 5., Kwon Y.-K., Crow M. T., Bernier M. Interaction of filamin A with insulin receptor alters insulin-dependent activation of the mitogen-activated protein kinase pathway //J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. N. 29. P. 27096-27104. 25. Huang H. W. Action of antimicrobial peptides: two state model // Biochemistry. 2000. Vol. 39. N 29. P. 8348-8354. 26. Ibrahim H. R., Iwamori £.. Sugimoto Y„ AokiT. Identification of a distinct antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1401. P. 289-303. 27. Ibrahim H. R., Thomas I J., Pellegrini A. A helix-loop-helix peptide at the upper lip of the active site cleft of lysozyme confers potent antimicrobial activity with membrane permeabilization action//J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 43767-43774.28. IwanagaS. The molecular basis of innate immunity in the horseshoe crab // Curr. Opin. Immunol. 2002. Vol. 14. P. 87-95, 29 .Johnson P. T. The coeloinic elements of sea urchin (Strongelocentrotus). 1. The normal coelomocytes; their morphology and dynamics in hanging drops //J. Invert. Path. 1969. Vol. 13. P. 24-41.30 .JollesJ., Jolles P. The lysozyme from Asterias rubens // Eur. J. Biochem. 1975. Vol. 54. P. 19-23. 31. Kim H. S., Yoon II., Minn I., Park C. B., Lee W. 7'., ZasloffM., Kim S. C. Pepsin-mediated processing of the cytoplasmic histone H2A to strong antimicrobial peptide buforin I //J. Immunol. 2000. Vol. 165. P. 32668-32674. 32. LassingL, Lindberg U. Specificity of interaction between phosphatidylinositol 4,5-biphosphate and the profilin: actin complex //J. Cell Biochem. 1988. Vol. 37. P. 255-267. 33. Lehrer R. /., Rosenman M., Harwig S. S. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides.//J.Immunol.Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173. 34. LeonardiA., Ellinger-Ziegelbauer H„ Franzos G., Brown K„ Siebenlist U. Physical and functional interaction of filamin (actin-binding protein 280) and tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 //J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. N 1. P. 271-280. 35. Liebmann E. The leucocytes of Arbacia punctulata // Biol. Bull. 1950. Vol. 98. N 1. P. 46-59. 36. Loo D. T., KannerS. B.t Aruffo A. Filamin binds to the cytoplasmic domain of the Ll-integrin. Identification of amino acids responsible for this interaction //J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 23304-23312.37. Loy C.J., Sim K. S., Yong E. L. Filamin-A fragment localizes to the nucleus to regulate androgen receptor and coactivator functions // PNAS. 2003. Vol. 100. N. 8. P. 4562-4567. 38. Marti A., Luo Z, Cunningham C, Ohta Y., HartwigJ., Stossel T. P., Kyriakis J. M., Avruch J. Actin-binding protein-280 binds the stress-activated protein kinase (SAPK) activator SEK-1 and is required for tumor necrosis factor-K activation of SAPK in melanoma cells //J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 2620-2628. 39. Masson P. L. La lactoferrine. Proteine des secretions externes et des leucocyte neutriphiles. Bruxelles. 1970. 40. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interaction utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462. P. 1-10.41 .MengX., Yuan Y„ MaestasA., Shen Z. Recovery from DNA Damage-induced G2 arrest requires actin-binding protein filamin-A/Actin-binding protein 280 //J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. N 7. P. 6098-6105.42. Mitta G„ Vandenbulcke F., NoelT., Romestand
B., BeauvillainJ. C., Salzet.M., RochP. Differential distribution and defense involvement of antimicrobial peptides in mussel //J. Cell Sci. 2000. Vol. 133. P. 2759-2769. 43. Mitta G., Vandenbulcke F„ Roch P. Original involvement of antimicrobial peptides n mussel innate immunity // FEBS Lett. 2000. Vol. 486. P. 185-190. 44. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 130. N 2. P. 337-346.45. Park I. Y„ Park C B„ Kim M. 5., Kim S.
C. Parasin I, an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the carfish, Parasilurus asotus // FEBS Letters 1998. Vol. 437. P. 258-262.46. Pellegrini A., Dettling C„ Thomas U., HunzikerP. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine h-lactoglobulin // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1526. P. 131-140. 47. Pellegrini A., Hulsmeier A.J., HunzikerP., Thomas U. Proteolytic fragments of ovalbumin display antimicrobial activity // Biochim. Biophys. Acta. 2004. N 1672. P. 76-85. 48. Pellegrini A., Thomas U„ Bramaz N„ Hunziker P., von Fellemberg R. Isolation and identification of three bactericidal domains in the bovine a-lactalbumin molecule // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1426. P. 439-448.49. Petterson A. Ueber die bacterizeden leukocytens Stoffe und ihre
Beziehungen // Iramunitat und Bacteriol. 1905. Vol. 139. P. 423-437.50. Prat A. G„ Cunningham C. C„ Jackson G. R., Borkan S. C., Wang Y., Ausiello D. A., Cantieilo H. F. Actin filament organization required for proper camp-dependent activation of CFTR // Am. J. Physiol. 1999. Vol. 277. P. 1160-1169. 51. Robinette D., Wada S., Arroll T., Levy M. G., Miller W. L„ Noga E.J. Antimicrobial activity in the skin of the channel catfish Ictalurus punctatus: characterization of broad-spectrum histone-like antimicrobial proteins // Cell. Mol. Life Sci. 1998. Vol. 54. P. 467-475. 52. SchaggerH., vonJagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis for separation of protein in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. P. 368-379. 53. Schroeder J.-M. Epithelial antimicrobial peptides: innate local host response elements // Cell. Moll. Life Sci. 1999. Vol. 56. P. 32-46. 54. Scott M. G., Hancock R. E. W. Cationic antimicrobial peptides and their multifunctional role in the immune system // Crit. Rev. Immunol. 2000. Vol. 20. P. 407-431. 55. Shai Y., Oren Z. From «carpet» mechanism to de-novo designed diastereometric cell-selective antimicrobial peptides // Peptides. 2001. Vol. 22. P. 1629-1641. 56. Smith L. C., Britten R.J., Davidson E. H. SpCoell: a sea urchin profillin gene expressed specifically in coelomocytes in response to injury // Mol. Biol. Cell. 1992. Vol. 3. P. 403-414. 57. Smith L. C., Britten R.J., Davidson E. H. Lipopolysaccharide activates sea urchin immune system // Dev. Comp. Immunol. 1995. Vol. 19. P. 217-224. 58. Taylor S. W., Craig A. G., Fischer W. H„ ParkM., Lehrer R. I. Styelin D, an extensively modified antimicrobial peptide from ascidian hemocytes // J. Biol. Chein. 2000. Vol. 275. N 49. P. 38417-38426. 59. Van derFlierA., SonnenbergA. Structural and functional aspects of filamins// Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1538. P. 99-117.60. Vethamany V. Gt., FungM. The fine structure of coelomocytes of the sea urchin Strongelocentrotus droebachiensis / Can. J. Zool. 1971. Vol. 50. P. 77-81. 61. Wang Y., Griffiths J., Jomval H„ Agerberth B., Johansonn J. Antibacterial peptides in stimulated human granulocytes. Characterization of ubiquitinated histone HI A// Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 512-518.62. WardlawA. C., UnklesS. E. Bactericidal activity in coelomic fluid of sea urchin Echinus esculensis //J. Invert. Path. 1978. Vol. 32. P. 25-34. 63. Yoshida N., Ogata T., Tanabe K., Li S., Nakazato M., Kohu K., Takafuta T., Shapiro 5., Ohta Y., Satake M., Watanabe T. Filamin A-bound PEBP2P is retained in the cytoplasm and prevented from functioning as a partner of Runxl transcriptional factor // Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25. N 4. P. 1003-1012. 64. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. Vol. 415. P. 389-395.65. ZuchtH. £>., Raida M., Adermann K., Magert H. D., Forssmann W. G. Casocidin-I: a casein-alpha derived peptides exhibits antibacterial activity // FEBS Lett. 1995. Vol. 372. P. 185-188.
Статья принята к печати 2 октября 2006 г.
