CC BY
0
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2024. Т. 79. № 1 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2024. Vol. 79. No. 1
удк 631.453 Кфттагта
DOI: 10.55959/MSU0137-0944-17-2024-79-1-51-60
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МЕТАБОЛИТОВ ПОЧВЕННЫХ СТРЕПТОМИЦЕТОВ-ХИТИНОЛИТИКОВ
Г. А. Терегулова1, Н. А. Манучарова1*, Н. А.Уразбахтина2, Н. С. Жемчужина3, Л. И. Евтушенко4, А. Л.Степанов1
1 МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, 119991, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
2 Научно-образовательный центр, Башкирский государственный аграрный университет, 450001, Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, д. 34
3 Государственная коллекция фитопатогенных микроорганизмов, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии», 143050, Россия, Московская область, Одинцовский район, р. п. Большие Вяземы, ул. Институт, вл. 5
4 Всероссийская коллекция микроорганизмов, 142290, Россия, Московская область, г. Пущино, пр-т Науки, д. 5 * E-mail: manucharova@mail.ru
Из горно-лесных серых, темно-серых лесных почв и чернозема типичного было выделено сто пятьдесят штаммов стрептомицетов. Выделенные штаммы проанализированы на антимикробную активность на питательных средах и в серой лесной почве in Vitro против двадцати трех коллекционных патогенных тест-культур грибов и бактерий. Четыре биологически активных изолята с широким спектром действия были идентифицированы и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национально-исследовательского центра «Курчатовский институт» под номерами Streptomyces xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, Streptomyces anulatus TG ВКПМ Ас-2203, Streptomyces sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, Streptomyces flavovirens TT ВКПМ АС-2202. Исследование влияния предпосевной обработки семян пшеницы 15-суточными культуральными жидкостями штаммов S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205 на показатели всхожести и зараженность инфекцией F. graminearum выявило, что они ингибировали рост патогенного гриба, улучшали показатели энергии прорастания и всхожести пшеницы. Полученные штаммы почвенных актиномицетов могут быть использованы в биотехнологии при создании новых биоинокулянтов для борьбы с фитопатогенными бактериями и грибами, стимулирования роста растений, биоремедиации почв при экологическом земледелии.
Методом ВЭЖХ идентифицированы специализированные антимикробные метаболиты моноспоровых суспензий штаммов, такие как антибиотики N-Butylbenzenesulfonamide, 1-(1H-Benzo[d]imidazol-2-yl)ethan-1-ol, 2-[(3S)-1-(Cyclohexylmethyl)-3-pyrrolidinyl]-1H-benzimidazole-5-carbonitrile, Cyclo(leucylprolyl), Cy-clo(phenylalanyl-prolyl), антисептики Cetrimonium и Carvone, фитогормон Indole-3-acetic acid.
Наблюдение за динамикой развития интродуцируемых исследуемых актинобактерий в почвенных образцах показало высокую активность стрептомицетов, использующих хитин. Анализ разнообразия про-кариотного комплекса исследуемых образцов почв методом высокопроизводительного секвенирования консервативного участка гена 16S рРНК выявил при интродукции S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 его контролирующую роль микробного сообщества за счет антибиотикообразующей активности.
Ключевые слова: актиномицеты, стрептомицеты, хитинолитические, специализированные метаболиты, антибиотики.
Введение
Хитиназная активность актинобактерий связана с высоким содержанием хитина в клеточной стенке грибного мицелия. У прокариот актинобак-терии являются одними из лучших деструкторов хитина. Они могут использовать хитин или хитозан в качестве источников углерода и азота и обладают набором ферментов для разложения хитина. Способность продуцировать экзоферменты хитиназы
и вторичные метаболиты антибиотики определяет влияние актиномицетов на плотность популяций фитопатогенных грибов и бактерий. Таким образом, хитинолитические актинобактерии имеют высокий потенциал как агенты биоконтроля фитопатогенов в почвах [Варламов и др. 2020; Ва1ег е! а1., 2016].
Более 90% антимикробных препаратов, используемых в медицине, выделено из актиномицетов, обитающих в почве [НатаЫ е! а1., 2005]. Актиномицеты, особенно виды Streptomyces и редкие акти-
© Терегулова Г.А., Манучарова Н.А., Уразбахтина Н.А., Жемчужина Н.С., Евтушенко Л.И., Степанов А.Л., 2024
номицеты, являются богатыми источниками антибиотиков [Berdy, 2005]. Актиномицеты являются продуцентами различных антибиотиков, химическая структура которых варьируется от относительно небольших производных в-лактама до более крупных производных макролидов. С химической точки зрения существуют разные классы антибиотиков, продуцируемых актиномицетами: аминогли-козиды, пептиды, ансамицины, в-лактамы, тетра-циклины, макролиды, линкозамиды, эпоксиды и аминокумарины [De Simeis, Serra, 2021].
Целью нашего исследования был поиск почвенных хитинолитических актиномицетов, продуцирующих специализированные метаболиты с антибиотической активностью, и определение их влияния на микробные сообщества почв.
Материалы и методы
Исследования проводили с чистыми культурами стрептомицетов, выделенных из почв разных районов Башкортостана. Местоположение точек отбора определяли с использованием системы GPS. Образцы почв отбирали из горизонтов А1 на глубине 10 см. Некоторые химические характеристики почв приведены в табл. 1.
Почву предварительно обогащали хитином (0,6% от массы почвы) и прединкубировали при влажности 60% от массы почвы и при температуре 27°С в течение недели. Использовали очищенный хитин фирмы Sigma-Aldrich, после чего произво-
дили высев из почвы и выделяли чистые культуры хитинолитических актиномицетов.
Культуральные среды. Для выделения из почвенных образцов хитинолитических микроорганизмов использовали среду, в которой в качестве единственного источника углерода и азота был хитин следующего состава: коллоидный хитин — 4 г-л-1, KH2PO4 — 0,3 г-л-1, K2HPO4 — 0,7 г-л-1, MgSO4x7H2O — 0,5 рл-1, FeSO4x7H2O — 0,01 г-л-1, ZnSO4x7H2O — 0,01 рл-1, MnCl2x4H2O — 0,01 г-л-1, а также минеральный агар Гаузе № 1: крахмал растворимый — 20,0 г-л-1, К2НРО4 — 0,5 г-л-1, MgSO4 — 0,5 рл-1, NaCl — 0,5 г-л-1, KNO3 — 1,0 г-л-1, FeSO4 — 0,01 г-л-1 и минеральный агар Гаузе № 2: триптон — 2,5 г, NaCl — 5,0 г, пептон — 5,0 г, глюкоза — 10,0 г, вода — 1000 мл; рН 7,0—7,4. В среды добавляли нистатин (50 мкг-мл-1) для подавления роста грибов, налидиксовую кислоту (10 мкг-мл-1), тобрамицин (10,0 мкг-мл-1), ампициллин (10,0 мкг-мл-1) для подавления роста немице-лиальных бактерий, тиамин (4 мкг-мл-1) [Зенова, 2000].
Погруженное культивирование стрептомице-тов проводили на среде с хитином в колбах Эрлен-мейера объемом 200 мл со 100 мл культуральной среды на качалках Environmental Shaker ES-20 со скоростью180 об/мин. В жидкие среды с хитином инокулировали по 1 см2 агаровых сред с поверхностным ростом стрептомицетов. На четвертые, десятые сутки полученные культуральные жидкости
Таблица 1
Основные химические свойства почвы исследуемых образцов
Образец Классификация по WRB Место отбора С„р„ % рНводн. РНсол. Азот валовый, %
Горно-лесные серые среднесуглинистые Grey mountain-forest soil / Luvic Retic Greyzemic Phaeozems (Loamic) (Белорецкий р-н РБ), хвойный лес. Широта: 54,36254°. Долгота: 57,55860°. 16,17 6,65 5,41* 0,75
Темно-серые лесные среднесуглинистые Dark-grey forest soil / Greyic Phaeozems (Гафурийский р-н РБ, санаторий Красноусольский), широколиственный лес. Широта: 53,89323°. Долгота: 56,46660°. 22,48 6,35* 6,88 0,62
Чернозем типичный обыкновенный мощный тяжелосуглинистый на лёссовидных суглинках Typicalchernozem / c Haplic Chernozem (Clayic) (Кушнаренковский р-н, РБ), луг. Широта: 54,974399°. Долгота: 55,004585°. 15,0 7,50 7,1 0,42
Серая лесная почва Grey forest soil / Luvic Retic Greyzemic Phaeozem (Loamic) (Чишминский р-н РБ), березовый лес. Широта: 54,372072. Долгота: 55,364118. 9,60 6,7 6,40 0,25
Слабокислые *5,5-6,5 Слабокислые *5,1-5,5
Слабощелочные 7,0-7,5 Нейтральные 6,0-7,0
(КЖ) отбирали для исследований антибиотической активности в объеме 95 мл, остаток в количестве 5 мл вносили в колбы для культивирования в новой среде. На 15-е сутки отбирали пробы по 100 мл для определения антибиотической активности методом перпендикулярных штрихов и проведения исследований по идентификации вторичных метаболитов методом хромато-масс-спектрометрического анализа.
Выделенные нами культуры были депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национально-исследовательского центра «Курчатовский институт».
Оценивали антибиотические свойства штаммов культур Streptomyces xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, Streptomyces anulatus TG ВКПМ Ас-2203, Streptomyces sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, Streptomyces flavovirens TT ВКПМ АС-2202 на твердых (агаризо-ванных) питательных средах методом блоков.
Степень антибиотической активности определяли по диаметру зоны ингибирования роста грибных тест-культур Helminthosporium sativum, Fusarium graminearum, Botrytis byssoidae, Fusari-um poae, Fusarium culmorum 9258, Fusarium oxys-porum, Fusarium sporotrichiodes 35108 из Коллекции микроорганизмов кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова и Коллекции микроорганизмов и клеточных культур Башкирского государственного аграрного университета, патогенных грибов Phytophthora infestans штаммов 2020.Кал.О.14.6К, 2020.М.О.44.4К, P08ATF40 и бактериальных тест-культур Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius С-4015, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens штаммов 2078, 2311, Xanthomonas translucens П-1244, Xanthomonas vesicatoria штаммов 403, 1244 из Государственной коллекции фитопатогенных организмов ВНИИФ, бактериальных тест-культур Staphylococcus aureus 44, Micrococcus luteus, Bacillus cereus 9, Pseudomonas fluorescents 70, Mycobacterium cyaneum 92, Escherichia coli из Коллекции культур кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (КМ МГУ), Streptomyces scabiei ВКМ Ас-305 из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Зоны подавления роста тест-микроорганизмов измеряли вручную с точностью ±1 мм. Каждый тест проводили в трехкратной повторности.
Проводили определение антибактериальной и антифунгальной активности для 4-, 10-, 15-суточ-ных культуральных жидкостей штаммов S. xiame-nensis TB ВКПМ Ас-2204, S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, S. flavovirens TT ВКПМ АС-2202 методом перпендикулярных штрихов [Сизенцов, 2009].
Показатели токсичности почвы после интродукции 15-суточных КЖ исследуемых штаммов по отношению к тест-микроорганизмам определя-
ли с помощью качественного метода. В стерильную чашку Петри вносили 10 г перемешанной и просеянной частично стерилизованной серой лесной почвы с помощью микроволнового облучения (800 Дж-г-1, СВЧ-обработка) и ровным слоем распределяли на половину дна чашки. В почву вносили по 2 мл 15-суточных КЖ исследуемых штаммов стреп-томицетов. Затем в чашки вносили питательный агар также в количестве 10 см3, адекватный тест-микроорганизмам. Рост колоний только на участке агаровой пластинки, под которой нет почвы, показывает, что исследованный почвенный образец токсичен по отношению к тест-микроорганизму. При исследовании некоторых почвенных проб отмечается частичное ингибирование роста тест-микроба. В этих случаях регистрируется маловы-раженная токсичность [Методические указания.., 2021].
Для оценки влияния на почвенное сообщество изучаемых штаммов стрептомицетов проводили модельные лабораторные опыты с интродукцией 15-суточных КЖ штаммов микроорганизмов в почвенные образцы. Серую лесную почву и чернозем типичный просеивали через сито (3 мм) и измельчали до однородного состояния, затем вносили моноспоровую суспензию (обработанную ультразвуком в течение двух минут) 15-суточных КЖ культур Streptomyces species в концентрации 109 спор-мл-1 (по 20 мл на 200 г почвы) [Новикова, 2005]. Эксперимент включал восемь вариантов опыта: почва, обогащенная моноспоровой суспензией, почва, обогащенная суспензией хитина (0,6% от массы почвы), почва с добавлением хитина и моноспоровой суспензии; в качестве контрольных образцов рассматривали почву, увлажненную стерильной водой. Влажность во всех опытных вариантах составляла 60% от массы образца. В исследуемых вариантах в процессе сукцессии оценивали динамику эмиссии диоксида углерода, накопление биомассы и проводили метагеномный анализ (на 15-е сутки эксперимента).
Изучение эмиссии диоксида углерода культурами актиномицетов проводили на газовом хроматографе с детектором по теплопроводности (модель 3700). Длина колонки 3 м, наполнитель Полисорб-1. Скорость потока газа-носителя (Не) — 25 мл-мин-1.
Оценку разнообразия и численности метаболически активных представителей отдельных филогенетических групп хитинолитических микроорганизмов рассматриваемых почв проводили с помощью метода in situ-гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олиго-нуклеотидными зондами (FISH — fluorescent in situ hybridization) [Amann et al., 1990] с модификацией метода для работы с почвой [Манучарова и др., 2008].
Для анализа разнообразия прокариотного комплекса исследуемых образцов почв применяли
метод высокопроизводительного секвенирования консервативного участка гена 16SрРНК. Для экстракции тотальной ДНК применяли стандартные методы Power Soil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя. Амплификацию фрагментов гена 16S рРНК осуществляли с помощью вырожденных праймеров, комплементарных последовательностям как бактерий, так и архей: PRK341F (CCTACGGGRBGCASCAG) и PRK806R (GGACTACYVGGGTATCTAAT). Полученные ПЦР-фрагменты очищали на колонках QIAquick согласно протоколу производителя. Каждый ПЦР-фрагмент растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера, полученного материала было достаточно для дальнейшего анализа. Нуклеотидные последовательности вариабельных фрагментов генов 16S ри-босомальных РНК из образцов метагеномной ДНК определяли с помощью высокопроизводительного секвенирования. Секвенирование проводили на полигеномном секвенаторе Illumina Miseq, время прочтения 39 ч, количество pair-endreads (парных
прочтений) 8 млн по методике [Манучарова и др., 2008; Manucharova et al., 2020]. Все пробы почв анализировали в 5-кратной повторности (каждый вариант включал пять повторений).
Исследование антибиотической активности исследуемых штаммов стрептомицетов против фузариозной инфекции семян пшеницы. В модельных лабораторных опытах проводили предпосевную обработку семян пшеницы мягкой яровой сорта Кинельская Юбилейная и оценивали ее влияние на энергию прорастания, всхожесть и зараженность патогенным грибом Fusarium grami-nearum. Семена пшеницы обеззараживали в 3% растворе перекиси водорода, затем замачивали в течение трех часов в трех вариантах КЖ стрептомицетов: 4-, 10-, 15-суточных; в контрольных — в стерильной водопроводной воде. Семена подсушивали на воздухе 3-4 часа, после чего заражали пятисуточной суспензией спор гриба F. graminearum (6х106 спор-г-1). Обработанные семена помещали по 100 штук в стерильные лотки со слоем фильтро-
100%
90%
80%
70%
g 60%
£ 50%
40%
30%
20%
10%
0%
d_Bacteria;p_Actinobacteriota;c_Actinobacteria
d_Bacteria;p_Proteobacteria;c_Gammaproteobacteria
d_Bacteria;p_Bacteroidota;c_Bacteroidia
d_Bacteria;p_Patescibacteria;c_Saccharimonadia
d_Bacteria;p_Proteobacteria;c_Alphaproteobacteria
d_Bacteria;p_Verrucomicrobiota;c_Verrucomicrobiae
d_Bacteria;p_Firmicutes;c_Bacilli
d_Bacteria;p_Actinobacteriota;c_Thermoleophilia
d_Bacteria;p_Acidobacteriota;c_Vicinamibacteria
d_Bacteria;p_ Acidobacteriota;c_Holophagae
d_Bacteria;p_Actinobacteriota;c_Acidimicrobiia
d_Bacteria;p_Acidobacteriota;c_Blastocatellia
d_Bacteria;p_Gemmatimonadota;c_Gemmatimonadetes
d_Bacteria;p_Myxococcota;c_Polyangia
d_Bacteria;p_Bdellovibrionota;c_Bdellovibrionia
d_Bacteria;p_Fibrobacterota;c_Fibrobacteria
Рис. 1. Графическое сравнение обилия бактерий по исследованным образцам чернозема типичного и серой лесной почвы. Ось ординат отображает обилие (Relative Frequency) в %. Цифрами по оси абсцисс обозначены образцы почв: 1 — необработанная серая лесная почва на 7-е сутки (контроль), 2 — необработанная серая лесная почва на 15-е сутки (контроль), 3 — серая лесная почва + S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 на 15-е сутки, 4 — серая лесная почва + S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 + хитин на 7-е сутки, 5 — серая лесная почва + S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 + хитин на 15-е сутки, 6 — серая лесная почва + хитин на 15-е сутки, 7 — чернозем необработанный на 15-е сутки (контроль), 8 — чернозем + хитин на 15-е сутки
вальной бумаги, увлажненной стерильной водой. Семена проращивали при температуре 20°С в термостате в течение семи дней. Повторность опыта 3-кратная [Новикова, 2005]. Независимая проверка влияния предпосевной обработки семян куль-туральными жидкостями исследуемых штаммов на показатели энергии прорастания и всхожести семян, биофунгицидного потенциала выделенных нами бифункциональных штаммов актиномицетов проведена в Испытательной лаборатории филиала ФГБУ «Россельхозцентр» по Республике Башкортостан согласно ГОСТ Р 52325-2205 «Семена сельскохозяйственных растений. Сортовые и посевные качества. Общие технические условия». Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 10.0.
Для хромато-масс-спектрометрического анализа использовали систему ВЭЖХ Waters Aquity UPLC (Thermo Scientific), последовательно соединенную с масс-спектрометрическим детектором Q-Exactive HF-X (ThermoScientific) с электроспрей-ным источником ионизации (на оборудовании Сколковского института науки и технологий).
Материалы и буферы: вода (очищена в системе Milli-Q Integral 3), ацетонитрил (Fisher Scientific), метанол (Fisher Scientific), муравьиная кислота (Sigma).
Биоинформатическая обработка результатов хромато-масс-спектрометрического анализа. Полученные RAW-файлы конвертировались в формат MGF с помощью приложения MS convert (ProteoWizard 3.0). Идентификация метаболитов проводилась с помощью программного обеспечения Compound Discoverer 2.0 (Thermo Scientific) по базе данных mzCloud по стандартному протоколу для анализа метаболитов с точностью m/z = 3 ppm (MS1) и m/z = 10 ppm (MS2).
Таблица 2
Показатели токсичности почвы после интродукции 15-дневных КЖ исследуемых штаммов по отношению к тест-микроорганизмам
Тест-микроорганизмы Токсичность почвы
Штаммы актиномицетов
S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 S. sindenensis TK Ас-2205 S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203 S. flavovirens TT ВКПМ АС-2202 Контроль
Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius 4015 М/Т* Т** Т -*** -
Xanthomonas translucens 1244 Т Т Т - -
Pseudomonas syringae pv. atrofa-ciens п-2311 Т Т Т - -
Phytophthora infestans М.О.44.4К - T - Т -
Phytophthora infestans P08ATF40 T T - Т -
Phytophthora Infestans О.14.6К T M/Т М/Т Т -
Streptomyces scabiei ВКМ Ас-305 T Т Т Т -
Примечание: *Т — токсична; **М/Т — частично токсична; *** — нетоксична.
Мкг • г-1
75
I
60 45 30 15 0
С/л-контроль С/л+хитин С/л+хитин+Str С/л+Str
Рис. 2. Биомасса метаболически активных групп домена Bacteria в исследуемых вариантах образцов серой лесной почвы (С-л-1) на 15-е сутки
Результаты
Метагеномные исследования выявили изменение структуры бактериальной компоненты в рассматриваемых вариантах опыта (рис. 1). Добавление хитина сильно меняет структуру сообщества. Возрастание биомассы в первую очередь связано с увеличением численности актинобактерий. При внесении S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 на фоне хитина разнообразие восстанавливается и приближается к контрольному варианту. Очевидно, что стрептомицет играет роль контролирующей компоненты сообщества за счет антибиотикообразующей активности, направленной в данном конкретном случае на конкурентов актинобактерий-хитино-литиков.
Эмиссия СО2 в процессе деструкции хитина в почвенных образцах с интродуцируемым штаммом S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 была в пять раз выше по сравнению с контролем и достигала 51 мкг/г почвы в сутки. Параллельно с наблюдением за динамикой эмиссии СО2 из почв измеряли
биомассу метаболически активных представителей домена Bacteria в различных вариантах опыта. Добавление стрептомицета S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 на фоне хитина снижало общую биомассу метаболически активных бактерий, что очевидно связано с его антибиотикообразующей активностью в отношении, как было показано, таких бактерий, как Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus (рис. 2).
Антибиотическая активность выделенных штаммов на питательных средах in Vitro. Активное ингибирование штамма возбудителя базального бактериоза злаковых культур Pseudomonas syringae pv. atrofaciens проявили исследуемые штаммы S. an-ulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. flavovirens TT ВКПМ АС-2202. Штамм S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 был наиболее активен в отношении представителей родов фитопатогенных грибов Helmintho sporium с зоной подавления 20-30 мм, Botrytis byssoidae, Fusarium graminearum, F. poae, F. culmorum, F. oxysporum, F. sporotrichiodes, возбудителей фитофтороза картофеля и томата Phytophthora infestans, штамма Micro-coccus luteus с зоной подавления роста тест-штамма
21 мм, возбудителя парши картофеля S. scabiei ВКМ Ас-305, возбудителя черного бактериоза зерновых культур Xanthomonas translucens и полным лизисом штамма Escherichia coli.
Штамм S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205 показывал интенсивную антибиотическую активность и подавление роста штаммов патогенных грибов Helmintho sporium sativum, F. poae c зоной ингиби-рования 20-25 мм, полным лизисом E. coli, активно подавлял рост Phytophthora infestans, штамма Micro-coccus luteus с зоной подавления роста тест-штамма
22 мм, ингибировал штаммы S. scabiei ВКМ Ас-305, Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius, Xanthomo-nas translucens.
Штамм S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203 активно подавлял тест-микроорганизмы Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius С-4015, Xanthomonas translucens, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens.
Штамм Streptomyces flavovirens TT ВКПМ АС-2202 был активен против штаммов Phytophthora infestans, Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens, S. scabiei ВКМ Ас-305.
Токсичность почвы. Антимикробную активность 15-суточные культуральные жидкости исследуемых штаммов стрептомицетов проявили при интродукции в почву in Vitro в отношении фитопатогенных бактерий Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens, Xanthomonas translucens, а также патогенного гриба Phytophthora infestans и возбудителя парши картофеля S. scabiei ВКМ Ас-305 (табл. 2).
Антибиотическая активность штаммов S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205 против фузариозной инфекции семян пшеницы. Наибольшая всхожесть семян со значениями 96 и 94% наблюдалась в варианте с 4- и 15-суточной культуральной жидкостью S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, т. е. выше, чем в контроле с водой (91%) при нормативном показателе по ГОСТ — 92%. Значительное подавление гриба F. graminearum наблюдалось в варианте с 15-суточной культуральной жидкостью штамма S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204: зараженность проростков пшеницы снижалась до 4% (в контроле с водой заражение составило 13%). В варианте с обработкой 10-, 15-суточными КЖ S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205 показатели всхожести были выше, чем в контроле, и выше нормативных. Штамм также ингибировал патогенный гриб F. graminearum. Обработка семян культуральной жидкостью штамма S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203 увеличила показатели всхожести до 94% по сравнению с 91% в контроле и 92% по нормативу и снижала зараженность патогеном F. graminearum до 6%. Все варианты КЖ штамма ингибировали патогенный гриб F. graminearum.
Методом хромато-масс-спектрометрии был проведен анализ образцов низкомолекулярных веществ из смывов с ростовой среды штам-
Таблица 3
Специализированные метаболиты штамма 5. х1атепет1$ ТВ ВКПМ Ас-2204, идентифицированные по базе данных шгС1о^
mzCloud ID Формула Молекулярная масса Наилучшее совпадение Наименование
2592 C19 H41 N 283,3239 96,9 Cetrimonium
7656 C11 H18 N2 O2 210,1368 93,2 Cyclo(leucylprolyl)
2705 C10 H15 N O2 S 213,0824 92,5 N-Butylbenzenesulfonamide
8022 C18 H28 O4 308,19828 51,6 2-[(3S)-1-(Cyclohexylmethyl)-3-pyrrolidinyl]-1H-benzimidazole-5-carbonitrile
7685 C14 H16 N2 O2 244,1212 91,6 Cyclo(phenylalanyl-prolyl)
372 C9 H10 N2 O 162,07918 67,8 1-(1H-Benzo[d]imidazol-2-yl)ethan-1-ol
486 C10 H14 O 150,10437 89,7 Carvone
165 C10 H9 N O2 175,06321 77,9 Indole-3-acetic acid
мов S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, S. flavovirens TT ВКПМ АС-2202, показавших хорошую антимикробную активность. Полученные спектры визуализированы в программе Xcalibur QualBrowser (Thermo Scientific).
В результате биоинформатической идентификации субстанций в образцах 15-суточных культу-ральных жидкостей исследуемых стрептомицетов были определены наиболее вероятные метаболиты с совпадением с референсными спектрами фрагментов из базы данных mzCloud более 50% (Best Match).
Исследуемые штаммы S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, S. flavovirens TT ВКПМ АС-2202 содержали в 15-суточных КЖ специализированный метаболит антифунгальный антибиотик N-Butylb-enzenesulfonamide, по литературным данным активный против нескольких видов фитопатогенных грибов: Pythium ultimum, Phytophtora capsiei, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea [Keun et al., 2000].
Штамм S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 вырабатывал также специализированные антимикробные метаболиты 1-(1H-Benzo[d]imidazol-2-yl) ethan-1-ol, 2-[(3S)-1-(Cyclohexylmethyl)-3-pyrro-lidinyl]-1H-benzimidazole-5-carbonitrile, Cyclo(leu-cylprolyl), Cetrimonium, Cyclo(phenylalanyl-prolyl), Carvone (табл. 3).
Обсуждение
Штаммы S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, S. flavovirens TT ВКПМ АС-2202 проявили антибактериальную и антифунгальную активность.
Антимикробную активность исследуемые штаммы стрептомицетов на плотных питательных средах проявили в отношении грамположи-тельных (Staphylococcus aureus 44, Bacillus cereus 9, Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius С-4015) и грамотрицательных (Escherichia coli, Pseudomonas fluorescents 70, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens 2078, 2311, Xanthomonas translucens П-1244, Xan-thomonas vesicatoria 403, 1244) бактерий, а также патогенных грибов и возбудителя парши картофеля Streptomyces scabiei ВКМ Ас-305.
Исследование антибиотической активности штаммов в почвенных образцах выявило значительное ингибирование (более 50%) штамма возбудителя базального бактериоза злаковых культур Pseudomonas syringae pv. atrofaciens п-2311 выделенными штаммами S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204.
Наибольшая активность штамма S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 проявилась в отношении представителей родов фитопатогенных грибов возбудителей фитофтороза картофеля и томата Phytophthora infestans Р08АТF40, возбудителя парши картофеля
S. scabiei ВКМ Ас-305, возбудителя черного бактериоза зерновых культур Xanthomonas translucens 1244, также штамм частично ингибировал рост возбудителя бактериальной мозаичности пшеницы Clavibacter michiganensis subsp. Tessellarius 4015.
Штамм S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205 подавлял рост патогенов Phytophthora infestans М.О.44.4К, P08ATF40, активно ингибировал штаммы S. scabiei ВКМ Ас-305, Clavibacter michiganensis subsp. Tessellarius 4015, Xanthomonas translucens 1244, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens п-2311.
Наблюдение за динамикой развития интроду-цируемых исследуемых актинобактерий в почвенных образцах показало, что наибольшие значения эмиссии СО2 были обнаружены в вариантах с внесением стрептомицета на фоне хитина, что говорит о высокой хитинолитической активности исследуемых штаммов. Такие результаты указывают на высокую активность стрептомицетов, использующих хитин.
Исследование накопления биомассы метаболически активных представителей домена Bacteria в различных вариантах опыта выявило, что наибольшие значения биомассы отмечались в почве с хитином.
Предпосевная обработка семян пшеницы
штаммами S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, S. anulatus TG ВКПМ Ас-2203, S. sindenensis TK ВКПМ Ас-2205 ингибировала рост патогенного гриба F. graminearum, улучшала показатели энергии прорастания и всхожести пшеницы. При искусственном заражении семян F. graminearum степень развития зараженности проростков достигала 82%, в контрольном варианте —13%. Обработка семян 15-су-точными моноспоровыми суспензиями культураль-ных жидкостей стрептомицетов снизила ее до 4-6%, что является наилучшим показателем среди разных вариантов срока культивирования стрептомицетов. При обработке семян всеми вариантами моноспоровых суспензий штаммов (4-, 10-, 15-суточными) стрептомицетов увеличиваются средние показатели всхожести семян и снижается зараженность инфекцией по сравнению с контрольным вариантом с водой и вариантом с искусственным инфекционным фоном.
В четырех выделенных штаммах с использованием панорамной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) были определены наиболее вероятные вторичные метаболиты с совпадением с ре-ференсными спектрами фрагментов из базы данных mzCloud более 50% (Best Match). В 15-суточных КЖ четырех стрептомицетов обнаружен антифунгальный антибиотик N-Butylbenzenesulfonamide, в 15-суточной КЖ штамма S. xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204 идентифицированы также вторичные метаболиты, активные против патогенных бактерий и грибов, вирусов, соединения с противоопухолевой активностью, ферменты, участву-
ющие в стимуляции роста растений, в том числе антибиотики 2-[(3S)-1 -(Cyclohexylmethyl)-3-руггоМту1]-Ш-Ьеп21т1йа2о1е-5-сагЬопй:гйе/Альбо-циклин (антибиотик макролид), Cyclo(leucylprolyl), Cyclo(phenylalanyl-prolyl), 1-(1H-Benzo[d]imidazol-2-yl)ethan-1-ol, антимикробные соединения Cetrimonium и Carvone, фитогормон Indole-3-acetic acid (Индол-3-уксусная кислота).
1-(1H-Benzo[d]imidazol-2-yl)ethan-1-ol. Бенз-имидазол является гетероциклической группой, производные которой присутствуют во многих биологически активных соединениях и имеют разнообразное биологическое и клиническое применение. Бензимидазол рассматривается как потенциальное биоактивное гетероциклическое ароматическое соединение с различными биологическими активностями, такими как противовоспалительное, противопаразитарное, противомалярийное, антимикобактериальное, противоопухолевое, противовирусное, гипотензивное и противосу-дорожное действие [Tahlan et al., 2019]. Согласно литературным данным, результаты исследований подтверждают более низкую чувствительность к замещенным бензимидазолам грамотрицатель-ных бактерий по сравнению с грамположитель-ными. Было обнаружено, что среди используемых грамотрицательных бактерий наиболее чувствительными были Stenotrophomonas maltophilia и Bordetella bronchiseptica [Andrzejewska et al., 2004].
2-[(3S)-1-(Cyclohexylmethyl)-3-pyrro-lidinyl]-1H-benzimidazole-5 carbonitrile/Альбоци-клин (антибиотик макролид) является натуральным продуктом, обнаруженным у S. sp. OH-3984 [Takamatsu et al., 1996], S. maizeus [Liang et al., 2018], S. sparsus [Managamuri et al., 2017].
Цетримоний является натуральным продуктом, обнаруженным у Streptomyces mobaraensis. Относится, согласно данным PubChem, к веществам, используемым для лечения людей и животных, которые уничтожают вредные микроорганизмы или подавляют их активность.
Carvone — это антифунгальный агент, метаболит, который был обнаружен у Tanacetum vulgare, Lindera erythrocarpa, Saccharomyces cerevisiae (Yeast Metabolome Database (YMDB).
Cyclo(L-Leu-L-Pro) играет роль бактериального метаболита. Cyclo(L-Leu-L-Pro) был обнаружен у Streptomyces sp. KH-614. Исследования показали, что он активен в отношении патогенных грибов, таких как Pyricularia oryzae и Trichophyton rubrum, а также энтерококков, устойчивых к ванкомицину [Rhee K.-H., 2003; Li et al., 2012].
Cyclo(L-Leu-L-Pro), обнаруженный ранее в культуре Lactobacillus casei, проявил противогрибковую активность в отношении Penicillium sp. [Li et al., 2012]. Штамм Streptomyces blastmyceticus 12-6, выделенный из образца лесной почвы в районе Чхонан, проявлял сильную противогрибковую активность
в отношении растительных патогенных грибов. Бу-танольные экстракты культуральных фильтратов проявляли активность в отношении растительных патогенных грибов C. acutatum, C. coccodes, C. gloe-osporioides, F. oxysporum и T. roseum. Антибиотик Cyclo(L-Leu-L-Pro) меняет текстуру поверхности грибковых спор с гладкой поверхности на морщинистую. Ингибирование спор составляло от 56 до 100% [Yeon et al., 2019]. Было также обнаружено, что Cyclo(L-Leu-L-Pro) подавляет рост Ganoderma boninense и Candida albicans [Kwak et al., 2014].
Cyclo(phenylalanyl-prolyl) обнаружен у Streptomyces triangulatus, Streptomyces olivaceus, Streptomyces chrestomyceticus sp. ADP4, Streptomyces asenjonii KNN 42.f согласно данным PubChem. Была выявлена противоопухолевая активность метаболита Cyclo(phe-nylalanyl-prolyl) штамма Streptomyces nigra sp. nov, который рекомендован авторами исследования в качестве исходного материала для разработки противоопухолевых средств [Chen et al., 2018].
Indole-3-acetic acid. Индол-3-уксусная кислота (ИУК) — это фитогормон, стимулирующий рост растений. Способность синтезировать ИУК распространена среди актиномицетов, особенно эндофит-ных и ризосферных видов Streptomyces. Ассоциации между растениями и стимулирующими рост растений актиномицетами (PGPA — plant-growth-promoting actinomycetes) интенсивно изучались на протяжении многих лет. В общих чертах, PGPA, потенциально являющиеся микробными иноку-лянтами, могут принести пользу растению-хозяину благодаря двум основным стратегиям: модуляции фитогормонов (синтез ауксинов, гиббереллинов, цитокининов, выработке 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминазы) и повышению биодоступности питательных веществ (биологическая фиксация азота, солюбилизация фосфатов и выработка сидерофоров). Индол-3-уксусная кислота способствует более значительному росту корней, увеличивая их доступ к питательным веществам почвы и улучшая их развитие [Takahashi et al., 2022].
Заключение
В результате исследования было выделено четыре штамма почвенных хитинолитических стрептомицетов Streptomyces xiamenensis TB ВКПМ Ас-2204, Streptomyces anulatus TG ВКПМ Ас-2203, Streptomyces sindenensis TK ВКПМ Ас-2205, Streptomyces flavovirens TT ВКПМ АС-2202, способных продуцировать вторичные метаболиты с антибиотической активностью. Штаммы имеют широкий спектр активности против патогенных грибов, грамположительных и грамотрицательных бактерий на агаровых питательных средах и в серой лесной почве in Vitro. Несмотря на большое количество обнаруженных в стрептомицетах учеными всего мира антибиотических соединений, стрепто-мицеты продолжают оставаться потенциальными
источниками антимикробных специализированных метаболитов. Выделенные нами высокопродуктивные штаммы стрептомицетов могут быть использованы для разработки продуктов с антибиотической активностью и применения их в сельском хозяйстве и медицине.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Варламов В.П., Ильина А.В., Шагдарова Б.Ц. и др. Хитин/хитозан и его производные: фундаментальные и прикладные аспекты // Успехи биологической химии. 2020. Т. 60.
2. Зенова Г.М. Почвенные актиномицеты редких родов. М., 2000.
3. Новикова И.И. Биологическое обоснование создания и применения полифункциональных биопрепаратов на основе микробов-антагонистов для фитосанитарной оптимизации агроэкосистем: Дис. ... д-ра. биол. наук. СПб., 2005.
4. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Белова Э.В. и др. Методические аспекты определения использования хитина почвенными микроорганизмами // Известия РАН. Сер. Биол. 2008. № 5.
5. МУК 4.2.3695-21. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы микробиологического контроля почвы. Методические указания утв. Роспотребнадзором 02.06.2021.
6. Сизенцов А.Н. Методы определения антибио-тикопродуктивности и антибиотикорезистентности: Методические указания к лабораторному практикуму. Оренбург, 2009.
7. Amann R.I., Binder B.J., Olson R.J. et al. Combination of 16S rRNA-Targeted Oligonucleotide Probes with Flow Cytometry for Analyzing Mixed Microbial Populations // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 56. https://doi. org/10.1128/aem.56.6.1919-1925
8. Andrzejewska M., Yepez-Mulia L., Tapia A. et al. Synthesis, and antiprotozoal and antibacterial activities of S-substituted 4,6-dibromo- and 4,6-dichloro-2-mercapto-benzimidazoles // Eur. J. Pharm Sci. 2004. Feb; 21(2-3):323-9. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2003.10.024
9. Bai Y., Eijsink V.G., Kielak A.M. et al. Genomic comparison of chitinolytic enzyme systems from terrestrial and aquatic bacteria // Environmental Microbiology. 2016. Vol. 18.
10. Baier F., Copp J.N., Tokuriki N. Evolution of enzyme superfamilies: comprehensive exploration of sequence-function relationships // Biochemistry. 2016. Vol. 55.
11. Berdy J. Bioactive Microbial Metabolites // J. Anti-biot. 2005. Vol. 58, № 1.
12. Chen C., Ye Y., Wang R. et al. Streptomyces nigra sp. nov. Is a Novel Actinobacterium Isolated From Mangrove Soil and Exerts a Potent Antitumor Activity in Vitro // Front
Microbiol. 2018, Jul 18; Vol. 9:1587. https://doi.org/10.3389/ fmicb.2018.01587
13. De Simeis D., Serra S. Actinomycetes: A Never-Ending Source of Bioactive Compounds — An Overview on Antibiotics Production // Antibiotics. 2021. Vol. 10, 483. https:// doi.org/10.3390/antibiotics10050483
14. Hamaki T., Suzuki M., Fudou R. et al. Isolation of novel bacteria and actinomycetes using soil-extra agar medium // Journal of bioscience and bioengineering. 2005. Vol. 99, № 5.
15. Kim К.К., Kanga J.G., Moonc S.S. et al. Isolation and Identification of Antifungal 7V-Butylbenzenesulphonamide Produced by Pseudomonas sp. AB2 // The journal of antibiotics. 2000. https://doi.org/10.7164/antibiotics.53.131
16. Kwak M.-K., Liu R., Kim M.-K. et al. Cyclic dipeptides from lactic acid bacteria inhibit the proliferation of pathogenic fungi // J. Microbiol. 2014. Vol. 52. http://dx.doi. org/10.1007/s12275-014-3520-7
17. Li H., Liu L., Zhang S. et al. Identification of antifungal compounds produced by Lactobacillus casei AST18. // Curr. Microbiol. 2012. Vol. 65. http://dx.doi.org/10.1007/ s00284-012-0135-2
18. Liang H., Zhou G., Ge Y. et al. Elucidating the inhibition of peptidoglycan biosynthesis in Staphylococcus aureus by albocycline, a macrolactone isolated from Streptomyces maizeus // Bioorg. Med. Chem. 2018, Jul 23. http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2018.05.017
19. Managamuri U., Vijayalakshmi M., Ganduri VSRK et al. Isolation, identification, optimization, and metabolite profiling of Streptomyces sparsus VSM-30 // 3 Biotech. 2017. № 7(3). https://doi.org/10.1007/s13205-017-0835-1
20. Manucharova N.A., Ksenofontova N.A., Karimov T.D. et al. Changes in the Phylogenetic Structure of the Metabolically Active Prokaryotic Soil Complex Induced by Oil Pollution // Microbiology. 2020. Vol. 89. https://doi. org/10.1134/S0026261720020083
21. Rhee K.-H. Purification and identification of an antifungal agent from Streptomyces sp. KH-614 antagonistic to rice blast fungus, Pyricularia oryzae // J. Microbiol. Biotechnol. 2003. Vol. 13.
22. Tahlan S., Kumar S., Narasimhan B.Antimicrobial potential of 1 H-benzo[d]imidazole scafold: a review // BMC Chemistry. 2019. https://doi.org/10.1186/s13065-019-0521-y
23. Kitano T.I., de Figueiredo R.I.A., Lacava P.T. The Potential Use of Actinomycetes as Microbial Inoculants and Biopesticides in Agriculture // Soil Sci. 2022. 2:833181. https://doi.org/10.3389/fsoil.2022.833181
24. Takamatsu S., Kim Y.P., Hayashi M. et al. A new inhibitor of melanogenesis, albocycline K3, produced by Streptomyces sp. OH-3984 // J. Antibiot (Tokyo). 1996. https://doi.org/10.7164/antibiotics.49.485. PMID: 8682726
25. Kim Y.J., Kim J.-H., Rho J.-Y. Antifungal Activities of Streptomyces blastmyceticus Strain 12-6 Against Plant Pathogenic Fungi // Mycobiology. 2019. Vol. 47, № 3.
Поступила в редакцию 02.11.2023 После доработки 29.11.2023 Принята к публикации 14.12.2023
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2024. Т. 79. № 1 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2024. Vol. 79. No. 1
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SPECIALISED METABOLITES OF SOIL STREPTOMYCETES-CHITINOLYTIC
G. A. Teregulova, N. A. Manucharova, N. A. Urazbakhtina, N. S. Zhemchuzhina, L. I. Yevtushenko, A. L. Stepanov
One hundred and fifty strains of streptomycetes were isolated from grey and dark grey forest soils, as well as from typical chernozem. The isolated strains were analyzed in Vitro for antimicrobial activity on nutrient media and in grey forest soil against twenty-three collection pathogenic test cultures of fungi and bacteria. Four biologically active isolates with a wide spectrum of action were identified and deposited in the All-Russian Collection of industrial microorganisms of the National Research Centre Kurchatov Institute. They were identified and deposited under the following numbers; Streptomyces xiamenensis TB BKnM Ac-2204, Streptomyces anulatus TG BKnM Ac-2203, Streptomyces sindenensis TK BKnM Ac-2205, Streptomyces flavovirens TT BKnM AC-2202. A study of the effect of pre-sowing treatment of wheat seeds by the 15-day cultural liquids of the strains S. xiamenensis TB BKnM Ac-2204, S. anulatus TG BKnM Ac-2203, S. sindenensis TK BKnM Ac-2205 on germination rates and infection with F graminearum revealed that they inhibited the growth of a pathogenic fungus. Besides, they improved seed vigour and germination of wheat. The resulting strains of soil actinomycetes can be used in biotechnology with an aim to create the new bioinoculants when dealing with phytopathogenic bacteria and fungi. The strains can also be used for stimulating the plant growth, as well as for soil bioremediation in organic farming.
Through the application of the HPLC method, specialized antimicrobial metabolites of monosporic strain suspensions were identified. The identified antibiotics are N-Butylbenzenesulfonamide, 1-(1H-Benzo[d]imidazol-2-yl) ethan-1-ol, 2-[(3S)-1-(Cyclohexylmethyl)-3-pyrrolidinyl]-1H-benzimidazole-5-carbonitrile, Cyclo(leucylprolyl), Cyclo(phenylalanyl-prolyl). The identified antiseptics are Cetrimonium and Carvone. The identified phytohormone is auxin indole-3-acetic acid (IAA). Observation of the dynamics of development of introduced actinobacteria under study in soil samples showed high activity of streptomycetes that use chitin. Analysis of the diversity of the prokary-otic complex of the studied soil samples with the application of the high-throughput sequencing of the conserved region of the 16S rRNA gene method revealed during the introduction of S. xiamenensis TB BKnM Ac-2204 that its controlling role in the microbial community is due to its antibiotic-forming activity.
Keywords: soil, streptomyces, specialized metabolites, soil, antibiotics, actinomycetes, streptomycetes, chitinolytic.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Терегулова Гюльнара Анваровна, соискатель, кафедра биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: tereguli_@mail.ru
Манучарова Наталья Александровна, докт. биол. наук, профессор кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: manucharova@mail.r
Уразбахтина Нурия Анасовна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Научно-образовательного центра ФГБОУ ВО Башкирский государственный аграрный университет, e-mail: unur1561@rambler.ru
Жемчужина Наталья Сергеевна, канд. биол. наук, зам. зав. ГКФМ, ст. науч. сотр. ФГБНУ ВНИИ фитопатологии, e-mail: zhemch@mail.ru
Евтушенко Людмила Ивановна, докт. биол. наук, зав. отделом Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН.
Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор, зав. кафедрой биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: stepanov_aleksey@mail.ru
© Teregulova G.A., Manucharova N.A., Urazbakhtina N.A., Zhemchuzhina N.S., Yevtushenko L.I., Stepanov A.L., 2024
