CC BY
33
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.64 DOI: 10.24412/1029-2551-2021-1-008
ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ШТАММ PSEUDOMONAS ASPLENII 11RW В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТА ДЛЯ СОЗДАНИЯ БИОФУНГИЦИДА
1 2С.Н. Масленникова, 1С.Д. Каракотов, д.х.н.
1Акционерное общество «Щелково Агрохим», e-mail: info@betaren.ru 2Марийский государственный университет, e-mail: maslennikova@betaren.ru
Из различных почв, ризосферы и растений выделено более 350 штаммов бактерий и проведен отбор штамма, обладающего максимальной фунгицидной активностью. Штамм был идентифицирован как Pseudomonas asplenii и депонирован в ВКПМ. Даны результаты изучения свойств Pseudomonas asplenii 11RW(ВКПМВ-13395), включающие продукцию индолил-3-уксусной кислоты и сидерофоров, фунгицидную и бактерицидную активности, а также ростостимулирующее действие на пшенице, ячмене и кукурузе в условиях in vitro. Биологическая эффективность препарата на основе изучаемого штамма подтверждена в полевом испытании, проведенном в посадках винограда сорта Мерло, против серой гнили, результаты которого были сопоставимы с действием химического фунгицида.
Ключевые слова: PGPR, псевдомонада, биофунгицид, биопрепарат, антагонизм, фунгицидная активность, ростостимулирующая активность, виноград.
A PROMISING STRAIN PSEUDOMONAS ASPLENII 11RW AS A SOURCE FOR BIOFUNGICIDE DEVELOPMENT
1 2S.N. Maslennikova, lDr.Sci. S.D. Karakotov
1 Joint-Stock Company «Schelkovo Agrohim», e-mail: info@betaren.ru 2Mari State University, e-mail: maslennikova@betaren.ru
More than 350 bacterial strains were isolatedfrom various soils, rhizosphere and plants and the most promising strain with the highest fungicidal activity was selected. The strain was identified as Pseudomonas asplenii and deposited in VKPM. The results of analysis of the properties of Pseudomonas asplenii 11RW (VKPM B-13395), including the production of IAA and siderophores, fungicidal and bactericidal activity, and in vitro growth-stimulating effect on wheat, barley and corn were shown. The biological efficacy of a biofungicide based on the studied strain was confirmed in a field research carried out against gray mold of the Merlot grapes, and the results were comparable to the action of a chemical fungicide.
Keywords: PGPR, pseudomonas, biofungicide, antagonism, fungicidal activity, growth-stimulating activity, grape.
В последние годы наблюдается тенденция к росту интереса российских потребителей к экологически чистым продуктам, что неизбежно приведет к увеличению спроса на микробиологические препараты в сельскохозяйственном производстве. Биологические средства защиты могут применяться как дополнение к химическим, снижая пестицид-ную нагрузку на окружающую среду, или как их альтернатива для использования в органическом земледелии.
Биоагентами в таких препаратах служат микроорганизмы (бактерии и грибы), ставшие предметом исследовательских проектов [1-3]. Особенно пристальное внимание исследователей обращено на бактерии рода Pseudomonas. Псевдомонады способны быстро и активно колонизировать корневую
систему растений, подавлять развитие фитопатоген-ных микроорганизмов, улучшать рост и увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур, [4]. Механизмы, с помощью которых псевдомонады оказывают положительное влияние на растения, включают синтез различных биологически активных метаболитов, в том числе антибиотики, сидеро-форы и летучие соединения [5, 6]. В условиях недостатка железа ^(Ш)) псевдомонады способны продуцировать сидерофоры - низкомолекулярные соединения, связывающие следы Fe(Ш) в почве, тем самым снижается доступность его для фитопатоге-нов [7]. Синтез биоконтрольными штаммами гидролитических ферментов, хитиназ и глюканаз, разрушающих клеточную стенку грибов, также служит одним из механизмов биоконтроля [8].
Проведено и опубликовано большое количество исследований, демонстрирующих возможности и потенциал бактерий Pseudomonas fluorescens в качестве PGPR (plant growth promoting rhizobacteria), а также их коммерческого использования для создания микробиологических препаратов [9]. Значительно меньше данных о свойствах и возможности применения в растениеводстве Pseudomonas asplenii.
Цель исследования - изучение свойств штамма Pseudomonas asplenii 11RW (ВКПМ В-13395), важных для создания биопрепарата на его основе, в лабораторных и полевых условиях.
Методы исследования
Выделение штаммов микроорганизмов. Материалом для выделения бактерий служили различные образцы почв сельскохозяйственных угодий, ризосфер-ные почвы древесных культур (ель, сосна, пальма, чай, фундук), а также сельскохозяйственных растений (пшеница, горчица), семян (ель, сосна, свекла) и вегетативных органов субтропических культур (чай, персик, мандарин, грейпфрут, фейхоа, киви).
Для изоляции ризосферных бактерий готовили почвенную суспензию и из ряда последовательных разведений проводили посев на питательные среды R2A, агар на основе гидролизата мяса ферментированного (ГМФ), Эшби, крахмало-аммиачный агар (КАА) и Гетчинсона. Вегетативные части растений асептически разрушали пестиком в ступке, готовили ряд последовательных разведений и высевали на те же питательные среды для выделения комплекса эпифитных и эндофитных микроорганизмов. Для выделения эндофитов предварительно подбирали режим поверхностной стерилизации семян с последующим их асептическим разрушением пестиком в ступке и посевом на питательные среды из ряда последовательных разведений. Через 3-5 суток инкубирования при температуре 28-30°C из посевов отбирали различные бактериальные морфотипы и отсевали их в чистую культуру.
Изучение продукции ИУК. Для изучения синтеза основного фитогормона типа ауксинов, определяющего фитостимуляцию - индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), использовали реактив Сальковского. Для выявления способности к продуцированию ИУК отобранный перспективный штамм культивировали на жидких питательных средах R2A и Йен-сена с внесением 500 мг/л L-триптофана в качестве предшественника в биосинтезе ауксинов.
Бактерии культивировали стационарно при 28°С в течение 3 суток. Затем 1 мл культуры вносили в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали 2 мин. при 14 000 об/мин. 0,5 мл супернатанта вносили в новые пробирки и добавляли 0,5 мл реактива Сальковского [10, 11]. Пробирки инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. Изменение окрашивания определяли спектрофотометрически. Калибровочную кривую строили со стандартными
растворами индолилуксусной кислоты (10, 20, 25, 30, 40 и 50 мкг/мл).
Изучение фосфатмобилизующей активности. Способность изучаемых бактерий к мобилизации неорганических соединений фосфора оценивали на среде Пиковской [12]. В качестве нерастворимого фосфата в опыте использовали Ca3(PO4)2, который в качестве единственного источника фосфора добавляли в среду в концентрации 5 г/л. В чашки Петри разливали простерилизованную среду, стерильным пробойником делали лунки, в которые вносили по 100 мкл анализируемых суспензий. Посевы инкубировали 10 суток при температуре 28°С. По появлению прозрачных зон растворения фосфатов (гало) судили о фосфатмобилизующей активности штамма.
Синтез сидерофоров. Первичный качественный анализ на продукцию сидерофоров перспективным штаммом проводили с использованием общепринятого теста на CAS-агаре [13] - агаризованной среде, содержащей комплекс Fe3+, гексадецилтриметилам-мониум бромид (HDTMA) и краситель хромазурол S (CAS-реактив), исходная окраска которого меняется на красную, желтую или оранжевую при связывании хелатирующими агентами ионов Fe3+ в его составе. Для этого на поверхность CAS-агара высевали 5 мкл ночной бактериальной культуры. Посевы инкубировали 1 сутки при 28°C. О наличии сидерофорной активности судили по появлению красной, желтой или оранжевой окраски вокруг бактериальной колонии.
Для количественного определения сидерофоров [14] использовали жидкую сукцинатную среду (SM), на которой выращивали изучаемый штамм при температуре 30°C и перемешивании 220 об/мин в течение 24 ч. После периода инкубации культуральную жидкость центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин. Бесклеточный супернатант смешивали с реактивом CAS в соотношении 1:1 и измеряли оптическую плотность при длине волны 630 нм (Ао). Контролем служила исходная питательная среда SM, смешанная с реактивом CAS (Ак). Содержание сидерофоров определяли по следующей формуле:
А — А
% единицы = Ак-Ао х 100 (1)
Ак
Анализ фунгицидной активности. Фунгицидную активность проверяли на штаммах фитопатогенных грибов различной таксономической принадлежности из коллекции АО «Щелково Агрохим». Предварительно разливали по чашкам Петри 20 мл стерильного картофельно-сахарозного агара (КСА). Для анализа готовили суспензию спор и мицелия гриба. Для этого 1/8 часть агара, засеянного грибом, переносили в стерильную чашку Петри, добавляли 10 мл стерильной воды и смывали конидии и мицелий стерильным шпателем. После чего добавляли 20 мкл полученной суспензии в 4,98 мл остуженной до 45°С среды КСА (1,2% по агару), тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. Через 1 час в
агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл анализируемых суспензий. Посевы культивировали 4-10 суток при температуре 20°C, после чего регистрировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогенов.
Анализ бактерицидной активности. Бактерицидную активность проверяли на штаммах фитопа-тогенных бактерий из коллекции патогенных микроорганизмов АО «Щелково Агрохим». Предварительно разливали по чашкам Петри 20 мл карто-фельно-сахарозного агара. Для анализа готовили суспензию фитопатогенов (культивирование на жидком ГМФ-бульоне в шейкере-инкубаторе при постоянном перемешивании 220 об/мин и температуре 30°C в течение 24 ч). После чего добавляли 1 мл полученной суспензии в 4 мл остуженной до 45°С среды 1,2% КСА, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. После застывания в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл анализируемых суспензий. Посевы культивировали 1 сутки при температуре 30°C, после чего регистрировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогена.
Ростостимулирующая активность. Семена пшеницы сорта Дарья, ячменя сорта Таловский, кукурузы гибрида Симпатия обрабатывали рабочим раствором суспензии исследуемого штамма и высевали в вегетационные сосуды, заполненные торфо-грунтом. Повторность трехкратная. В контрольном варианте семена обрабатывали дистиллированной водой. Растения выращивали 36-41 суток при температуре 23-24°C и 16/8-часовом периоде освещения. На 7-е сутки фиксировали всхожесть, а по окончании опыта - высоту растений, длину корневой системы, абсолютно сухую биомассу. Средние значения и стандартные ошибки по вариантам опыта вычисляли в программе Excel.
Изучение эффективности препарата в полевых условиях. Для анализа готовили жидкую суспензию бактерии P. asplenii 11RW. Штамм культивировали в ферментере Biostat A (Sartorius, Германия) с рабочим объемом 1 л на питательной среде, содержащей мелассу и неорганические соли, в течение 8-14 ч до достижения титра жизнеспособных клеток не менее 109 КОЕ/мл.
Для полевого испытания препарата на основе штамма P. asplenii 11RW в качестве опытного участка был выбран виноградник сорта Мерло 2014 г. посадки площадью 4 га (Крым). Для контроля гнилей была проведена двукратная обработка биопрепаратом в фазах размягчения и полной зрелости ягод, расход препарата составлял 1 л/га. Вариант с двукратным применением сравнивали с эталоном (система хозяйства) и специализированным для винограда химическим фунгицидом. Размещение по-вторностей опыта на участках - методом удлиненных делянок в четырехкратной повторности.
Развитие гнилей на модельных кустах каждой опытной делянки учитывали согласно «Методическим указаниям по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве» [15].
Процент развития заболевания рассчитывали по следующей формуле:
Я=Ш!2.100,
(2)
где: R - развитие заболевания, %; X(ab) - сумма произведений числа пораженных растений, органов (а) на соответствующий балл поражения (b); N - общее число просмотренных гроздей; К - высший балл шкалы учета.
Результаты исследования.
Отбор перспективного штамма. Из различных природных источников было выделено более 350 бактериальных штаммов. Первоначально полученные культуры охарактеризовали по антагонистической активности против 3 штаммов фитопатогенных грибов (Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichiodes и Fusarium culmorum) и 3 штаммов фитопатогенных бактерий (Pectobacterium carotovorum, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis и Pseudomonas sy-ringae). По результатам первичного скрининга было показано, что 54,1% выделенных бактериальных штаммов, ассоциированных с растениями, способны подавлять развитие одного или нескольких фитопато-генов.
Отобранные культуры с антагонистической активностью были дополнительно подвергнуты анализу фунгицидных свойств на более широком круге патогенов (10 штаммов грибов р. Fusarium, Alternaria, Bipolaris, Phytophthora). Только одна из отобранных бактерий (ризосферный штамм 11RW, выделенный из почвы с корней озимой пшеницы, Краснодарский край) была способна в значительной степени ингибировать все используемые тест-объекты и была включена в дальнейшую работу.
По результатам анализа сиквенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, а также биохимическим тестам, тестируемый штамм был отнесен к виду Pseudomonas asplenii. Культура была депонирована во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов по процедуре национального патентного депонирования под регистрационным номером В-13395.
Синтез ИУК. Культуральная жидкость отобранного штамма P. asplenii 11RW (ВКПМ В-13395), выращенная на жидких питательных средах с добавлением 500 мг/л L-триптофана, окрашивалась реактивом в розовый цвет, что свидетельствовало о способности штамма синтезировать индольные соединения. Концентрация ИУК в культуральной жидкости при этом составила 31,8 мкг/мл.
Фосфатмобилизующая активность. Одним из главных механизмов солюбилизации фосфора служит продукция бактериями низкомолекулярных органических кислот, синтез которых определяют по
повышению кислотности питательной среды [1618]. Наиболее высокой фосфатмобилизующей активностью обладают грамотрицательные бактерии, что обусловлено внеклеточным окислением ими глюкозы до глюконовой кислоты [19]. Выявлено, что штамм P. asplenii 11RW (ВКПМ В-13395) способен мобилизовать труднорастворимые и недоступные для растений фосфаты кальция. Размер гало (зона растворения) на среде Пиковской к 10-м суткам культивирования составил 18 мм.
Синтез сидерофоров. В первичном качественном анализе было показано, что рост штамма P. Asplenii 11RW на CAS-агаре сопровождался изменением цвета индикатора на желтый, что указывало на образование сидерофоров. Для количественного определения сидерофоров в культуральной жидкости штамм выращивали на жидкой среде SM без источников железа. При смешивании бесклеточной культуральной жидкости с равным объемом реактива CAS наблюдалось изменение окраски реактива синего цвета на желто-оранжевый, что свидетельствовало о положительной продукции сидерофоров. Изменение окраски измеряли спектрофотометрически и определяли количество продуцируемых сидерофоров в культураль-ной жидкости, которое составило 92,3% сидерофор-ных единиц.
Антагонистическая активность. На этапе отбора перспективных штаммов уже была показана высокая фунгицидная активность культуры P. asple-nii 11RW против 10 возбудителей. Размер зон, свободных от роста фитопатогенов, варьировал от 35 до 70 мм (рисунок). Был проведен дополнительный опыт по изучению антагонистической активности на 70 штаммах грибов различных родов (Alternaria, As-pergillus, Bipolaris, Fusarium, Cercospora, Colletotrichum, Macrophomina, Monilia, Phytophthora,
Pyricularia, Verticillium и др.) из коллекции патогенных микроорганизмов АО «Щелково Агрохим». Обнаружено, что штамм способен эффективно ингиби-ровать 68 фитопатогенных грибов из 70 изученных (97,1%), демонстрируя широкий спектр его фунги-цидного действия. Дополнительно была изучена бактерицидная активность культуры P. asplenii 11RW. Использовали 10 фитопатогенных бактерий родов Pseudomonas, Clavibacter, Pectobacteriumи Xanthomonas. Установлено, что штамм 11RW, обладающий высокой фунгицидной активностью, обладает также и бактерицидным действием: так, было обнаружено подавление роста 5 фитопатогенных бактерий из 10 изученных штаммов.
Ростостимулирующая активность. Ростости-мулирующее действие P. asplenii 11RW было показано в условиях микровегетационного эксперимента на растениях пшеницы, ячменя и кукурузы. Обработка семян бактериальной суспензией с титром 109 КОЕ/мл с расходом препарата 1 л/т оказало положительное влияние на всхожесть, рост и развитие растений, обеспечив прибавку роста и биомассы. Так, в варианте обработки семян кукурузы гибрида Симпатия штаммом 11RW средняя высота растений превышала контрольные значения в среднем на 11,5%, а общая сухая биомасса увеличилась на 50,7%.
Применение биопрепарата для защиты винограда. Разработанный препарат на основе перспективного штамма P. asplenii 11RW был испытан в полевых условиях для защиты винограда. Через 12 дней после первой обработки биопрепаратом на основе P. asplenii 11RW на опытном варианте поражения гроздей винограда серой гнилью не наблюдалось. Учет, проведенный через 5 дней после второй обработки, показал, что развитие заболевания не превышало 0,3% и соответствовало по уровню варианту с
Результаты анализа фунгицидной активности штамма Р. asplenii 11RW против некоторых фитопатогенных грибов
Результаты микровегетационных опытов
Вариант Всхожесть, % Средняя длина побегов, см Средняя длина корней, см Сухая биомасса, г/раст
Пшеница сорта Дарья (36 суток)
Контроль 93 39,4±1,1 17,2±0,5 0,22
P. asplenii 11RW 95 41,0±1,5 16,9±0,9 0,24
Ячмень сорта Таловский (36 суток)
Контроль 75 31,6±1,3 18,6±0,9 0,17
P. asplenii 11RW 83 38,3±1,0 18,9±0,8 0,22
Кукуруза гибрида Симпатия (41 сутки)
Контроль 60 55,6±4,6 27,3±3,8 0,75
P. asplenii 11RW 67 62,0±3,1 28,1±2,1 1,13
однократным применением специализированного фунгицида на основе ципродинила и в 2 раза ниже, чем в эталонном варианте.
В вариантах с биофунгицидом и химическим фунгицидом получен хороший кондиционный урожай винограда, который находился на одном уровне и составлял 2,6 и 2,9 кг/куст соответственно. Содержание сахаров в соке ягод винограда в варианте применения биопрепарата в момент уборки составило 25,3 г/100 см3, тогда как в эталонном варианте - 24,9 г/100 см3.
Таким образом, выделен перспективный штамм Pseudomonas asplenii 11RW (ВКПМ В-13395), характеризующийся комплексом хозяйственно-ценных свойств, позволяющих отнести его к группе PGPR-бактерий. В частности, в условиях in vitro была показана его высокая антагонистическая активность против широкого спектра фитопатогенных грибов сельскохозяйственных культур. Эффективность биофунгицидного препарата на основе изучаемой бактерии была также подтверждена в агроклиматических условиях юго-западной зоны виноградарства Крыма на участке ценного технического сорта винограда Мерло в защите культуры от серой гнили, где были получены высокие значения биологической эффективности, сопоставимые со значениями биологической эффективности специализированного химического фунгицида.
Литература
1. Samavat S., Ahmadzadeh M., Behboudi K., Besharati H. Comparison of Rhizobium and Pseudomonas isolates in control of bean damping-off caused by Rhizoctonia solani Kuhn // Science and Research, Biological Journal of Islamic Azad, Garmsar Branch, 2008, Vol. 3, № 3. - P. 1-12.
2. Samavat S., Samavat S., Besharati H., Behboudi K. Interactions of rhizobia cultural filtrates with Pseudomonas fluo-rescens on bean damping-off control // Journal of Agricultural Science and Technology, 2011, Vol. 13, № 6. - P. 965-976.
3. Heydari A., Naraghi L. Biological Control of Verticillium Wilt Disease: Concept, Methods and Mechanisms. - Saarbrucken: Lambert Academic Publishing, 2012. - 120 p.
4. Weller D.M. Biological control of soil-born plant pathogens in the rhizosphere with bacteria // Annual Review of Phytopathology, 1998, Vol. 26. - P. 379-407.
5. Gupta G., Parihar S.S., Ahirwar N.K. et al. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Current and Future Prospects for Development of Sustainable Agriculture // Journal of Microbial & Biochemical Technology, 2015, Vol. 7. - P. 96-102.
6. Ryu C.M., Farag M.A., Hu C.H. et al. Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2003, Vol. 100, № 8. - P. 4927-4932.
7. Grobelak A., Hiller J. Bacterial siderophores promote plant growth: Screening of catechol and hydroxamate siderophores // International Journal of Phytoremediation, 2017, Vol. 19, № 9. -P. 825-833.
8. Chernin L., Ismailov Z., Haran S., Chet I. Chitinolytic En-terobacter agglomerans Antagonistic to Fungal Plant Pathogens // Applied Environmental Microbiology, 1995, Vol. 61, № 5. -P. 1720-1726.
9. Mercado-Blanco J. Pseudomonas strains that exert biocon-trol of plant pathogens. - Dordrecht: Springer, 2015. - P. 121172. - (Pseudomonas: Volume 7: New Aspects of Pseudomonas Biology; Chapter 6).
10. Salkowski E. Ueber das Verhalten der Skatolcarbonsau-reim Organismus // Biological Chemistry, 1885, № 9. - P. 23-33.
11. Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of in-doleacetic acid // Plant Physiology, 1951, № 26. - P. 192-195.
12. Paul D., Sinha S.N. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacterium Pseudomonas aeruginosa KUPSB12 with antibacterial potential from river Ganga, India // Annals of Agrarian Science, 2017, Vol. 15, № 1. - 130-136.
13. Arora N.K., Verma M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria // 3 Biotech, 2017, Vol. 7, № 6. - P. 381.
14. Sayyed R., Badgujar M., Sonawane H. et al. Production of microbial iron chelators (siderophores) by fluorescent Pseudo-monads // Indian Journal of Biotechnology, 2005, Vol. 4, № 4. -P. 484-490.
15. Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве / под ред. В.И. Дол-женко. - СПб.: ВИЗР, 2009. - 378 с.
16. Gyaneshwar P., Parekh L.J., Archana G. et al. Involvement of a phosphate starvation inducible glucose dehydrogenase in soil phosphate solubilization by Enterobacter asburiae // FEMS Microbiology Letters, 1999, Vol. 171, № 2. - P. 223-229.
17. Puente M.E., Bashan Y., Li C.Y., Lebsky V.K. Microbial populations and activities in the rhizosphere of rock-weathering desert plants. Root colonisation and weathering of igneous rocks // Plant Biology, 2004, Vol. 6. - P. 629-642.
18. Khan M.S., Zaidi A., Mussarrat J. Phosphate Solubilizing Microorganisms. - New Delhi: Springer International Publishing, 2014. - P. 34-35.
19. Hilda R., Gonzalez T., Selman G. Expression of a mineral phosphate solubilizing gene from Erwinia herbicola in two rhi-zobacterial strains // Journal of Biotechnology, 2000, Vol. 84. -P. 155-161.
